全 文 ：77※基础研究 食品科学 2011, Vol. 32, No. 23
苦荞水溶性蛋白体外吸附胆酸盐能力的研究
周小理，黄 琳，周一鸣
(上海应用技术学院香料香精技术与工程学院，上海 200235)
摘 要：通过采用硫酸铵盐析法、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析法提取分离制备苦荞水溶性蛋白，并通
过磷酸盐缓冲液 pH值、动态层析流速的最佳选择改善分离提纯效果。同时通过体外吸附胆酸盐能力的测定证实所
提取分离得到的苦荞水溶性蛋白具有一定的降血脂功能。结果发现：当磷酸盐缓冲溶液 pH值为 6.5、流速 1.0mL/min
于室温下洗脱的效果最好，得到的 3个主要分离组分中峰 3的体外吸附胆酸盐能力最佳。
关键词：苦荞水溶性蛋白；硫酸铵盐析；DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析；体外吸附胆酸盐；降血脂
in vitro Binding of Bile Salts by Water-soluble Proteins from Tartary Buckwheat Grains
ZHOU Xiao-li，HUANG Lin，ZHOU Yi-ming
(School of Perfume and Aroma Technology, Shanghai Institute of Technology, Shanghai 200235, China)
Abstract ：Water-soluble proteins were extracted from tartary buckwheat grains by salting out with ammonium sulfate and purified
by DEAE-Sepharose Fast Flow chromatography. Optimal conditions for the salting out and DEAE-Sepharose Fast Flow chromato-
graphic separation of water-soluble proteins were determined. The results of experiments on bile salt adsorption in vitro demonstrated
that the obtained water-soluble proteins had hypolipidemic effect. Besides, the best results of the elution of water-soluble proteins from
DEAE-Sepharose Fast Flow column were achieved using pH 6.5, 10 mmol/L phosphate buffer as eluent at a flow rate of 1.0 mL/min and
room temperature. Peak 3 was shown to have the best bile salt adsorption ability among three separation peaks obtained.
Key words：buckwheat water-soluble protein；ammonium sulfate salting-out；DEAE-Sepharose Fast Flow
chromatography；in vitro bile salt adsorption；lowing blood plasma
中图分类号：TS201.4 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2011)23-0077-05
收稿日期：2011-04-01
基金项目：国家自然科学基金项目(31071527)
作者简介：周小理(1957—)，女，教授，本科，研究方向为食品新资源的深度开发与利用。E-mail：zhouxl@sit.edu.cn
荞麦起源于中国和亚洲北部，主要的栽培品种有苦
荞(Fagopyrum tartaricum Gaertn.)和甜荞(Fagopyrum
