全 文 ：2014 年 8 月
第 29 卷第 8 期
中国粮油学报
Journal of the Chinese Cereals and Oils Association
Vol． 29，No． 8
Aug. 2014
苦荞黄酮的纯化及抗氧化活性的研究
尤玲玲1，2 刘幻幻1 李晓雁1 张平平1 刘金福1，2
(天津农学院食品科学系1，天津 300384)
(天津市农副产品深加工技术工程中心2，天津 300384)
摘 要 利用 AB －8 大孔吸附树脂对苦荞黄酮提取物样品进行纯化，利用薄层色谱分析了纯化前后苦荞
黄酮的成分变化，并以维生素 C为参照，比较了纯化前后苦荞黄酮对 O2
－·和 DPPH·体外清除能力。试验结果
表明:经过 AB －8 纯化后，苦荞黄酮提取物 2 中黄酮的含量由 78． 42%提高到 98． 73%，纯化后主要成分为芦
丁;其清除 O2
－·的半数清除浓度 IC50由 0． 099 mg /mL升高到 0． 123 mg /mL，纯化后清除能力反而降低;清除 DP-
PH·的 IC50由 0． 273 mg /mL降低到 0． 185 mg /mL，清除能力有所提高。
关键词 苦荞 黄酮 纯化 薄层层析 抗氧化
中图分类号:TS213 文献标识码:A 文章编号:1003 － 0174(2014)08 － 0023 － 05
网络出版时间:2014 － 08 － 13 14:28
网络出版地址:http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /11． 2864． TS． 20140813． 1428． 002． html
基金项目:天津市科技支撑计划(13ZCZDNC01800) ，天津农学院
科学研究发展基金计划(2011N03) ，天津市科技支撑
计划(ZCKFNC 01600)
收稿日期:2013 － 08 － 23
作者简介:尤玲玲，女，1981 年出生，讲师，生物资源开发与功能
性食品
通讯作者:刘金福，男，1961 年出生，教授，天然产物化学及生物
活性
苦荞又名三角麦，也称作鞑靼荞麦，是双子叶蓼
科荞麦属植物的成熟种子，为一年生草本植物，是一
种粮、饲、药兼用的植物资源［1］。苦荞原产于我国东
北和西南部的四川凉山地区，耐旱耐寒、耐酸耐脊、
适应性较强、生长周期短，属于无污染的绿色食品资
源［2］。苦荞麦营养丰富，不仅富含蛋白质、淀粉、脂
肪、粗纤维、维生素、矿物质等成分，同时还含有丰富
的生物活性成分———黄酮类化合物，又称生物类黄
酮。现代临床医学观察表现:苦荞制品具有降血糖、
降血脂，防治糖尿病、冠心病、抗癌、增强免疫力、杀
菌、抗动脉粥样硬化、抗衰老等药用疗效，这些生物
活性与苦荞中生物类黄酮抗氧化能力密切相关［3］。
本试验利用 AB －8 大孔吸附树脂对苦荞黄酮提
取物样品进行纯化，然后通过三氯化铝显色反应定
性分析纯化后样品，同时，以芦丁和槲皮素为对照
品，利用薄层色谱(TLC)对纯化后苦荞黄酮进行成分
分析。并以维生素 C 为参照，比较了纯化前后苦荞
黄酮对超氧阴离子自由基(O2
－·)和 DPPH·的体外清
除效果，为苦荞黄酮在工业生产以及保健食品的开
发提供理论支持。
1 材料与方法
1． 1 材料与试剂
DPPH自由基:博美科生物科技有限公司;芦丁
标准品:上海源叶生物科技有限公司;槲皮素标准
品:上海辛克生物科技有限公司;苦荞黄酮提取物 1，
水提物:山西沁源县产苦荞麦;苦荞黄酮提取物 2:陕
西森弗高科实业有限公司;苦荞黄酮提取物 3，80%
甲醇提取:天津农学院食品科学与工程教研室。
1． 2 仪器与设备
HD － 5 电脑紫外检测仪、BT － 100N 数显恒流
泵、CBS － B程控多功能全自动部分收集器、Z系列层
析柱:上海沪西分析仪器厂有限公司;WFZ UV －
3802 型紫外可见分光光度计、WFJ7200 型可见分光
光度计:尤尼柯(上海)仪器有限公司;Bio － Tek
ELX800 型全自动酶标仪:美国宝特公司。
1． 3 试验方法
1． 3． 1 苦荞黄酮提取物样品中黄酮含量的测定
