全 文 ：第 29卷　第 5期 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报 Vol. 29　 No. 5
　 2009年 10月 Journal o f Central South Univ er sity o f Fo rest ry& Techno log y Oct. 2009　
文章编号: 1673- 923X ( 2009) 05- 0128- 03
邓恩桉试管苗细菌污染的防治分析
陈　灵 ,饶红欣 ,彭信海
(湖南省森林植物园 ,湖南长沙 410116)
摘　要: 　采用常规医用抗生素防治大多数细菌感染的方法 ,针对邓恩桉组织培养过程中试管苗的细菌污染问题 ,分别用注射器在
分化培养基和生根培养基中加入不同浓度的不同抗生素 .结果表明:培养基附加氨苄西林钠 100 mg /L,对当代污染菌的抑菌率为
100% ,效果最好 ,同时相对在增殖系数、苗高、生长势方面都表现最好 ,并对邓恩桉试管苗的生根有明显的促进作用 ,可消除根的黄化
现象 .硫酸链霉素抗菌效果次之但对试管苗产生毒害 ,庆大霉素效果抗菌不佳 .
关键词: 　微生物学 ;邓恩桉 ;组织培养 ;细菌污染 ;抗生素
中图分类号: 　 S718. 8　　　　　文献标志码:　 A
Control of Bacterial Contaminants in Tissue Cultures of Eucalyptus dunnii
CHEN Ling , RAO Hong-xin, PEN G Xin-hai
( Hunan Fores t Arboretum, Ch angsha 410116, Hunan, China)
Abstract: An tibio tics w ere applied to cont rol bacteria in the t rail. In order to solve th e p rob lem of contamination d uring the process of
ti ssu e culture of E. dunn ii , dif f erent concent rations of di f ferent an tibiotics w ere added to subpassg e m edium and rooting medium
separately. The resul ts show ed that medium adding w i th ampicil lin sodium 100 mg /L was mos t ef fectiv e: th e inhibi tion rate of
bacteria contamination for the contem po rary gen eration w as 100% ; and at th e same time proli feration coeff icien t, h eigh t and g row th
potent ial of th e in vi t ro seedlings w ere performed the bes t; in addi tional, th e rooting of in vi t ro s eedlings w ere accelerated and
et iolation ph enom ena of th e roots w as eliminated. The antibacterial abi lit y of st reptom ycin sul fate w as th e second bes t bu t
st reptom ycin sul fate wi ll poison the in vit ro s eedlings , and the antibacterial abi lit y of gen tamicin w as underperformed.
Key words: microbiology; Eucalyptus d unnii ; ti ss ue cul ture; bacteria contamination; antibiotics
邓恩桉是最适合中亚热带地区种植的桉树种之一 ,但邓恩桉自然分布有限 ,产量不多 ,目前我国种子依靠
从澳大利亚进口 ,种子价格昂贵 ,很难买到 ,因此利用组培的方法加快邓恩桉种苗的生产 ,对扩大邓恩桉的栽培
利用具有重大意义 .本实验室已在邓恩桉组培快繁方面取得成功 ,这在国内外还没有先例 ,但在继代培养和生
根培养中常会出现细菌污染 ,严重时培养基表面出现黄色水渗样 ,污染后的组培苗生长缓慢 ,既不增殖也不生
根 ,甚至死亡 .
细菌污染一般是由两方面的原因造成 ,一是组织培养过程中操作不当引起 ,二是材料内部所带的菌 (内生
菌 )引起污染 ,这种污染不能被一般的消毒方法清除 [1 ] .本实验以常规医用抗生素对污染材料进行处理 ,同时观
察培养基中加入抗生素后对细菌污染、分化和生根的影响 ,取得明显效果 ,可为今后工厂化组培育苗生产解决
细菌污染问题提供途径 ,从而提高出苗率 ,降低育苗成本 .植物的种类不同、植物所含内生菌种类的不同以及抗
生素使用的种类和浓度 ,导致抗生素使用的效果变化很大 [2 ] .本试验主要是研究抗生素对邓恩桉组培试管苗细
收稿日期: 2009-04-02
基金项目: 国家林业成果转化基金项目 ( 2006GB2D100213) .
作者简介: 陈　灵 ( 1973- ) ,女 ,湖南长沙人 .实验师 ,主要从事林木遗传育种研究 .