esculentum Moench.)。苦荞含有蛋白质、淀粉、脂肪、
粗纤维、维生素、矿物质元素等 [ 1 ]多种营养成分，其
中苦荞蛋白约占 15%～17%左右[2]，具有降胆固醇[3]、降
血脂[4 ]、抗氧化[5 ]、抗癌[6 -7 ]、增强人体免疫力等作用，
是苦荞主要的生物活性物质之一。目前国内外关于苦荞
蛋白生理功能的研究主要基于苦荞蛋白的粗提物，而对
于苦荞蛋白中具有生理功能活性的功能因子研究甚少。
因此探索研究一种实用、高效的苦荞蛋白提取分离、纯
化方法对研究苦荞蛋白功能因子的生理活性尤为重要。
胆酸盐是胆固醇分解后的产物，通过吸附胆酸盐并
将其排出体外可有效降低胆酸盐在肝肠循环过程中的积
累，从而促进胆固醇的代谢，最终达到降低体内胆固
醇的效果。胡国华等[8]、Hu等[9]通过体外吸附胆酸盐实
验证实膳食纤维降低胆固醇的机理与吸附胆酸盐并将其
排出体外有关。此外Yoshie-Stark等[10]、Kahlon等[11]发
现一些植物蛋白提取物也具有吸附胆酸盐的能力。
Kayashita等[12]通过动物实验发现荞麦蛋白提取物能增加
小鼠排泄物中中性甾醇的含量，认为荞麦蛋白降低胆固
醇的机理可能与膳食纤维类似，但 Kayashita并未对这
一结论进行进一步的实验论证，因此对荞麦蛋白降低胆
固醇的机理尚缺乏足够的说服力。
本研究采用硫酸铵盐析法、DEAE-Sepharose Fast
Flow离子交换介质对苦荞水溶性蛋白进行提取、分离及
纯化，同时分别从磷酸盐缓冲液的 pH 值、流速等因素
观察DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换对苦荞水溶性
蛋白分离纯化的影响，并最终确定 DEAE离子交换操作
的最优条件，实现目标蛋白的分离纯化，为苦荞蛋白
功能因子的分离及相关生理活性的研究奠定基础。同时
通过体外吸附胆酸盐能力的研究，探讨苦荞水溶性蛋白
中具有降血脂功能的组分及其作用机理，以期为苦荞蛋
白降血脂功能的研究提供理论依据。
2011, Vol. 32, No. 23 食品科学 ※基础研究78
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
苦荞 山西黑丰一号。
硫酸铵、磷酸二氢钠、十二水合磷酸氢二钠、胆
酸钠、硫酸、糠醛 国药集团化学试剂有限公司；
DEAE琼脂糖凝胶 FF 上海宝曼生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
HL-2 恒流泵、BSZ-100自动部分收集器、层析柱
(1.6cm× 50cm) 上海沪西分析仪器厂；754紫外 -可见
分光光度仪 上海菁华科技仪器有限公司；离心机 上
海安亭科学仪器厂；真空冷冻干燥机 江苏海门轻工机
械四厂。
1.3 苦荞蛋白的分离纯化
1.3.1 苦荞水溶性蛋白的提取[13]
苦荞籽粒经干燥后粉碎至 2 0 0 目，先经石油醚脱
脂。再将脱脂后的苦荞粉采用 pH7.0磷酸盐缓冲液(料水
比为 1:10(m/V))在 20℃条件下搅拌提取 2h，并经 4℃、
5000r/min离心 30min后收集上清液。
1.3.2 硫酸铵盐析饱和度的确定[14]
取 9个烧杯各装入 20mL上述苦荞蛋白提取液，分
别加入一定量的固体硫酸铵，使苦荞蛋白提取液中硫酸
铵饱和度达到 20%、30%、40%、50%、60%、70%、
80%、90%、100%，充分溶解后20℃条件下搅拌 1h，4℃、
5000r/min离心 30min后收集沉淀。沉淀用 20mL水复溶，
得到苦荞水溶蛋白溶液，采用考马斯亮蓝法测定其蛋白
含量。
1.3.3 DEAE-Sepharose Fast Flow静态吸附苦荞水溶性
蛋白
1.3.3.1 静态吸附方法[15]
取 50mL烧杯，分别加入一定量的DEAE-Sepharose
Fast Flow介质和一定体积的磷酸盐缓冲溶液，充分搅拌平
衡后静置 15min，吸去上清液，重复 3次。向层析介质中
再加入相同体积的磷酸盐缓冲液待平衡后，加入一定体
积的苦荞水溶蛋白溶液，充分搅拌吸附后，静置
30min，用考马斯亮蓝法测定上清液中的蛋白含量。

(ρ0－ρ1)×V
吸附量/(mg/g)＝———————— (1)

m
ρ0－ρ1
吸附率/%＝—————×100 (2)

ρ0