1． 3． 1． 1 芦丁标准曲线的绘制［4］
精密称取芦丁标准品 5． 2 mg，加 60%的乙醇溶
液定容至 25 mL，摇匀，分别精密吸取对照品溶液 0、
0． 2、0． 4、0． 6、0． 8、1． 0 mL 于 10 mL 的具塞试管中，
加 5%的亚硝酸钠 0． 4 mL，摇匀，放置 6 min 后再加
10%的硝酸铝溶液 0． 4 mL，6 min后加 4 mL的 4%的
氢氧化钠溶液，再加 60%的乙醇溶液定容至刻度，摇
匀，放置 15 min，在 510 nm 下测吸光度值，以吸光值
中国粮油学报 2014 年第 8 期
为纵坐标，芦丁浓度为横坐标，得回归方程:y =
14． 127x － 0． 003 7，相关系数 Ｒ2 = 0． 998 2。
1． 3． 1． 2 各样品中总黄酮含量的测定
用 60%乙醇将荞黄酮提取物 1、2、3 配制成不同
浓度的样液，依 1． 3． 1． 1 方法，根据标准曲线，依公
式(1)计算苦荞各样品中的总黄酮含量。
总黄酮含量 =
x × a × V0
W × 1 000 × 100% (1)
式中:x为样液中芦丁含量的质量浓度 /mg /mL;a
为稀释倍数;V0 为样液总体积 /mL;W为样品质量 / g。
1． 3． 2 AB － 8 大孔吸附树脂纯化苦荞黄酮提取物
样品
将处理好的 AB － 8 树脂湿法装柱，分别将
5 mg /mL苦荞黄酮提取物 1、2 号样液上柱，静态吸附
3 h，蒸馏水洗除水溶性杂质，至洗脱曲线吸光度降至
0． 10左右，再用 60%乙醇洗脱，自动部分收集器定时
收集洗脱液，每 2 min 收集 1 管，连接紫外检测器进
行检测，以洗脱时间为横坐标，流出液吸光度 A 为纵
坐标作图，即为 AB －8 洗脱曲线。依照变化曲线，合
并洗脱液，蒸发浓缩，冷冻干燥后 4 ℃保存，即为纯
化后苦荞黄酮样品。
苦荞黄酮提取物 1 的样液在 339 nm波长处有最
大吸收，与纯品芦丁的文献报道基本一致［5］，故紫外
检测器的波长选择了 340 nm的滤光片。
1． 3． 3 纯化后苦荞黄酮的定性分析
利用三氯化铝显色反应，取柱层析纯化后的样
品用毛细管点于滤纸上，干燥后喷雾 1%三氯化铝乙
醇溶液，置紫外光下观察滤纸，若出现亮黄色荧光，
说明样品中含有黄酮类化合物［6］。
1． 3． 4 薄层层析分析纯化后苦荞黄酮的成分组成
在距薄层板底边约 1． 5 cm 处，取甲醇溶解的样
品液、芦丁、槲皮素标准品，用毛细管点样于活化好
的硅胶板上，点间相互间隔 1 cm，将薄层板置于装有
展开剂甲醇 －氯仿 －乙酸乙酯 －乙酸(5 ∶ 4． 5 ∶ 1 ∶ 1，
体积比)的层析缸中［7］，上行法进行展开，当展层剂
前沿距薄层上方 1 cm 处，取出玻璃板，60 ℃烘箱中
烘干。用 1%三氯化铝乙醇溶液均匀喷在薄层板上，
溶剂挥发后，将薄板置于 60 ～ 80 ℃烘箱中显色 5 ～
10 min，并于日光和紫外光下观察，并计算 Ｒ f 值。
Ｒ f =
原点到斑点中心的距离
原点到溶剂前沿的距离
(2)
1． 3． 5 苦荞黄酮的体外抗氧化能力评价
1． 3． 5． 1 测定纯化后苦荞黄酮清除超氧阴离子的
能力
取 4． 5 mL 0． 05 mol /L，pH =8． 2 的 Tris － HCl缓
冲液于干燥具塞比色管中，置 25 ℃水浴中预热 20
min，分别加入不同浓度的维生素 C 和苦荞黄酮的乙
醇溶液各 2 mL，加入 0． 4 mL邻苯三酚，混匀后，在 25
℃水浴中准确反应 4 min，立即加入 2 滴 HCl 终止反
应，在 320 nm处测定吸光度 A［8］。清除效果以半数
清除率浓度(IC50)来表示，即 50%的超氧阴离子自
由基被清除时所需的样品浓度。
O2
－·清除率 = 1 －
A样品 － A样品空白
A( )空白 × 100% (3)
式中:A空白为空白对照吸光度;A样品为加入样品
溶液后的吸光度;A样品空白为本底吸光度。
1． 3． 5． 2 苦荞黄酮清除 DPPH·能力的测定
将苦荞黄酮各样品及芦丁、槲皮素配制成
