全 文 ：西北农业学报　2010 , 19(7):48-52
Acta A griculturae Boreali-occidentalis Sinica
苦荞种子萌发过程芦丁降解酶的代谢规律＊
陈　鹏 ,侯智法
(西北农林科技大学 生命科学学院 ,陕西杨凌　712100)
摘　要:利用等吸收紫外分光光度法检测苦荞萌发过程中芦丁降解酶的活性 , 用聚丙烯酰胺凝胶电泳
(PAGE)活性染色分析苦荞粉和萌发过程芦丁降解酶的同工酶谱 ,并对萌发过程黄酮质量分数的变化进行了
分析 。结果表明 ,建立的芦丁降解酶 PAGE 分析方法可以用于该酶的同工酶分析 , 苦荞种子中芦丁降解酶有
4 种同工酶。活性及同工酶电泳分析显示芦丁降解酶在种胚和内种皮中均有分布 , 胚中芦丁降解酶活性在籽
粒萌发 3 d 内无明显变化 , 在萌发第 4 天开始迅速下降 ,至胚为子叶完全吸收后活性消失 ,而内种皮中芦丁降
解酶在萌发过程中一直保持较高活性。整个萌发过程总黄酮呈上升趋势。推测芦丁降解酶在种子的萌发期
并无新的合成。
关键词:苦荞;萌发;芦丁降解酶;黄酮;Weste rn blotting
中图分类号:S517　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1004-1389(2010)07-0048-05
Metabolic Profiles of Rutin-degrading Enzyme during Seed
Germination Process of Tartary Buckwheat
CH EN Peng and HOU Zhifa
(C ollege of Life S ciences , Northwest A&F University , Yangling Shaanxi　712100 , C hina)
Abstract:Isoabso rptive UV spectrophotometry w as used to assay the activity change profiles of the ru-
tin-deg rading enzyme(RDE)during the seed germina tion process in Tartary buckwheat , poly acry lam-
ide gel elect ropho resis (PAGE)method fo r RDE s isozymes analy sis w as established.The change
pat terns of RDE s isozymes and to tal flavonoids w ere also analysed.PAGE me thod based on so lubili-
ty dif ference betw een quercetin and rutin can detect the RDE s isozymes ef ficient ly , there are four
RDE isozymes present in seeds.RDE dist ributes both in embyro and endo testa during the germination
pro cess , the activi ty o f RDE did not change significantly during the fi rst three day s.There w as a
sharp decrease in the forth day , and RDE activi ty w as disappear in the f if th day w hen the embryo w as
completely abso rbed by the young leaf.But act ivity of RDE kept highly active in the endotesta during
all sampling period , the content of total f lavonoids increased during the w hole process.We speculate
that there w as no new ly synthe sis of RDE during seeds germination process.