式中：ρ0为吸附液的初始质量浓度 /(mg/mL)；ρ1
为吸附平衡后吸附液中的平衡质量浓度 /(mg/mL)；V为
吸附液体积/ mL；m 为介质质量/ g。
1.3.3.2 静态吸附最适 pH值的确定
分别选取 pH 值为 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 的磷
酸盐缓冲溶液，采取与静态吸附相同的操作，与一定
量的DEAE-Sepharose Fast Flow介质充分搅拌平衡后，
加入一定体积的苦荞水溶蛋白溶液，充分搅拌吸附后，
静置 30min，测定上清液中的蛋白含量，比较不同 pH
值对介质吸附蛋白的影响。
1.3.3.3 静态吸附最适温度的确定
采取与静态吸附相同的操作，将反应体系分别置于
10、20、30、40℃条件下，静置 30min 后，测定上清
液中的蛋白含量，比较不同温度对介质吸附蛋白的影响。
1.3.3.4 吸附速率和吸附动力学曲线的测定
采取与静态吸附相同的操作，吸附过程中每间隔一
定时间测一次上清液中的蛋白含量，作时间与吸附液质
量浓度的 t -ρ关系曲线，比较在相同条件下吸附时间对
吸附蛋白的影响。
1.3.4 DEAE-Sepharose Fast Flow动态离子交换层析对
苦荞水溶性蛋白分离纯化的研究[16-18]
取一定量DEAE-Sepharose Fast Flow介质装于层析
柱，填料高度约为 45cm。经缓冲液充分平衡后，取适
量苦荞水溶性蛋白液上柱，用不同浓度洗脱液(NaCl＋
缓冲溶液)以一定的流速进行洗脱，紫外检测仪于 280nm
波长处测定，收集洗脱液组分。分别观察不同 pH 值及
流速对动态洗脱的影响。
1.4 苦荞水溶性蛋白纯化物对胆酸盐吸附作用的测定
1.4.1 胆酸盐的测定[19]
胆酸盐标准液：分别准确称取胆酸盐 0、20、40、
60、80、100、200、400mg 各置于 50mL 容量瓶中，
均以蒸馏水溶解并加至刻度。
移取样液(或各不同质量浓度的胆酸盐标准液)1mL
于具塞试管中，加入 6mL 45%硫酸，混匀，加入 1mL
0.3%糠醛，混匀，置 65℃恒温水浴中反应 30min，冷却
至室温后，于 620nm波长处测吸光度，绘制标准曲线。
1.4.2 苦荞水溶性蛋白纯化物对胆酸盐吸附作用的测定
分别配制 4mg/mL胆酸钠、脱氧胆酸钠、牛磺胆酸
钠溶液，加入苦荞水溶性蛋白纯化物，于 3 7℃恒温下
反应 1h后，5000r/min离心分离 10min。准确移取 1mL
上清液，于 620 nm 波长处测吸光度，由标准曲线确定
其胆酸盐的质量浓度。再根据反应前后溶液中胆酸盐的
浓度差计算苦荞水溶性蛋白纯化物对胆酸盐的吸附量。
2 结果与分析
2.1 硫酸铵盐析饱和度的确定
79※基础研究 食品科学 2011, Vol. 32, No. 23
图 1 苦荞水溶性蛋白硫酸铵盐析曲线
Fig.1 Ammonium sulfate precipitation curve of tartary buckwheat
water-soluble proteins
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
蛋
白
提
取
率
/%
硫酸铵饱和度/%
20 30 40 50 60 70 80 90 100
通过不同硫酸铵饱和度盐析苦荞水溶性蛋白沉淀物
中的蛋白，结果如图 1 所示。随着硫酸铵饱和度的增
加，沉淀物中的蛋白回收率逐渐上升；当硫酸铵饱和度
高于 40%时，沉淀物中的蛋白回收率呈大幅增加趋势，
当增加到 80% 时，蛋白回收率近 95%，且随着硫酸铵
饱和度升高，回收率无太大变化。因此可选择硫酸铵
饱和度 40%初沉去除杂蛋白，饱和度 80%进行二次沉淀
获得目标蛋白。将二次盐析所得到目标蛋白溶解于适量
的蒸馏水中，过夜透析脱盐平衡，冻干成粉待测。
2.2 DEAE-Sepharose Fast Flow静态吸附水溶性蛋白
2.2.1 静态吸附最适 pH值的确定
0.175
0.170
0.165
0.160
0.155
0.150
0.145
0.140
0.135
0.130
吸
附
量
/(
m
g/
g)
pH
5.0 6.0 7.0 8.0 9.0
吸附量
吸附率
90
85
80
75
70
65
吸
附
率
/%