1 mg /mL的样品溶液，对半稀释 6 个浓度，从上述溶
液中分别吸取 10 μL，加到 96 孔板中，再加入 150 μL
的 DPPH·溶液，轻拍孔板侧壁使其混合均匀，每个
浓度三组平行，避光反应 40 min，用酶标仪在 490 nm
处检测吸光度［9］，以乙醇作为空白对照。对 DPPH
自由基清除率的计算公式为:
DPPH自由基清除率 = 1 －
Ai － Aj
AO
× 100% (4)
式中:A0 为蒸馏水与 DPPH·溶液的吸光度;Ai
为样品与 DPPH 溶液的吸光度;Aj 为样品与乙醇的
吸光度。
1． 4 数据处理
数据均以平均值 ±标准差(Mean ± SD)表示，组
间显著性比较采用 SPSS 11． 5 数据处理软件进行。
2 结果与分析
2． 1 苦荞黄酮样品中黄酮含量的测定
按照 1． 3． 1 测定方法，测得纯化前各样液黄酮
含量，见表 1。
表 1 苦荞黄酮提取物样品的黄酮含量
样品 黄酮含量 /%
苦荞黄酮提取物 1 6． 58 ± 0． 02
苦荞黄酮提取物 2 78． 42 ± 0． 08
苦荞黄酮提取物 3 26． 26 ± 0． 04
在上述纯化工艺条件下，苦荞黄酮提取物 2 纯
化后黄酮类化合物含量达到 98． 73%，纯度是原来的
1． 26 倍。
2． 2 纯化后苦荞黄酮的成分鉴定
纯化后的苦荞黄酮经三氯化铝显色检验反应，
均可在紫外光下观察到亮黄色荧光，说明大孔树脂
42
第 29 卷第 8 期 尤玲玲等 苦荞黄酮的纯化及抗氧化活性的研究
纯化后的样品的确是黄酮类化合物。
然后，将苦荞黄酮和对照品(芦丁和槲皮素)的
甲醇溶液点样于薄层板上，在展开剂甲醇 －氯仿 －
乙酸乙酯 －乙酸(5∶ 4． 5∶ 1∶ 1，体积比)中展开，喷 1%
三氯化铝溶液显色，薄层色谱图如图 1 和图 2 所示:
注:a为苦荞黄酮提取物 1，b为槲皮素标准品，c为苦荞黄酮提
取物 3，d为芦丁标准品。
图 1 苦荞黄酮提取物 1 和 3 薄层层析图对比
由图 1 可知:苦荞黄酮提取物 1 只含有 1 种组
分，其 Ｒ f 值 0． 921 与标样槲皮素的 0． 923 接近，说明
苦荞提取物 1 中的黄酮类化合物主要是槲皮素。C
点苦荞黄酮提取物 3 含有 2 种组分，Ｒ f 值分别为
0． 813和 0． 932，这说明苦荞黄酮提取物 3 中含有芦
丁和槲皮素。
注:a为苦荞黄酮提取物 2，b为芦丁标准品，c 为苦荞黄酮提取
物 2 纯化后的样品，d为槲皮素标准品。
图 2 纯化前后苦荞黄酮提取物 2 的薄层层析图
由图 2 知:苦荞黄酮提取物 2 含有 2 种组分，其
Ｒ f 值与标样的芦丁(Ｒ f = 0． 810)和槲皮素 Ｒ f 值接
近，分别为 0． 813、0． 931，这说明苦荞黄酮提取物 2
中含有芦丁和槲皮素。而纯化后样品 Ｒ f 值为0． 811，
与标样的芦丁 Ｒ f 值相接近，可见苦荞黄酮提取物 2
的纯化产物中含有芦丁。
2． 3 苦荞黄酮抗氧化活性的测定
2． 3． 1 对超氧阴离子清除作用
选择不同浓度梯度的苦荞黄酮提取物 2、苦荞黄
酮提取物 2 的纯化产物、苦荞黄酮提取物 3 和维生素
C溶液进行对比，结果见图 3。
从图 3 中可以看出，苦荞黄酮提取物 2、苦荞黄
图 3 各样品对 O2
－·清除效果的 IC50
酮提取物 2 的纯化产物、苦荞黄酮提取物 3 和维生素
C溶液的 IC50分别是 0． 099、0． 123、0． 176、0． 071
mg /mL。清除超氧阴离子自由基的能力:维生素 C ＞
苦荞黄酮提取物 2 ＞ 苦荞黄酮提取物 2 的纯化产
物 ＞苦荞黄酮提取物 3。
2． 3． 2 对 DPPH·的清除作用
苦荞黄酮提取物 2 经过大孔树脂纯化后纯度有
了显著的提高，首先就比较了其与维生素 C 和芦丁
对 DPPH·的清除效果，结果见图 4。
图 4 不同样品对 DPPH·的清除能力
由图 4 知:苦荞黄酮提取物 2、苦荞黄酮提取物 2
的纯化产物、芦丁和维生素 C对 DPPH·均有明显的
清除作用，对 DPPH·的清除能力在一定范围内随着