Key words:Tartary buckwheat;Germination;Rutin-degrading enzyme;Flavonoids;Weste rn blo t ting
　　苦荞[ Fagopy rum tataricum (L .)Gaertn]又
名三角麦 、乌麦 、鞑靼 ,是蓼科荞麦属双子叶植物 ,
为一年生或多年生宿根性植物 。荞麦起源于中
国 , 自然野生的历史已有 2 000多年之久 ,原产于
黑龙江至贝加尔湖一带 , 现在中国的东北 、华北 、
西北及西南地区均有种植[ 1] 。苦荞含有极为丰富
的黄酮类化合物 , 其中芦丁约占苦荞总黄酮的
80%,是膳食黄酮的主要来源[ 2] 。芦丁可以抑制
血管紧张素转换酶的活性[ 3] ,降低毛细血管通透
性和脆性 , 促进细胞增生和防止血细胞凝聚 , 并
＊收稿日期:2010-01-11　　修回日期:2010-04-25
基金项目:国家自然科学基金(30400282)。
第一作者:陈　鹏 ,副教授 ,博士 ,从事蛋白质与酶的研究。 E-mail:penchen@nw su af.edu.cn
具有抗炎 、抗过敏 、利尿 、解痉 、镇咳 、降血脂等方
面的功效[ 4] 。苦荞籽粒中存在高活性的 β-糖苷
酶-芦丁降解酶(Rutin-deg rading enzyme , RDE),
该酶具有很强的酸碱稳定性和热稳定性[ 2] ,专一
性作用于芦丁而引起芦丁的水解 。在水溶液中 ,
芦丁在 RDE作用下生成槲皮素及芸香糖 ,造成芦
丁提取得率的降低[ 5] 。RDE 是苦荞芦丁代谢的
关键酶之一 ,但国内外对该酶的研究仅有数篇报
道。Yasuda T 从苦荞种子中分离得到 2 种
RDE ,二者皆对芦丁有特异的降解作用[ 6] 。Mor-
i shi ta建立了利用核磁共振方法检测苦荞麦种子
中 RDE 的活性方法 ,证实苦荞中存在 RDE的活
性 ,但甜荞中未检测到 RDE 活性[ 7] 。Suzuki T
等[ 8]研究发现 ,在苦荞种子子叶发育过程中 ,芦丁
含量随时间增加而增加 ,同时黄酮醇-3-糖苷酶含
量和活性逐渐减弱 。对于苦荞芦丁降解酶的分
布 、籽粒萌发过程中 RDE 变化以及 RDE是否存
在同工酶至今未有文献报道。本研究在已经完成
RDE 的纯化以及多克隆抗体制备的基础上 ,研究
了苦荞种子 RDE 的分布部位 、萌发过程中 RDE
活性变化规律及其同工酶谱变化 ,为进一步揭示
该酶的代谢规律和生物学功能提供背景资料和技
术支持。
1　材料与方法
1.1　材料与试剂
苦荞种子为当年收获的榆荞 6-21 。种子经
表面消毒和吸胀处理后播于铺有 6层湿脱脂纱布
的白磁盘内 ,盖上 3层湿脱脂纱布 ,室温下萌发。
于吸胀后取胚和内种皮作为材料提取 RDE。全
籽粒或全株采样 ,把采集的材料洗净擦干 ,105℃
恒温烘箱中烘 20 min ,然后将温度降至 80℃恒温
烘干 8 h ,放入干燥器中冷却至室温 。将烘干的
样品材料用研钵研磨成粉末状 ,作为黄酮质量分
数测定材料。
芦丁(国药集团化学试剂有限公司 , BR);一
抗为 RDE多克隆抗体(用纯化的分子量为 64 kD
RDE 免疫兔子制得);二抗为辣根过氧化物酶
(HRP)偶联的山羊抗兔 IgG(北京博奥森生物技
术有限公司);其余试剂均为国产分析纯 。
1.2　方 法
1.2.1　苦荞萌发过程 RDE的提取和活性测定　
RDE 提取及活性测定参照顾继娟[ 9] 方法进行 ,并
略作修改 。芦丁在 372 nm 处有最大光吸收值 ,
其酶解产物槲皮素则在 343.3 nm 处有最大吸收
值 ,通过计算二者吸光度差值 ΔA 大小 ,可以反映
出 RDE活性的强弱。于种子吸胀后第 1 、2 、3 、4 、
