全 文 ：河朔荛花农药生物活性初探
杨华 ,田锐 ,陈宏力　(延安大学化工学院 ,陕西延安 716000)
摘要　[目的]对河朔荛花进行杀虫、抑菌生物活性筛选 ,并对其活性成分进行分离提纯。[方法]用石油醚、乙酸乙酯、甲醇对河朔荛花
进行超声波提取 ,进行粘虫 、蚜虫的杀虫生物活性测定 ,以及对苹果炭疽病菌、西瓜枯萎病菌、马铃薯干腐病菌、小麦赤霉病菌及番茄早
疫病菌的抑菌活性测定。并采用活性追踪法 ,应用常压柱层析法结合重结晶、TLC等技术 ,对河朔荛花石油醚浸膏中活性成分进行了分
离。[结果]在浓度为 500 mg/L时 ,河朔荛花 3种提取物对 5种供试菌种均没有明显的抑菌活性;在浓度为 5%时石油醚提取物对蚜虫具
有一定的触杀活性;乙酸乙酯提取物对 3龄粘虫具有一定的拒食活性;对石油醚提取物通过柱层析分离 ,得馏分 F4对蚜虫的触杀活性
最高 ,其致死率达 60.00%。[ 结论]河朔荛花所含的杀虫活性成分较多 ,其活性部分及作用机理值得进一步研究。
关键词　河朔荛花;杀虫活性;活性成分分离
中图分类号　S 482　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2009)01-00220-02
Preliminary Study on Biological Activity of Wikstroemia chamaedaphne Meissn.
YANG Hua et al　(College of Chemistry and Chemical Engineering , Yanan University, Yanan , Shaanxi 716000)
Abstract 　[Objective] The insecticidal activity and antibacterial bioactivity of Wikstroemia chamaedaphne Meissn.were screened and bioactive sub-
stances in it were separated and purified.[ Method] The Wikstroemia chamaedaphneMeissn.was conducted ultrasonic extraction in petroleum ether, ethyl
acetate and methanol and the insecticidal activity of Wikstroemia chamaedaphne Meissn.to armyworm and aphid.The antibacterial activity of Wikstroemia
chamaedaphne Meissn.to Fusarium graminearu , Glomerella cingulata , F.oxysporium f.sp niveum , Alternaria solani and Fusarium oxysporium were al-
so determined.The bioactivity-guided methods such as opencolumn chromatography and Pre-HPLC method were used to separate active components in
petroleum ether extract of Wikstroemia chamaedaphne Meissn..[ Result] When the concentration was 500 mg/L, 3 kinds of extracts of Wikstroemia
chamaedaphne Meissn.didn t show obvious bacteriostasis to 5 kinds of experimental strains.When the concentration was 5%, petroleum ether extract
show certain contact toxicity to aphids.The ethyl acetate extract showed certain antifeedant activity to 3-years old Mythimna separata Walker.The fraction
F4 of petroleum ether extract possessed highest contact toxicity to aphids and the lethality was 60.00%.[ Conclusion] Wikstroemia chamaedaphne Meissn.
contained many insecticidal constituents whose active parts and mechanism needed were needed further researches.
Key words　 Wikstroemia chamaedaphne Meissn.;Insecticidal activity;Separation of active components
基金项目　延安大学校级项目(YD2005-042)。
作者简介　杨华(1979-),女 ,陕西延安人 ,硕士 ,讲师 ,从事天然产物
的研究。
收稿日期　2008-10-20
　　河朔荛花(Wikstroemia chamaedaphne Meissn.)是瑞香科
(Thymelaeaceae)荛花属(Wikstroemia)的一种有毒植物 ,广泛分
布于我国河北 、山西 、河南 、陕西 、甘肃 、四川 、湖北等地[ 1] 。
长期以来 ,其一直作为传统的药材 ,可以治疗水肿胀满 、痰
饮 、急慢性肝炎 、精神分裂症 、癫痫和人工引产等[ 2-3] 。其作
为土农药使用的历史也很久远。然而 ,对其农药生物活性的
研究报道较少 ,目前只有赵莉蔺等对河朔荛花甲醇提取物对
山楂叶螨生物活性的影响进行了初步研究[ 4] 。为进一步探
讨河朔荛花作为一种植物源农药利用的可能性 ,笔者对其花
通过不同溶剂进行提取 ,进行杀虫 、抑菌生物活性筛选 ,并以
活性追踪为指导 ,对河朔荛花活性成分进行了分离提纯。
1　材料与方法
1.1　供试材料
1.1.1　植物。河朔荛花 2006年夏季采于延安大学文汇山。
取其花于阴凉处干燥 ,粉碎后备用。
1.1.2　昆虫。粘虫(Mythimna separata Walker)3龄幼虫 ,室内
人工饲养 ,由西北农林科技大学农药研究所提供 ,饲养条件
为(25±1)℃;蚜虫采于陕西延安苹果树上 。
1.1.3　病菌。小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、苹果炭
疽病菌(Glomerella cingulata)、西瓜枯萎病菌(F .oxysporium f.
