全 文 ：湖 北 农 业 科 学 2016 年
第 55 卷第 8 期
2016年 4 月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 55 No.7
Apr.，2016
2
1
1
Jan
10期
5
Vol． 5 No.10
May.
收稿日期：2015－05－28
基金项目：国家科技支撑计划项目（2012BAD27B01）
作者简介：李 峰（1975－），男，陕西西安人，高级农艺师，主要从事水生蔬菜资源保存评价与育种工作，（电话）027－88116313（电子信箱）
fun－lee＠163．com；通信作者，柯卫东（1963－），男，湖北武汉人，推广研究员，主要从事水生蔬菜资源保存评价与育种工作，（电话）
027－88116313（电子信箱）wdke63＠163．com。
荸荠 ［Heleocharis dulcis （Burm． f．）Trin． ex
Hensch．］为莎草科（Cyperaceae）荸荠属（Heleocharis
R． Br．）多年生草本植物，其以球茎供食用，生食、熟
食皆宜，是一种重要的水生蔬菜之一。 目前，中国荸
荠栽培面积约为 3．5 万 hm2，年产量 75 万 t 左右 ［1］，
荸荠栽培对于农民增收、 农业增效发挥了重要作
用。 国内各地荸荠产区栽培的荸荠品种多为地方品
种，鲜见有荸荠选育品种；荸荠育种多利用自然变
异采用单株系选的方法进行，或者利用荸荠组织培
养过程中产生的变异经单株选育而成，育种方法单
一。 开展荸荠人工杂交育种研究已成为业内共识，
但相关报道较少。 荸荠花粉活力高低对杂交育种成
败和效率有着重要的影响，在荸荠杂交前进行荸荠
花粉活力测定和花粉贮藏寿命调查，可有效提高杂
交效率。 目前尚未见荸荠花粉测定方法和花粉保存
寿命研究的报道，为此课题组开展了荸荠花粉活力
测定方法比较试验，同时观察和分析荸荠花粉在离
体室温（25 ℃）和低温（4 ℃）条件下的活力变化规
律，以期为荸荠杂交育种提供基础资料。
1 材料与方法
1．1 样品采集
荸荠花粉采集于湖北地方品种沙洋荸荠，在早
晨 8:00 采集花药完全伸出小花、但尚未散粉的花序
荸荠花粉活力测定及贮藏寿命研究
李 峰，李双梅，柯卫东，刘玉平，彭 静
（武汉市蔬菜科学研究所，武汉 430065）
摘要：为了解荸荠［Heleocharis dulcis （Burm． f．）Trin． ex Hensch．］花粉生活力和最佳体外萌发条件，分
别采用 I2－KI、TTC、MTT 染色法和离体培养基萌发法对荸荠花粉活力进行了测定， 并初步研究了荸荠花
粉在常温（25 ℃）条件和低温（4 ℃）贮藏条件下活力变化的动态。 结果表明，MTT 染色法测定结果与离体
萌发法最接近，最适宜荸荠花粉活力的快速检测；离体萌发法适宜培养基配方为 1％蔗糖＋50 μg ／ mL 硼
酸；荸荠花粉在常温条件下 50 min 活力降至 0．29％的低水平，在低温条件下 5 h 后完全失去活力。
关键词：荸荠［Heleocharis dulcis（Burm． f．） Trin． ex Hensch．］；花粉活力；测定方法；贮藏寿命
中图分类号：S645．3＋42 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2016）10－2564－03
DOI：10．14088 ／ j．cnki．issn0439－8114．2016．10．028
Study on Viability and Storage Life of Heleocharis dulcis Pollen
LI Feng， LI Shuang－mei， KE Wei－dong， LIU Yu－ping， PENG Jing
（Wuhan Vegetable Research Institute， Wuhan 430065， China）
Abstracts： To study the pollen viability and in vitro germination conditions of Heleocharis dulcis（Burm． f．） Trin． ex Hensch．，
viability of H． dulcis pollen was determined by three testing staining methods including I2－KI， TTC， MTT and in vitro cul-