DOI : 10. 14067 /j . cnki . 1673 -923x . 2009. 05. 015
菌污染的防治作用 ,以及对组培试管苗生长和生根状况的影响 .
1　材料与方法
1. 1　材料
以培养基表面出现黄色水渍样细菌污染的邓恩桉试管苗为试验对象 .药品为医用注射用粉状氨苄西林钠、
硫酸链霉素、庆大霉素 .
1. 2　药品配制方法
为避免高压灭菌对抗生素的破坏分解 ,加之抗生素的药用有效时限 ,采用灭菌冷却之后注射药粉的方法 .
( 1)将不同溶积无菌水装入三角瓶 ,封口和注射器一起在 121℃、 0. 12 M Pa /cm2的条件下灭菌 30 min冷
却后待用 .
( 2)抗生素无菌水溶液的配制:将抗生素小瓶封口 70%的酒精消毒后 ,用消毒后的注射器注入无菌水 ,摇
匀后用注射器抽出 ,再注入无菌水中配成不同浓度的抗生素溶液 ,马上待用 .
1. 3　处理方法
( 1)将抗生素溶液直接添加到邓恩桉培养基中 ,对照不添加抗生素 .
( 2)用注射器往邓恩桉的继代和生根培养基中 ,注射不同浓度的不同抗生素无菌水溶液 , 1 m L /每瓶 .每瓶
转移已污染的邓恩按试管苗 1 cm的茎段 10个 ,每个茎段尽量只留一个芽 .同时做对照不添加抗生素 .每组试验
作 10瓶重复 .
( 3)每天照光 14 h,光照强度 1 500～ 2 000 lx ,在培养室温度为 ( 24± 2)℃的条件下培养 ,每周观察一次 ,记
录相关苗高、芽数、长根数、根长、试管苗的生长势 (分四级: + + + :生长正常 ,叶绿 ,目测不到伤害症状 ; + + :
叶片轻微失绿 ,呈黄绿色 ;+ :叶片发黄 ,叶缘叶尖变枯 ; - :叶片退绿 ,叶缘、叶尖变枯 ) ,培养基的污染程度按每
瓶污染的面积占培养基面积的百分比分计算 [ 3] .
2　结果与分析
2. 1　不同浓度的不同抗生素对邓恩桉试管苗生长及污染的影响
继代培养 4周后 ,观察结果如表 1显示:添加低浓度的抗生素抑菌效果 ,氨苄四林钠最佳 ,硫酸链霉素次之 ,
庆大霉素效果不佳 .培养基附加氨苄西林钠 100 mg /L ,对当代污染菌的抑菌率为 100% ,效果最好 .次代培养如
不添加抗生素 ,在部分材料上已被抑制的细菌又会再生长起来 ,这是因为抗生素只能抑制细菌生长 .实验表明 ,
连续注入抗生素 7代后 ,细菌已完全失去繁殖力 ,再移入无抗生素的培养基中 ,污染率已为零 .不同浓度氨苄西
林钠对试管苗不定芽的分化率和抑菌的影响不显著 , 100 mg /L氨苄西林钠相对在增殖系数、苗高、生长势方面
都要好一些 ,污染率为 0,增殖系数 4. 04,苗高 2. 2,生长势+ + + . 100～ 200 mg /L的硫酸链霉素对污染菌有明
显的抑菌效应 ,但对试管苗则有毒害现象 ,叶片、叶缘、茎都出现黄化现象 ,对不定芽分化也有明显的抑制作用 .
庆大霉素也对试管苗产生毒害 ,增值系数不高 ,且抑菌效果不是很好 .
表 1　不同浓度的不同抗生素对邓恩桉试管苗生长及污染的影响
Table 1　 Ef fects of dif ferent concentrat ions of antibiotics onE . dunn ii growth of test-tube plantlet
抗生素 抗生素浓度
/( mg· L- 1 )
接种苗总数
/株
分化苗数
/株 增殖系数
接种时平均苗高
/cm
观察时平均苗高
/ cm
生长势 污染率
/%
氨苄西林钠 100 103 416 4. 04 1 2. 2 + + + 0
200 135 512 3. 79 1 1. 5 + + 0
硫酸链霉素 100 108 0 0 1 0 - 0
200 121 0 0 1 0 - 0
庆大霉素 100 105 176 1. 67 1 1. 7 + 48
200 110 154 1. 4 1. 5 1. 6 - 45
对照 无 102 280 2. 75 1. 5 1. 57 - 95
129第 5期 陈　灵等:邓恩桉试管苗细菌污染的防治分析
2. 2　不同浓度的不同抗生素对邓恩桉试管苗生根及污染的影响
邓恩桉生根培养基的观察是在转移种后一周进行的 ,因为一周后无污染菌的邓恩桉试管苗应已基本生根 .