图 2 不同 pH值对 DEAE-Sepharose Fast Flow静态吸附的影响
Fig.2 Static adsorption curves of tartary buckwheat water-soluble
proteins on DEAE-Sepharose fast flow under different pH conditions
由图 2可知，当 pH值为 7.0时介质对蛋白的吸附率
达到最高为 86.64%，此后吸附率呈下降趋势。因此可
以确定DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析缓冲液
体系的最适 pH 值为 7.0。
2.2.2 静态吸附最适温度的确定
0.158
0.156
0.154
0.152
0.150
0.148
0.146
0.144
0.142
0.140
0.138
0.136
吸
附
量
/(
m
g/
g)
温度 /℃
10 20 30 40
吸附量
吸附率
80
78
76
74
72
70
68
吸
附
率
/%
图 3 不同温度对 DEAE-Sepharose Fast Flow静态吸附的影响
Fig.3 Static adsorption curves of tartary buckwheat water-soluble proteins
on DEAE-Sepharose fast flow under different temperature conditions
由图 3 可知，当温度为 30℃时，介质对蛋白的吸
附率为 78.61%。因此可以确定 DEAE-Sepharose Fast
Flow吸附蛋白的最适温度在 30℃。
2.2.3 吸附速率和吸附动力学曲线的测定
100
80
60
40
20
0
吸
附
率
/%
时间 /min
0 15 30 45 60 75 90 105 120
图 4 DEAE-Sepharose Fast Flow吸附速率
Fig.4 Time course of adsorption of tartary buckwheat water-soluble
protein on DEAE-Sepharose fast flow
800
700
600
500
400
300
200
100
0
t/
Q
t/(
m
in
·
g/
m
g)
时间 /min
0 25 50 75 90 105 120
y=60.7088x+27.156
R2=0.9955
图 5 DEAE-Sepharose Fast Flow对水溶性蛋白的吸附动力学曲线
Fig.5 Adsorption kinetic curve of tartary buckwheat water-soluble
protein on DEAE-Sepharose fast flow
通过测定不同吸附时间吸附液中的蛋白质量浓度，
研究DEAE-Sepharose Fast Flow对水溶性蛋白的吸附能
力，结果如图 4、5 所示。随着吸附时间的延长，介
质对水溶性蛋白的吸附率逐渐增大。吸附过程中最初的
吸附速率较快，前 15min内吸附率近 70%，随着吸附反
应的进行，吸附速率逐渐趋向于平衡，图 5实验数据与
方程吻合较好。因此DEAE-Sepharose Fast Flow对水溶
性蛋白的吸附基本符合吸附动力学行为。
2.3 DEAE-Sepharose Fast Flow动态离子交换层析对水
溶性蛋白分离纯化的研究
2.3.1 缓冲液 pH值对水溶性蛋白分离纯化的影响
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
pH6.5
pH7.5
pH7.0
NaCl浓度
管数
1 7 10 16 22 25 28 34 40 46 52 58 64 70 76
A
28
0n
m
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
N
aC
l 浓
度
/(m
ol/L
)1
2
3
图 6 缓冲液 pH 值对离子交换的影响
Fig.6 Effect of phosphate buffer pH on the elution of tartary
buckwheat water-soluble protein
