全 文 ：118
李晓雁，黄海东，甄润英，牛国君
(天津农学院食品科学学院，天津 300384)
摘 要:从苦荞中分离得到 2 株内生菌 N3 和 XJ01，通过形态观察、生理生化实验和 16S rDNA系统进化分析，鉴定这 2
株苦荞内生菌属于肠杆菌科泛菌属。用内生菌及其多糖类提取物对萌发苦荞进行处理，结果表明，N3 和 XJ01 提取物
能诱导苦荞样品中苯丙氨酸氨解酶的活性升高，进而促进萌发苦荞的黄酮合成。内生菌提取物的最佳使用浓度均为
50mg /L，经 N3 提取物处理的苦荞黄酮含量最高，达到 4.59%，比对照提高 15.3%。
关键词:苦荞，黄酮，内生菌，苯丙氨酸氨解酶
Identification of endophyte from tartary buckwheat and
its influence on synthesis of flavonoids
LI Xiao－yan，HUANG Hai－dong，ZHEN Run－ying，NIU Guo－jun
(Department of Food Science，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384，China)
Abstract:Strains N3 and XJ01 were isolated from tartary buckwheat. According to the characteristics of
morphology，physiology and biochemistry tests and the comparison of 16S rDNA sequence.Strains N3 and XJ01
were identified as Pantoea sp.. Endophyte and its extract were used to induce germinating tartary buckwheat
product flavonoids.The results showed that the activity of phenylalanine ammonialyase increased by the treatment
of extract N3 and XJ01.The production of flavonoids was stimulated during germination.The optimal concentration
of extract N3 and XJ01 was 50mg /L.After treated by N3 extract，the content of flavonoids reached 4.59%，and the
content was 15.3% higer than that in CK.
Key words:tartary buckwheat;flavonoids;endophyte;phenylalanine ammonialyase
中图分类号:TS201.3 文献标识码:A 文 章 编 号:1002－0306(2010)08－0118－03
收稿日期:2009－09－10
作者简介:李晓雁(1971 －) ，女，实验师，主要从事食品分析的研究
工作。
基金项目:天津农学院科学研究发展基金项目(2006015)。
黄酮类化合物是苦荞籽粒中的药用生物活性成
分，它是一种次生代谢产物，可以通过改变植物生长
环境中的某些条件调控其合成量［1］。植物在受到外
界因子如微生物或化学、物理因素的刺激时，自身会
发生防御反应，从而造成次生代谢物合成量的变
化［2］，启动这些防御机制的诱导剂可分为非生物性和
生物性两种，非生物性诱导剂有紫外照射、金属离子
等，生物性诱导剂包括微生物菌体细胞及其提取液
等。植物内生菌是指生活在健康植物组织中，而不
引起植物组织明显病变的微生物，这些内生菌的代
谢行为会影响宿主植物的生长和次生代谢物的合
成［3］。本文对苦荞内生菌进行了分离鉴定，并研究了
内生菌对苦荞萌发过程中黄酮合成的影响，为提高
苦荞黄酮的合成量提供了一种新方法。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
榆 6－21 苦荞 由山西省寿阳荞麦协会提供。
Biofuge 高速冷冻离 心 机 Heraeus 公 司;
Tgradient型 PCR 仪 Biometra 公司;DYY－6B 型电
泳仪、WD－9403F型紫外分析仪 北京六一仪器厂;
LRH－150B生化培养箱 广东医疗器械厂;RE－52A
旋转蒸发仪 上海亚荣公司;HYG－ III 回旋式摇床
上海新蕊公司;HH－Z4 恒温水浴 郑州长城科工
贸公司;752 型紫外光栅分光光度计 上海精密科学
仪器公司。
1.2 实验方法
1.2.1 苦荞内生菌的分离 取苦荞种子和萌发苦荞
的一段幼茎，用自来水洗净，无菌水冲洗 2 次，用无
菌滤纸吸干水分;在 75%乙醇溶液中浸泡 1min，滤纸