观察结果如表二显示: 染菌的试管苗很难生根 ,即使能生根 ,根褐化现象明显 .添加抗生素后 ,氨苄西林钠抑菌
效果最佳 ,硫酸链霉素次之 ,庆大霉素效果不是很佳 .氨苄西林钠则不但抑菌效果好 ,而且对邓恩桉试管苗的生
根有明显的促进作用 ,并可消除根的黄化现象 .不同浓度的氨苄西林钠对邓恩桉试管苗生根和抑菌的影响不显
著 , 100 mg /L氨苄西林钠相对在生根率 ( 121% )、每株平均根长 ( 0. 5 cm) ,生长势 (+ + + ) ,污染率 ( - )最好 .
100～ 200 mg /L硫酸链霉素对污染菌有明显的抑菌效应 ,但硫酸链霉素和庆大霉素对邓恩桉试管苗生根都有
明显的抑制作用 ,对试管苗也有显著毒害效应 ,表现为试管苗切口出现明显褐化 ,叶片和茎段黄化 ,甚至死亡 .
表 2　不同浓度的不同抗生素对邓恩桉试管苗生根及污染的影响
Table 2　 Ef fects of diff erent concentrations of antibiotics on E . dunn ii root formation of test-tube plantlet
抗生素类别抗生素浓度 / ( mg· L- 1 ) 接种苗总数 /株 观察时生根数 生根率 /% 每株平均根长 /cm 生长势 污染率 /%
氨苄西林钠 100 100 100 100 0. 5 + + + 0
200 102 98 96 0. 3 + + 0
硫酸链霉素 100 100 0 0 0 - 0
200 100 0 0 0 - 0
庆大霉素 100 109 3 0. 03 0. 05 - 47
200 100 9 0. 09 0. 05 - 43
对照 无 104 2 0. 02 0. 03 - 97
3　结论与讨论
试验证明邓恩桉组培试管苗培养基附加氨苄西林钠 100 mg /L,对当代污染菌的抑菌率为 100% ,效果最
好 ,同时相对在增殖系数、苗高、生长势方面都表现最好 ,并对邓恩桉试管苗的生根有明显的促进作用 ,可消除
根的黄化现象 .硫酸链霉素抗菌效果次之但对试管苗产生毒害 ,庆大霉素效果抗菌不佳 .邓恩桉组织培养中污
染的控制取决于灭菌技术、灭菌设备、外植体年龄和环境条件等许多方面 ,尽管在组培过程中使无菌条件更加
完善 ,但污染还是经常发生 .这由于木本植物具有较大的导管 ,材料内部易感染病菌 ,常规的灭菌方法 ,不易杀
死内生菌 ,极易导致污染 [ 3] .解决或减少邓恩桉组培中的内生细菌污染关键在于防止 ,主要措施有: ( 1)对母株
的处理 ,包括改善栽培的环境、对母株的消毒或预处理 . ( 2)接种时改进灭菌方法 . ( 3)严格控制各个无菌环节和
传播途经 . ( 4)抗生素在培养基中的使用 .抗生素类药物能防止和消除邓恩桉组培中细菌污染 ,但抗生素一般不
稳定 ,遇酸碱或高温易分解而失去活性 [4 ] ,同时也要注意浓度 ,浓度低了效果差而浓度高又对邓恩桉组培试管
苗产生毒害 ,所以本试验采取无菌水灭菌消毒后 ,抗生素直接注射溶解到无菌水中使用 ,保持了抗生素的药效 ,
对材料的刺激时间短 ,副作用小 ,操作简单 ,成本少 ,灭菌效果显著 ,并且邓恩桉试管苗生长势良好 ,对增殖和生
根都有很好的促进作用 ,这样减少组培的工作量 ,降低成本 ,提高了经济效益 .此外 ,考虑到细菌污染种类的多
样性和细菌产生的耐药性 [4 ] ,利用同不杀菌剂和抗生素混合使用来控制材料污染还有待进一步研究探讨 .
参考文献:
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[本文编校:吴　毅 ]
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