5 、6天取胚和内种皮。取胚 1.2 g 加入 6 mL 提
取缓冲液(0.2 mo l/L 醋酸缓冲液 , pH5.0),内种
皮称取0.1 g 加入 2 mL 提取缓冲液 ,冰浴条件下
充分研磨 , 4℃冰箱静置提取 3 h , 离心(10 000
r/min ,20 min , 4℃),上清液即为 RDE粗酶提取
液 ,保存于 4℃冰箱备用。取 0.16 mL 酶反应底
物(0.1 g 芦丁溶于 20 mL 甲醇 ,用提取缓冲液稀
释 5 倍)加入 0.04 mL 的 RDE 粗提液 ,混匀 ,
50℃水浴中保温 3 min ,迅速加入 0.8 mL 甲醇终
止反应 ,用 5 mL 稀释液(16.8 mL 提取缓冲液用
甲醇定容至 100 mL)进行稀释。设置不加 RDE
以及甲醇灭活的 RDE 为对照。用紫外分光光度
计测定各样品在 372 nm 和 343.3 nm 处吸光值 ,
计算 372 nm 和 343.3 nm 吸光度差值 ΔA ,以每
毫克新鲜样品在 3 min 内 0.001ΔA 为一个酶活
力单位 U 。
1.2.2　RDE PAGE活性染色方法的建立　依据
芦丁与槲皮素溶解度以及颜色的差异 ,探索 RDE
PAGE检测的方法 。将 1 g 苦荞粉加入 5 mL 提
取缓冲液 ,按照“1.2.1”所述方法提取 RDE并测
定活性。采用不连续非变性聚丙烯酰胺电泳系统
进行电泳。分离胶 0.12 g/mL , 浓缩胶 0.05
g/mL ,点样 70 μL ,浓缩胶 7 mA ,分离胶 15 mA 。
前沿指示剂距底部 1 cm ,停止电泳 ,剥取凝胶 ,加
入预冷的 0.2 mol/L 醋酸缓冲液(pH 5.0), 4℃
平衡 30 min ,加入 25 mL 酶反应底物 , 50℃保温
至有浅黄色条带出现 ,倾去底物溶液 ,用去离子水
漂洗数次 ,将胶片置凝胶成像系统中照相。
将纯化的 RDE 稀释 4 倍 ,分别点样 0.95 、
1.9 、3.8 ng ,按上述条件进行 PAGE 电泳分析 。
1.2.3　萌发过程中 RDE 的 PAGE 活性染色　
取胚和内种皮中前 6 d样品 ,按照“1.2.2”所述方
法操作。
1.2.4 　萌发过程中 RDE 酶蛋白的 Western
blo t ting 分析　将胚和内种皮蛋白样品在 0.10
g/mL 的 SDS-PAGE凝胶上分离 ,按张静[ 10] 的方
法进行抗体结合和酶显色反应 。一抗稀释 300
倍;二抗稀释 1000倍 ,显色底物为 DAB 显色液
(0.15μL/mL H 2O 2 ,0.05 g/mL DAB)。
1.2.5　黄酮质量分数的测定　标准溶液和样品
溶液的制备 精确称取芦丁标准样品 20.0 mg ,用
—49—7 期　　　　　　　　　　　陈　鹏等:苦荞种子萌发过程芦丁降解酶的代谢规律
300 μL/mL 乙醇溶液溶解并定容至 100 mL ,摇
匀 ,得 0.200 mg/mL 芦丁标准溶液 。
精确称取苦荞萌发籽粒或幼苗干粉 0.2 g ,放
入 5 mL 离心管中 ,加入 3 mL 的 700 μL/mL 乙
醇 ,在 50℃下提取 15 min ,离心(10 000 r/min ,10
min),转移上清至 10 mL 容量瓶中 。反复浸提 2
次 ,用 700 μL/mL 乙醇定容后充分混合 ,得到样
品溶液。
芦丁标准曲线的制作　参照王玲霞[ 11] 方法
并略作修改 。取芦丁标准液 0 , 1.0 , 2.0 , 3.0 ,
4.0 , 5.0 , 6.0 ,7.0 ,8.0 mL 于 9只 25 mL 容量瓶
中 ,用 300 μL/mL 乙醇补充至 12.5 mL , 加入
0.05 g/mL NaNO 2 溶液 0.7 mL ,摇匀放置 5 min