反应体系溶液浓度的增大而逐渐增强，并呈现一定
旳量效关系，当达到一定浓度时清除率增加趋于平
稳。在 0 ～ 0． 25 mg /mL 浓度范围内，各样品的 IC50
排序为:苦荞黄酮提取物 2 纯化产物 ＜芦丁 ＜苦荞
黄酮提取物 2 ＜维生素 C，说明在此浓度范围内苦荞
黄酮提取物 2 的纯化产物清除自由基的能力高于芦
丁、苦荞黄酮提取物 2 和维生素 C，但从图 4 中也可
以看出当样品浓度达到 0． 5 mg /mL 时，维生素 C 和
苦荞黄酮提取物 2 清除自由基能力明显升高。从相
同浓度的抗氧化活性物质清除 DPPH·及不同浓度
清除 DPPH·的变化规律来看，苦荞黄酮提取物 2 的
52
中国粮油学报 2014 年第 8 期
纯化产物清除 DPPH·的能力及变化规律和芦丁基
本相同，从而可以推测纯化后苦荞黄酮中的主要成
分是芦丁，这也与薄层层析得出的结论一致。但除
芦丁外，还可能含有少量其他的抗氧化活性较高的
的芦丁类似物，这才使得其清除 DPPH·的能力稍大
于芦丁。
试验中不仅测定了上述样品对 DPPH·的清除
能力，还比较了苦荞黄酮提取物 1、苦荞黄酮提取
物 3 和槲皮素对 DPPH·的清除能力，测定结果见
表 2。
表 2 各样品清除 DPPH·的 IC50值比较
样品 线性回归方程 决定系数 Ｒ2 IC50 /mg /mL
苦荞黄酮提取物 1 y = 0． 009 1x － 0． 080 3 0． 986 8 63． 769 ± 0． 051
苦荞黄酮提取物 2 y = 1． 921 2x － 0． 025 2 0． 999 7 0． 273 ± 0． 036
苦荞黄酮提取物
2 纯化后样品
y = 2． 692 0x + 0． 000 8 0． 993 6 0． 185 ± 0． 008＊＊
苦荞黄酮提取物 3 y = 0． 906 6x + 0． 085 3 0． 999 3 0． 457 ± 0． 010
维生素 C y =1． 733 8x － 0． 022 3 0． 993 0 0． 301 ± 0． 001
芦丁标准品 y = 2． 781 2x － 0． 030 9 0． 991 9 0． 191 ± 0． 006
槲皮素标准品 y = 4． 833 9x + 0． 007 3 0． 998 9 0． 102 ± 0． 012
＊＊表示苦荞黄酮提取物 2 纯化后样品与苦荞黄酮提取物 2 的
差异性达到极显著水平(P ＜ 0． 01)。
IC50越小说明清除 DPPH·能力越强，由表 2 可
知:清除 DPPH·能力由强到弱顺序为:槲皮素 ＞苦
荞黄酮提取物 2 的纯化产物 ＞芦丁 ＞苦荞黄酮提取
物 2 ＞维生素 C ＞苦荞黄酮提取物 3 ＞苦荞黄酮提取
物 1，经过 AB － 8 纯化后的苦荞黄酮清除 DPPH·的
能力明显上升。
3 讨论
3． 1 体外抗氧化能力评价时自由基的选择
自由基是癌变、衰老、心血管疾病的罪恶之源。
生物体内常见的自由基有超氧阴离子自由基(O2
－·)、
羟自由基(·OH)、烷氧基自由基(ＲO·)等，其产生
过程为:
O2
－·形成最早，·OH 作用最强，ＲOOH 连锁反应
循环最持久，一旦清除了 O2
－·，·OH 的形成即中断，
则可从根本上预防体内形成过多的·OH 和其他活
性氧自由基，达到防衰、抗癌、抗心血管病的目的［10］。
苦荞黄酮对 O2
－·清除能力可以进一步说明其阻断·
OH的能力。
3． 2 苦荞黄酮抗氧化作用的机制探讨
芦丁清除 DPPH·的能力明显低于槲皮素，芦丁
和槲皮素的结构中都有 B 环的 31、41 位的邻位二羟
基(图 5) ，结构差异只是芦丁的 3 位是芸香糖而不是
羟基，因而槲皮素的清除能力表现得更强［11］。这可
能是由于芦丁中糖基的增加增强了空间位阻效应，
图 5 黄酮母核、槲皮素及芦丁结构式
使得其无法与活泼 DPPH·接近［12］。苦荞黄酮提取
物 2 和苦荞黄酮提取物 2 的纯化产物对 O2
－·和
DPPH·2 种自由基均有明显的清除作用，但也存在
着一定差别。整体而言，无论样品纯化与否，可知苦