吸干后，在 0.2%的升汞溶液中浸泡 1min，无菌水冲
洗 5 次，滤纸吸干。在无菌条件下用刀片将样品剖
开，将截面置于 PDA培养基平板内，30℃培养 4～8d。
待平板有菌长出后，平板划线纯化，直至得到单菌
DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2010.08.079
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落，斜面保存备用。
1.2.2 内生菌的形态特征及生理生化鉴定 在光学
显微镜下观察细胞个体形态，并测定菌体大小。细
菌的革兰氏染色、芽孢染色、运动性观察、甲基红
(M.R)、V－P 测定、葡萄糖发酵、氧化酶、接触酶、脲
酶、吲哚等实验参考文献［4］进行。
1.2.3 16S rDNA PCR扩增和序列测定 在 LB 培养
基中接种内生菌，摇床培养 24h，取 5mL 菌液离心，
得到的菌体用 0.5mol /L NaCl 洗 1 次，用 1mg /mL 溶
菌酶溶液悬浮菌体，37℃作用 30min，用上海生工生
物工程有限公司 UNIQ－10 试剂盒提取细菌基因组
DNA。以基因组 DNA 为模板，用细菌 16S rDNA 通
用引物 27F(5 － GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG －3)
和 1541R(5 － AAGGAGGTGATCCAGCCGCA －3)扩
增得到目的基因片断，经琼脂糖凝胶电泳纯化后与
pGEM－T easy 载体(Promega 公司)连接，转化 E.coli
DH5a，用 X－gal平板筛选含有插入 DNA片断的白色
转化子，经限制性内切酶酶切鉴定后送北京三博公
司测序。将得到的 16S rDNA 序列与 GenBank 中的
核酸数据进行 BLAST 比对，搜索得到与其同源性最
高的相关序列，采用软件 ClustalX1.8 对所获得的核
苷酸序列进行分析，得到序列之间的相似值;用软件
MEGA2.0 计算出序列的系统进化距离［5］，采用邻位
相连法构建系统进化树。
1.2.4 内生菌诱导剂的制备 将分离得到的内生菌
接种于 LB 液体培养基中，置于旋转式摇床上，
180r /min、30℃培养 2d，10000r /min 离心 20min 后，
收集上清液，加入 2 倍体积的乙醇沉淀多糖，去离子
水冲洗后置于 80℃烘箱中干燥，用水溶解至一定浓
度备用。
1.2.5 内生菌诱导剂多糖含量测定 蒽酮比色法测
定内生菌诱导剂的多糖含量。
1.2.6 苦荞总黄酮提取与测定 以甲醇为提取液，
采用索氏提取法提取不同处理苦荞样品中的总黄
酮;以芦丁为标准品，三氯化铝比色法测定总黄酮
含量［6］。
1.2.7 内生菌诱导剂的效果 挑选颗粒饱满的苦荞
种子分别置于蒸馏水、内生菌发酵液以及 100mg /L
糖浓度的不同内生菌诱导剂溶液中浸泡 24h，将浸泡
后的种子置于铺有湿润滤纸(用水、内生菌发酵液和
相应的诱导剂溶液润湿)的培养皿内，室温下萌发，
每个不同处理设 3 个重复，7d后收获苦荞幼苗，测定
样品的总黄酮含量。以多糖含量为指标，调整内生
菌诱导剂溶液浓度为 10、50、100、200、400mg /L，处理
苦荞样品，测定样品的总黄酮含量。
1.2.8 苯丙氨酸氨解酶的提取与活性测定 根据苯
丙氨酸氨解酶(phenylalanine ammonialyase，PAL)和
杂蛋白在高浓度盐溶液中的电荷和溶解度的不同，
进行分级沉淀初步分离提取 PAL。利用离心盐析法
提取苦荞样品中的苯丙氨酸氨解酶，以紫外分光光
度法测定 PAL 的酶活性［7］，以每小时在 290nm 处
0.01OD变化为一个酶活性单位。
2 结果与分析
2.1 苦荞内生菌的分离和分类鉴定
2.1.1 菌体特征及菌落特征 从苦荞种子和萌发的
苦荞样品中分别得到 2 株内生菌，XJ01 和 N3。2 种
内生菌在 PDA 培养基中生长缓慢，在 LB 培养基平
板中生长较迅速，30℃培养 4d，菌株 N3 形成的菌落
直径 3～4mm，圆形且边缘整齐、凸起，黄色、质地粘稠
(图 1) ;N3 菌体细胞形态为直杆状，大小 0.3～ 0.8μm
×0.9～1.5μm，革兰氏阴性，无芽孢、有鞭毛，胞内有
异染粒。相同条件下，菌株 XJ01 形成的菌落直径
3～5mm，近似圆形，明显隆起，边缘褶皱无规则，淡黄
色，培养初期菌落干燥，随培养时间的延长菌落粘
稠;XJ01 菌体细胞为杆状，大小 0.5 ～ 1.0μm × 1.0 ～
2.0μm，革兰氏阴性，无芽孢、有鞭毛，胞内有异染粒
和类脂颗粒。
图 1 内生菌的菌落形态特征
2.1.2 生理生化特性 菌株 N3 和 XJ01 均为兼性厌
氧菌，N3 的生长温度范围为 8～40℃，XJ01 的生长温
度范围为 4～40℃，2 种内生菌的 pH 生长范围均为
5.0～8.5，其他生理生化指标的实验结果如表 1 所示，
在明胶液化和精氨酸双水解酶的结果上 N3 和 XJ01