后 ,加入 0.10 g/mL Al(NO 3)3 溶液 0.7 mL , 6
min后加入 1 mol/L NaOH 5 mL ,用 30 μL/mL
乙醇定容至 25 mL ,摇匀 ,以未加芦丁标准液的为
空白对照 ,在 510 nm 处测定吸光度 ,计算总黄酮
含量。以吸光度 A 为纵坐标 , 质量浓度 C
(mg/mL)为横坐标绘制标准曲线 ,用最小二乘法
做线性回归 ,得线性回归方程为:A=0.0708C-
0.0028(R2 =0.9995)。
苦荞萌发过程中总黄酮质量分数的测定　取
7份样品溶液各 1 mL 置 25 mL 容量瓶中 ,按照
以上所述方法测定吸光度 ,并计算黄酮质量分数。
2　结果与分析
2.1　苦荞萌发过程胚和内种皮 RDE活性变化
由图 1可以看出 ,在苦荞种子的萌发过程中 ,
胚中 RDE的活性在前 3 d内活性缓慢下降 ,第 4
天后出现大幅度下降 ,第 5 天后苦荞幼苗中的
RDE 活性消失 。内种皮中的 RDE活性呈缓慢平稳
地下降趋势 ,在第 3天小幅下降后保持在相对稳定
的水平。结果说明在内种皮中存在高活性的 RDE ,
内种皮对苦荞粉中芦丁的降解起重要作用。
2.2　RDE PAGE检测方法的建立
RDE 水解芦丁形成产物 —槲皮素与芦丁的
溶解度有较大的差异(槲皮素的溶解度约为芦丁
的 1/10)。 RDE 样品电泳分离后 , 凝胶上存在
RDE 的位置 , RDE 水解芦丁产生溶解度相对较
低的棕黄色沉淀物质———槲皮素 ,槲皮素沉淀形
成指示 RDE 的条带 。同时槲皮素在紫外区有强
烈的光吸收 ,因此 ,可以用凝胶成像紫外系统进行
拍照 。
图 1　萌发过程芦丁降解酶活性的变化
Fig.1　Change of rutin degrading enzyme
activity during germination
　　基于以上方法 ,对籽粒中的 RDE粗提液进行
同工酶谱分析 ,共染出 4条条带 ,说明在苦荞籽粒
中至少存在 4 种 RDE 同工酶(图 2)。用建立的
PAGE活性染色的方法分析纯化的 64 kD RDE ,
结果发现 ,染色条带强度随着纯化 RDE 量的增加
而增加 ,说明该方法可以用来对 RDE进行活性检
测(图 3)。
图 2　种子中 RDE同工酶的 PAGE分析
Fig.2　Electropherogram of RDE isoenzyme in seeds
1.0.95 ng;2.1.9 ng;3.3.8 ng
图 3　不同量纯化 64 kD RDE PAGE分析
Fig.3　Electropherogram of purified 64 kD
RDE with different loading
2.3　苦荞籽粒萌发过程中 RDE同工酶的变化
对不同萌发时期的胚的 RDE 样品进行
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PAGE分离和活性染色(图 4),萌发前 3 d样品显
示 3条同工酶谱带 ,即 RDE 含有 3种同工酶 ,而
第 4天的样品仅显示出一条酶带 ,至第 5 天时所
有酶带消失。而各个萌发时期内种皮同工酶染色
均显示 3 种同工酶谱带(图 5),而且在整个萌发
过程中保持谱带的相对稳定。
图 4　萌发过程中胚中 RDE 同工酶谱的 PAGE分析
Fig.4　PAGE analysis of RDE isoenzyme
in embryo during germination
图 5　萌发过程中内种皮 RDE同工酶谱的 PAGE分析
Fig.5　PAGE analysis of RDE isoenzyme in
endotesta during germination
2.4　萌发过程中 RDE酶蛋白的 Western blot-
ting分析