2011, Vol. 32, No. 23 食品科学 ※基础研究80
在 pH值对DEAE-Sepharose Fast Flow静态吸附水溶
性蛋白的影响实验结果基础上，研究了DEAE-Sepharose
Fast Flow在不同 pH值(6.5、7.0、7.5)条件下对动态层析
的影响，结果如图 6 所示。3 种 p H 值的缓冲液均能得
到 3个主要分离峰。其中 pH值为 6.5时，出现的峰峰形
较好，无拖尾现象，表明洗脱完全，且峰 3 响应值最
高，蛋白含量最高；当 pH 值为 7 . 0 时杂峰较多，洗脱
不完全，使得峰 3 的峰面积较小，蛋白含量降低；当
pH值为 7.5时其中峰 1、峰 2不能完全洗脱，峰形较宽。
因此可知 pH值为 6.5的缓冲液洗脱效果最好，能将 3个
峰较好地洗脱下来，有助于进一步的分离及性质研究。
因此选取 pH6.5的缓冲溶液体系进行洗脱。
2.3.2 流速对水溶性蛋白分离纯化的影响
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
A
28
0n
m
管数
1 7 13 19 25 31 40 46 52 58 64
流速 1.0mL/min
流速 2.0mL/min
NaCl浓度
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
1
2
3
N
aC
l 浓
度
/(m
ol/L
)
图 7 不同流速对离子交换的影响
Fig.7 Effect of eluent flow rate on the elution of tartary buckwheat
water-soluble protein
不同流速(1.0、2.0mL/min)对分离水溶性蛋白的影
响，如图 7所示。当流速为 2.0mL/min时，出峰时间早
于流速为 1.0mL/min，但由于流速加快使得蛋白无法完全洗
脱，因此峰 2过宽，基线不平，与流速为 1.0mL/min层
析图谱相比，分离效果下降。因此选取流速为 1.0mL/min
进行洗脱分离。
2.4 苦荞水溶性蛋白纯化物对胆酸钠吸附作用的测定
胆酸和脱氧胆酸分别约占人体总胆酸的 30%和 20%[20]，
且胆汁酸在人体内一般以钠盐的形式存在，其中牛磺胆
酸钠又是一类较难被吸附的结合型胆酸盐，因此实验选
择胆酸钠、脱氧胆酸钠和牛磺胆酸钠作为吸附对象具有
代表性。
胆酸盐
苦荞水溶性蛋白纯化物胆酸盐吸附率 /%
峰 1 峰 2 峰 3
胆酸钠 9.79± 0.0113 88.93± 0.0035 93.82± 0.0049
牛磺胆酸钠 12.6± 0.0123 50.03± 0.0106 54.89± 0.0078
脱氧胆酸钠 19.68± 0.0141 70.21± 0.0191 95.38± 0.0028
表 1 苦荞水溶性蛋白纯化物对胆酸盐的吸附能力
Table 1 Bile salt adsorption ability of three eluates
由表 1 可知，苦荞水溶性蛋白纯化物对所选择的 3
类代表性胆酸盐具有吸附作用，其中峰 3的吸附能力大
于另外两个峰，对胆酸钠和脱氧胆酸钠的吸附率均达到
90%以上，对较难被吸附的牛磺胆酸钠的吸附率也高于
50%。因此可初步确定峰 3中具有较强降血脂作用的功
能因子。
3 结 论
苦荞水溶性蛋白是苦荞生物活性物质之一，本研究
以DEAE-Sepharose Fast Flow作为分离介质，以静态吸
附和动态吸附相结合的方法，优选出 DEAE-Sepharose
Fast Flow分离纯化苦荞水溶性蛋白的最佳操作方法和
参数，即：以 10mmol/L、pH6.5 的磷酸盐缓冲体系，
0.2mol/L和 0.5mol/L NaCl磷酸盐作为洗脱液，流速为
1.0mL/min，于室温下进行洗脱，收集主要分离峰。获
得了具有较强降血脂生理功能的苦荞水溶性蛋白组分。
实验以胆酸钠、脱氧胆酸钠和牛磺胆酸钠作为吸附
对象，证实了苦荞水溶性蛋白纯化物的降血脂能力，揭
示了荞麦蛋白通过吸附胆酸盐，抑制其在肠道的吸收并
将其排出体外，从而促进胆固醇在体内代谢转化成胆汁
酸的降血脂机理。为进一步深入研究苦荞水溶性蛋白的
结构、表征和营养功能提供了理论依据。
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