有差别。2 种内生菌均可以利用以下碳源:葡萄糖、
蔗糖、果糖、麦芽糖、甘露糖、鼠李糖、树胶醛糖和甘
油;都不能利用淀粉、海藻糖和乙酸盐为唯一碳源
生长。
表 1 菌株 N3 和 XJ01 的生理生化特征
实验项目
结果
N3 XJ01 实验项目
结果
N3 XJ01
葡萄糖氧化发酵 发酵型发酵型 精氨酸双水解酶 + －
氧化酶 － － 赖氨酸脱氨酶 － －
接触酶 + + 硝酸盐还原 + +
脲酶 － － 淀粉水解 － －
H2S产生 － － 七叶苷水解 + +
吲哚产生 － － M.R. － －
明胶液化 － + V.P + +
注:+:Positive;－:Negative。
2.1.3 16S rDNA序列测定及系统进化分析 PCR扩
增得到菌株 N3 和 XJ01 的 16S rDNA 片断，经 DNA
测序长度分别为 1520bp 和 1513bp，在 GenBank /
EMBL /DDBJ 中 的 序 列 登 记 号 为 GQ853415 和
GQ853416。将 16S rDNA 序列与 GenBank 数据库中
的序列进行 BLAST 比对，结果表明这 2 株苦荞内生
菌与肠杆菌科泛菌属(Pantoea sp.)的同源性较高，将
其与泛菌属全部 8 个种的菌株以及 Pandoraea 属的
细菌进行遗传距离计算，用邻位相连法构建系统进
化树(图 2) ，从图 2 可以看出，菌株 N3、XJ01 与泛菌
120
属(Pantoea sp.)的菌株都划分在同一簇内，且与
Pantoea agglomerans DSM 3493 的同源性最高，分别
为 97.9%和 97.8%。结合形态学和生理生化特征指
标，可以确定苦荞内生菌 N3 和 XJ01 属于泛菌属。
图 2 菌株 N3 和 XJ01 的 16S rDNA序列系统进化树
2.2 内生菌对苦荞种子萌芽过程中黄酮含量的影响
内生菌对苦荞萌发过程中黄酮合成的影响如图
3 所示，结果表明，培养基中的营养成分有利于苦荞
的萌发，黄酮合成量比对照提高 2.2%，而使用内生
菌 N3 和 XJ01 菌液后，黄酮合成量提高 8.0% 和
3.5%，说明内生菌对苦荞的黄酮合成有一定的促进
作用;提取内生菌的多糖类物质为诱导剂，在相同的
条件下，N3 和 XJ01 诱导剂能使黄酮合成量提高
12.7%和 4.2%，说明内生菌合成的多糖类代谢产物
是诱导黄酮合成增加的主要因素。
图 3 内生菌对苦荞黄酮合成的影响
2.3 不同浓度诱导剂对苦荞黄酮合成的影响
配制不同浓度梯度的内生菌诱导剂溶液，处理
萌发过程中的苦荞样品，结果(图 4)表明，2 种内生
菌诱导剂的最佳使用浓度均为 50mg /L，在该浓度条
件下 N3 和 XJ01 诱导剂的效果最好，苦荞样品的总
黄酮含量达到 4.59%和 4.35%，与对照相比提高了
15.3%和 9.3%。但过高浓度的诱导剂会抑制苦荞的
萌发，N3 提取物的浓度达到 400mg /L，XJ01 提取物
的浓度达到 200mg /L以上，样品的黄酮合成量下降。
图 4 不同浓度内生菌提取物对苦荞黄酮合成的影响
2.4 内生菌诱导剂对苦荞苯丙氨酸氨解酶活性的
影响
苯丙氨酸氨解酶(PAL)是催化黄酮合成代谢第
一步反应的酶，是苦荞黄酮合成代谢的关键酶和限
速酶，众多研究表明，PAL 活性高低与黄酮类次生代
谢物的形成关系密切［6］。取诱导剂处理前后的苦荞
样品，提取 PAL，并用紫外分光光度法测定酶的活
性，结果如表 2 所示。从样品总黄酮含量和 PAL 活
性关系来看，未萌发苦荞种子中的 PAL活性为 0.3 个
活性单位，萌发后的苦荞幼苗(CK)的 PAL活性为1.9
个活性单位，同时样品的黄酮合成量提高 2.8 倍。
PAL是一种诱导酶，可以受物理、化学和生物等多种
因素的诱导，用 N3 和 XJ01 诱导剂处理苦荞后，PAL
活性分别提高 1.9 和 1.5 倍，说明内生菌的多糖类诱
导剂对萌发过程中的苦荞次生代谢有刺激作用，诱
导 PAL活性升高，从而促进黄酮类化合物的合成。
表 2 苦荞样品中的总黄酮含量和 PAL活性
样品 总黄酮含量(%) PAL活性(U)
未萌发苦荞种子 1.40 0.3
CK 3.98 1.9
N3 诱导剂 4.59 3.7
XJ01 诱导剂 4.35 2.8
3 结论
从生态学的角度讲，任何生活在自然环境中的
植物体内都存在内生菌［8］，在内生菌与宿主植物长期
协同进化过程中，彼此构成了稳定的共生关系，许多
内生菌都能促进植物生长和次级代谢产物的合成，
是一种重要的微生物资源。本文从苦荞中分离得到
2 株内生菌，经鉴定都属于肠杆菌科泛菌属，用这 2
种内生菌及其多糖类提取物分别处理苦荞，结果表
明都可以促进萌发苦荞的黄酮合成，且内生菌提取
物的效果优于菌液。苦荞所含的黄酮类活性物质具
有重要的生理功能和较高的保健与药用价值，利用
内生菌诱导剂处理苦荞，提高黄酮类活性物质的合
成，对苦荞保健类相关产品的开发具有重要意义。
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