ture method． Dynamic changes of in vitro pollen germination rate under the storage condition of 25 ℃ and 4 ℃ was compared．
The result indicated that the pollen dyed rate of MTT staining method was similar to the in vitro germination rate， thus the
MTT staining method is suitable for fast test of the pollen viability of H． dulcis． The best medium for in vitro pollen germi-
nation of H． dulcis was 1％ sucrose ＋ 50 μg ／ mL boric acid． The in vitro pollen germination rate of H． dulcis decreased to
0．29％ when stored at 25 ℃ for 50 min， while decreased to 0 when stored at 4 ℃ for 5 h．
Key words： Heleocharis dulcis （Burm． f．）Trin． ex Hensch．； pollen viability； determination method； storage life
第 10 期
若干，迅速带回实验室，用镊子捏取荸荠花序中部
花药 1 个，置于载玻片上静置 20 min，用于花粉活
力测定方法试验；花粉寿命测定试验取样方法同此。
1．2 花粉活力测定
1．2．1 培养基发芽法 液体培养基参照胡适宜 ［2］提
出的配方，经预备试验初步确定蔗糖和硼酸的浓度
范围，按照表 1 组合配制 9 个液体培养基处理。 将
载玻片花药加 1～2 滴液体培养基， 用镊子轻捣，花
粉散于培养基液体后夹出花药，置室温下 1 h 后，显
微镜下观察 3 个视野，凡是出现花粉管伸出即认为
发芽。 试验采用随机区组设计，重复 3次。
1．2．2 I2－KI 染色法 于载玻片花药加 1～2 滴 I2－KI
溶液（将 0．3 g碘和 1．3 g碘化钾溶解于 100 mL 去离
子水中）［3］，用镊子轻捣使花粉散出，夹出花药后盖
上载玻片，置于 35 ℃恒温箱中 30 min，然后在显微
镜下观察不同的 3 个视野，凡是染成蓝色者为有活
力的花粉。 观察 3 个制片（重复 3 次），统计平均染
色率。
1．2．3 TTC 染色法 于载玻片花药加 1～2 滴 0．5％
TTC 溶液（称取 0．5 g TTC，加入少许 95％乙醇使其
溶解后，用去离子水稀释至 100 mL）［4］，用镊子轻捣
使花粉散出，夹出花药后盖上载玻片，置于 35 ℃恒
温箱中 30 min，然后在显微镜下观察不同的 3 个视
野，凡是染成红色者为有活力的花粉。 观察 3 个制
片（重复 3次），统计平均染色率。
1．2．4 MTT 染色法 于载玻片花药加 1～2 滴 1％
MTT 溶液（称取 0．1 g MTT，溶解于 10 mL 配制好的
5％蔗糖溶液中）［5］，用镊子轻捣使花粉散出，夹出花
药，其风干后再复滴 1 滴，待再次风干后置显微镜
下观察不同的 3 个视野， 凡是花粉粒边缘变黑、中
心变玫红色者为有活力的花粉。 观察 3 个制片（重
复 3次），统计平均染色率。
1．3 花粉寿命测定
设置常温（25 ℃）离体贮藏和低温（4 ℃）离体贮
藏试验。 取田间采回后的样品分为 2 份，1 份置室
温，另 1 份置 4 ℃冰箱保存，每隔固定时间（常温
离体寿命试验间隔 10 min，低温离体寿命试验间隔
1 h），用镊子取荸荠花序中部花药 2 个，置于载玻片
上，加 1～2 滴上述筛选出的液体培养基，置室温下
1 h 后，显微镜下观察 3 个视野，凡是出现花粉管伸
出即认为发芽，观察 3个制片（重复 3次）。
1．4 数据处理
试验所得数据均取平均值， 统计分析采用 Mi-
crosoft Office Excel 2007 和 SPSS 10．5 软件处理、
制表、作图，并进行方差分析；利用邓肯氏新复极差
检验法 （Duncan＇s new multiple range test，DMRT）
进行差异显著性检验。
2 结果与分析
2．1 花粉活力检测情况
在液体培养基花粉发芽试验中，对观察到的部
分花粉粒花粉管伸出、呈乳突状或者更长者记为有
活力，不同配方液体培养基培养条件下荸荠花粉发
芽率方差分析结果见表 2。从表 2可以看出，蔗糖因