萌发过程中胚样品的 RDE 酶蛋白 Western
blo t ting 显示(图 6), 在萌发 3 d内 RDE 的杂交
信号强度接近 ,而至第 4天时杂交信号强度明显
减弱 ,第 5天和第 6天时无杂交信号出现 ,该结果
与 RDE酶活性的测定结果一致。而在整个萌发
过程中内种皮中前 3 d的样品杂交信号强度基本
一致 ,较萌发第 4 、5 、6天的样品略强 ,与样品中
RDE 活性变化趋势基本吻合(图 7)。
图 6　萌发过程胚中 RDE Western blotting分析
Fig.6　RDE western blotting results of
embryo during germination
图 7　萌发过程中内种皮 RDE Western blotting分析
Fig.7　RDE Western blotting results of
endotesta during germination
2.5　苦荞籽粒萌发过程中黄酮质量分数变化
由图 8可以看出 ,在苦荞种子萌发的前 3 d ,
总黄酮质量分数基本稳定 ,伴随着萌发时间的延
长 ,黄酮质量分数开始增加 ,至第 5天时黄酮质量
分数大幅度增加 ,虽然在第 6天略有下降 ,但在整
个萌发阶段 ,黄酮的质量分数呈现递增趋势 。
图 8　苦荞籽粒萌发过程中黄酮质量分数的变化
Fig.8　Change of total flavonoids
content during germination
3　讨论
本研究利用酶学实验室已经建立的等吸收紫
外分光光度法测定 RDE 活性的方法 ,对苦荞种子
萌发过程中 RDE 活性变化规律进行研究 。建立
了 PAGE 活性染色检测 RDE 及其同工酶的方
—51—7 期　　　　　　　　　　　陈　鹏等:苦荞种子萌发过程芦丁降解酶的代谢规律
法 ,并对种子和萌发过程中 RDE同工酶谱进行分
析 ,同时测定了黄酮质量分数的变化。
在苦荞种子的萌发过程中 ,胚中酶活性的变
化总趋势是降低的 ,当胚完全为子叶吸收后 ,幼苗
中的 RDE活性为零 ,与苦荞种子胚中存在 RDE
相符[ 12] 。内种皮中同样存在高活性的 RDE ,在
种子的萌发过程中 ,从整体而言活性变化很小。
因此在苦荞面粉加工过程中尽可能的除去内种
皮 ,也可有效降低苦荞粉中 RDE 含量 ,从而降低
荞麦食品加工中芦丁的降解 ,更好的发挥其营养
价值和药用价值 。
对于荞麦籽粒中芦丁降解酶同工酶的研究至
今未有报到 ,本研究根据芦丁和槲皮素溶解度的
差异建立了其同工酶的检测方法 ,并首次对种子 、
萌发过程中的胚和内种皮进行 RDE 及其同工酶
的研究 ,发现在种子中 RDE 有 4 种同工酶 ,胚和
内种皮中 RDE有 3种同工酶 。通过对种子 、萌发
过程中胚和内种皮中的 RDE 活性的测定及其同
工酶谱的分析 ,证明了 PAGE 活性染色方法可以
用于检测芦丁降解酶的活性的变化规律 ,该方法
的建立为深入研究芦丁降解酶的功能奠定了基
础。通过 western blot ting ,对萌发阶段胚和内种
皮中的 RDE进行检测 ,杂交信号的强度与酶活性
的变化规律一致 ,发现萌发过程中 , RDE 随着胚
被子叶的吸收而降解 , 这与王改玲[ 13] 报道的
RDE 在籽粒萌发过程中被抑制的结果存在差异。
苦荞种子在萌发的过程中 ,总黄酮质量分数
是增加的 ,这与蔡马[ 14] 的报道基本一致 ,说明萌
发可以提高荞麦籽粒的黄酮质量分数。结合苦荞
种子中 RDE对芦丁利用率的限制 ,以芽菜形式食
用荞麦不仅可以提高黄酮的质量分数 ,又可以克
服芦丁降解问题 ,使黄酮类物质得到最大限度的
利用[ 15] 。
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