荞黄酮对 2 种自由基的抑制能力为 O2
－· ＞ DPPH·。
苦荞黄酮提取物 2 纯化后 O2
－·的清除能力反而降低
了，这可能是由于纯化前样品中不仅含有芦丁，还有
抗氧化能力更高的物质槲皮素，还可能是槲皮素与
芦丁的相互作用对 O2
－·的清除效果起到协同增效的
作用。
4 结论
使用 AB －8 树脂对苦荞黄酮提取物样品进行纯
化，工艺参数为上样液浓度 5 mg /mL，上样流速
1 mL /min，60%乙醇洗脱，洗脱流速1 mL /min时，可以
有效提高苦荞黄酮提取物 2 中总黄酮的质量分数，由
78． 42%可提高到 98． 73%;经薄层层析分析得出，苦荞
黄酮提取物 2的主要成分由最初的芦丁和槲皮素到最
终几乎只含有芦丁;对 O2
－·的清除能力不如纯化前效
62
第 29 卷第 8 期 尤玲玲等 苦荞黄酮的纯化及抗氧化活性的研究
果好，而对 DPPH·的清除能力有了极显著(P ＜
0． 01)的提高，甚至超过了维生素 C的清除能力。
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Purification and Antioxidant Activity of
Flavonoids in Tartary Buckwheat
You Lingling1，2 Liu Huanhuan1 Li Xiaoyan1 Zhang Pingping1 Liu Jinfu1，2
(Department of Food Science，Tianjin Agricultural University1，Tianjin 300384)
(Tianjin Engineering and Technology Ｒesearch Center of Agricultural Products Processing2，Tianjin 300384)
Abstract The flavonoids samples from tartary buckwheat have been purified by AB －8 macroporous resin． The
components were identified by TLC compared with rutin and quercetin． By adopting superoxide and DPPH radical
systems;vitamin C was taken to be the standard，and then the antioxidant activities of tartary buckwheat total fla-
vonoid have been studied． The results showed that after purified by AB － 8 macroporous resin，the total flavonoid
content of sample 2 had increased from 78． 42% to 98． 73% ． The purified flavonoids’IC50 value of scavenging O2
－·
increased from 0． 099 mg /mL to 0． 123 mg /mL，while the scavenging ability decreased． After being purified，the
IC50 value of scavenging DPPH free radicals decreased from 0． 273 mg /mL to 0． 185 mg /mL，and the scavenging abil-
ity was increased．
Key words tartary buckwheat，flavonoids，purification，TLC，antioxidant activity
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