子和区组间差异显著（P＜0．05），而硼酸因子与组合
间差异不显著（P＞0．05），说明蔗糖含量是影响荸荠
花粉萌发的主要影响因子，而且在预备试验中也发
现高含量的蔗糖（10％～20％）会使荸荠花粉基本不
萌发，所以初步认为荸荠花粉萌发需要低含量的蔗
糖，一般 1％～5％；进一步的多重比较结果见表 3，从
表 1 液体培养基主要成分配制组合
组合处理
1
2
3
4
5
6
7
8
9
蔗糖含量//%
1
1
1
3
3
3
5
5
5
硼酸浓度//μg/L
10
25
50
10
25
50
10
25
50
表 2 不同配方液体培养基荸荠花粉发芽率方差分析
变异来源
区组间
蔗糖
硼酸
蔗糖×硼酸组合
误差
总变异
SS
38.281 5
70.224 5
17.884
29.719 2
42.639 7
198.748 9
df
1
2
2
4
8
17
MS
38.281 5
35.112 3
8.942 0
7.429 8
5.330 0
F 值
7.182 3
6.587 7
1.677 7
1.394 0
P 值
0.027 9
0.020 4
0.246 4
0.318 7
表 3 不同配方处理下荸荠花粉发芽率
组合
处理
3
2
1
8
6
7
5
9
4
蔗糖含量//%
1
1
1
5
3
5
3
5
3
硼酸浓度//μg/mL
50
25
10
25
50
10
25
50
10
发芽率//%
24.07 a A
17.07 ab AB
15.93 b AB
14.68 b AB
14.61 b AB
13.74 b AB
13.30 b AB
12.92 b AB
12.11 b B
培养基配方处理
注：同列中不同英文小写字母表示处理间在 P＜0．05水平上存在差
异显著性；不同大写字母表示在 P＜0．01水平上存在差异显著性。下同。
李 峰等：荸荠花粉活力测定及贮藏寿命研究 2565
湖 北 农 业 科 学 2016 年
表 3可看出，蔗糖含量为 1％、硼酸浓度 50 μg ／ mL的
组合处理发芽率最高，达 24．07％，与蔗糖浓度 1％、
硼酸含量 25 μg ／ mL的处理间差异不显著（P＞0．05），
但显著（P＜0．05）或极显著（P＜0．01）高于其他处理。
3种染色法测定的花粉活力情况见表 4。由表 4
可以看出，I2－KI染色法在显微镜下的花粉粒分别呈
现出蓝色和金黄色， 花粉粒呈现蓝色的比率约为
48．3％；TTC 染色法在显微镜下的花粉粒均现淡黄
色，并未出现红色，初步认为该方法不适合荸荠花
粉的活力检测；MTT 染色法部分花粉粒则呈现玫红
色、淡红色以及透明无色，而且边缘现蓝黑色圈，经
过观察计数统计， 呈现玫红色的花粉粒染色率达
28．3％，一般认为染色颜色越深花粉活力越强，淡红
色、透明无色视为活力弱或无活力。
2．2 花粉寿命比较
2．2．1 常温离体条件下荸荠花粉活力 常温（25 ℃）
离体条件下不同贮藏时间对荸荠花粉发芽率的影
响情况见图 1。从图 1可以看出，荸荠花粉在常温离
体条件下其发芽率在前 20 min 内由 14．45％下降到
4．79％， 下降幅度较大， 而后逐渐缓慢降低；50 min
后其活力仅为 0．29％。由此看来，荸荠在常温离体条
件下，其花粉寿命约在 50～60 min，在 30 min 内花粉
能保持较高的活力。
2．2．2 低温离体条件下荸荠花粉活力 低温（4 ℃）
离体条件下不同贮藏时间对荸荠花粉发芽率的影
响情况见图 2。 从图 2可以看出，在低温（4 ℃）离体
条件下， 荸荠花粉发芽率在前 1 h 迅速下降 ，由
10．91％下降到 6．07％，降幅近 50％；之后的 2 h 内下
降缓慢；在贮藏 3 h 后又迅速下降，至 5 h 时荸荠花
粉已完全失去活力。 由此可以看出，荸荠花粉在低
温（4 ℃）离体条件下，其最长贮藏寿命为 5 h，3 h 以
内则荸荠花粉能够保持较高的活力。
3 小结与讨论
实验室花粉活力测定方法主要有染色法和离
体萌发法；染色法是最简便、最快捷、最易操作的一
种测定方式，但由于不同作物的花粉自身特性（如
花粉壁的厚薄、花粉外壁的组成物质、细胞质含量、
质膜完整性、花粉内各种酶活性的强弱等）不同，不
同染色方法测定花粉活力的准确性差异较大；而离
体萌发法测定花粉活力最直观、最准确。 试验以离
体萌发法测定的结果为对照， 比较了 I2－KI、TTC 和
MTT 染色法应用于荸荠花粉活力的适用性，结果表
明，I2－KI虽能够使荸荠花粉染成蓝色， 但测定结果
较离体萌发法高出 1 倍以上，部分含有淀粉而无活
力的花粉亦被染成蓝色，所以采用该方法测定的荸
荠花粉活力误差较大。 TTC染色法将花粉染成颜色
很淡的黄色， 不易区分染色花粉粒与无色花粉粒，
笔者认为该方法不适用于荸荠花粉活力的测定。
MTT 染色法能够很清晰染色，并且可区分花粉活力
强弱的染色深浅，测定的结果亦与离体萌发法结果
最接近，因此笔者认为 MTT 染色法最适合荸荠花粉
活力的测定。 在花粉离体萌发培养中，蔗糖起着维
持花粉与培养基之间渗透平衡的作用，也是花粉萌
发的主要营养物质供应和能量来源，不同植物花粉
萌发的适宜蔗糖浓度有所不同，一般为 5％～15％［6］，
但通过此次试验发现荸荠花粉萌发宜采用 1％的低
蔗糖浓度。 硼酸的作用是促进花粉管的萌发，不同
的植物在浓度上差别也较大 ［7－10］，试验发现，硼酸可
明显促进荸荠花粉萌发，浓度宜为 50 μg ／ mL。
表 4 染色法测定花粉活力情况
染色方法
I2-KI 染色法
TTC 染色法
MTT 染色法
有活力花粉比率//%
48.3±11.0
-
28.3±6.7
备注
花粉粒呈蓝色和金黄色，
呈蓝色记为有活力
花粉粒全部呈淡黄色，不好确
定有否活力
花粉粒呈玫红色、淡红色、无色
和黑色，呈玫红色记为有活力
0 10 20 30 40 50
时间//min
16
14
12
10
8
6
4
2
0
发
芽
率
//%
注：图中不同英文小写字母表示每隔一定时间测定的数据间在
P＜0．05 水平上存在差异显著性；不同大写字母表示每隔一定时间测
定的数据间在 P＜0．01 水平上存在差异显著性。 下同。
图 1 常温离体条件下荸荠花粉活力变化动态
14.45aA
9.4bB
4.79cCD5.55cC
2.48dD
0.29eE
图 2 低温离体条件下荸荠花粉活力变化动态
0 1 2 3 4 5
时间//h
12
10
8
6
4
2
0
发
芽
率
//%
10.91aA
6.07abA
4.81bA5.69bA
1.77cBC
0cB
（下转第 2576页）
2566
湖 北 农 业 科 学 2016 年
试验结果表明， 荸荠花粉保持活力的时间较
短， 其在常温条件下 50 min 时活力仅为 0．29％；即
使在低温条件下，在前 3 h 内可保持较高活力，而在
贮藏 5 h后完全失去活力。因此笔者认为，荸荠杂交
人工授粉时宜在采集到花粉后 20 min 内进行；若花
粉在低温贮藏条件下，则应在 3 h内进行授粉。花粉
贮藏条件与温度、湿度和光照等因素相关，但试验
仅研究了荸荠花粉在 4 ℃低温条件下的贮藏寿命长
短，而且在此条件下的贮藏寿命尚不能达到异地授
粉或者花期不遇亲本授粉的要求，因此还有待进一
步开展荸荠花粉超低温、不同湿度和光照条件下贮
藏寿命长短的研究，以期延长其贮藏寿命。
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（上接第 2566页）
色效果，就可辨别种子是否具有生活力。
通过试验发现，在种子染色阶段，染色时间 1 h
过短，不适于茄子种子的生活力测定。 这很可能是
由于染色时间过短，活种子呼吸过程中脱氢酶产生
的氢非常有限，来不及与四唑染色液充分反应造成
的。 若是染色液浓度（1.0％）较高、染色温度（35 ℃）
较高、染色时间延长，则均有利于茄子种子的生活
力测定。 但在较高的染色液浓度时，染色温度较高，
同时染色时间（36 h）过长，则茄子种子的染色效果
反而下降，这可能是由于种子长时间处于较高的染
色温度条件下内部某些物质结构遭到破坏、导致种
子生活力下降引起的。
试验得到的 TTC 法快速测定茄子种子生活力
的理想处理组合为处理组合 11，其着色种子数目最
多，为 97 粒，且染色时间较短，为 18 h，其余条件是
浸种温度 20 ℃、浸种时间 18 h、染色液浓度 1.0％、
染色温度 35 ℃。
不过在试验中普遍存在的问题是茄子种子着
色程度深浅不匀，有些种子着色太浅，不能清晰地
观察种子胚各部分的染色情况；有些种子着色又太
深，甚至全部被染成深褐色，也无法准确判断种子
胚各部分的生活力情况。 这可能与种子本身的生活
力强弱程度、染色液浓度及染色时间等因素有关。
由于本试验为探索性工作，虽然得出的结论是
在各种不同处理组合条件下最为理想的处理组合，
有一定的说服力和科学性。 但若想获得 TTC法快速
测定茄子种子生活力更加适宜的条件参数，还需要
设计更多的影响因素处理组合，如增加不同浸种温
度、时间组合，设计更多的染色液浓度梯度，增加更
多的不同染色时间及染色温度的处理组合，并选用
不同的茄子品种等，从而提高快速测定茄子种子生
活力方法的可信度。
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