sp niveum)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、马铃薯干腐病菌
(Fusarium oxysporium),均由西北农林科技大学农药研究所微
生物实验室提供。
1.1.4　试剂。甲醇 、丙酮 、氯仿 、乙酸乙酯 、石油醚等溶剂均
为分析纯 ,西安化学试剂厂生产。
1.2　方法
1.2.1　粗提物制备。取河朔荛花粗粉 500 g置于 1 000ml三
角瓶中 ,分别以 500 ml石油醚 、乙酸乙酯 、甲醇顺序超声波提
取。超声提取各 3次 ,每次 2 h ,过滤 ,滤液合并 ,减压回收溶
剂后 ,置通风橱挥干 ,得石油醚 、乙酸乙酯 、甲醇浸膏 。
1.2.2　杀虫活性测定。
1.2.2.1　粘虫胃毒活性测定。采用载毒叶片法[ 5-7] 测定 。
挑选刚蜕皮的粘虫 3龄幼虫 ,置于直径 6 cm的培养皿中 ,每
皿 1虫 ,饥饿 24 h。将供试样品以丙酮配成 5%(W/V)的溶
液 ,用 1 μl微量点滴器点 1μl于 0.5 cm×0.5 cm的小麦叶片
上 ,即成载毒叶片。每处理 30头试虫 ,每虫饲喂 1片载毒叶
片 ,于养虫室中饲养 ,同时设丙酮点滴叶片作对照 。24 h后
检查死亡情况 ,并利用式(1)计算死亡率。
死亡率(%)=死亡虫数总虫数 ×100 (1)
1.2.2.2　粘虫触杀活性测定。采用点滴法[ 5-7]测定。挑选
个体大小基本一致的粘虫 3龄幼虫 ,置于直径 6 cm的培养皿
中 ,每皿 1虫。将供试样品以丙酮配成 5%(W/V)的溶液 ,用
1μl微量点滴器点 1μl于 3龄粘虫幼虫的前胸背板。每处理
30头试虫 ,同样设丙酮点滴溶剂作对照 ,不定时观察试虫的
反应 ,24 h后检查死亡情况 ,并利用式(1)计算死亡率。
1.2.2.3　蚜虫触杀活性测定[ 5-7] 。用毛笔挑起大小一致的
蚜虫 ,将其背部粘在载玻片的双面胶上 ,每行粘 10头 ,粘 2 ～
3行 。将供试样品以丙酮配成 5%(W/V)的溶液 ,用微量进
样器(1μl)点 0.5μl于蚜虫的前胸背板 ,每处理 30个重复 ,设
丙酮处理作对照 。不定时观察蚜虫的反应 ,24 h后检查死亡
情况 ,并利用式(1)计算死亡率。
1.2.3　抑菌活性测定。采用抑制菌丝生长速率法[ 5-7]测定 。
将供试样品用 1 ml丙酮溶解 ,然后在无菌条件下用 PDA培
安徽农业科学 , Journal of Anhui Agri.Sci.2009 , 37(1):220-221 , 223　　　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　郑丹丹　责任校对　张士敏
养基稀释至一定浓度 ,倒入直径为 9 cm×9 cm的无菌玻璃培
养皿中。培养基凝固后 ,在每个培养基平面放入 1个供试菌
的菌饼(直径为 4 mm),使菌饼带菌丝的一面贴在培养基表
面 ,放置于 25 ℃培养箱中培养 ,72 h后用十字交叉法测定供
试菌菌落生长直径 ,并利用式(2)计算菌丝生长抑制率 。每个
处理重复 3次 ,以丙酮作为对照。
菌丝生长抑制率(%)=对照菌落直径-处理菌落直径对照菌落直径 ×100
(2)
1.2.4　活性成分的分离。采用活性追踪法 ,应用常压柱层
析对河朔荛花石油醚浸膏中活性成分进行初步分离。每次
均选取活性较高且样品量较大的馏分进行下一次分离 ,结合
重结晶 、TLC等技术 ,分离具有一定活性的化合物。
2　结果与分析
2.1　河朔荛花的生物活性
2.1.1　杀虫活性。河朔荛花石油醚 、乙酸乙酯 、甲醇提取物
对 3龄粘虫 、蚜虫的杀虫生物活性测定结果见表 1。由表 1
可知 ,河朔荛花 3种粗提物对粘虫 3龄幼虫没有明显的触杀
和胃毒活性 ,但粘虫对乙酸乙酯提取物的平均取食量最少 ,
说明乙酸乙酯提取物对粘虫有一定的拒食活性 ,在浓度为
5%时 ,其平均取食率为 10%。由表 1还可知 ,河朔荛花 3种
提取物对蚜虫有一定的触杀活性 ,其中石油醚提取物活性最
高 ,触杀率达到 43%,乙酸乙酯提取物活性次之 ,甲醇提取物
活性最低。
表 1　河朔荛花提取物对3龄粘虫、蚜虫的杀虫生物活性
Table 1　Insecticidal activities of the extracts from Wikstroemia chamaedaphne
Meissn.againstMythimna separata larvae and aphid %
供试样品
Samples
粘虫
Mythimna separata larvae
胃毒
Stomach
poison
平均取食量
Mean value
of feeding
触杀
Contact
poison
蚜虫
Aphid
平均取食量
Mean value
of feeding
触杀
Contact
poison
石油醚提取物 0 　　　85.5 0 100.0 　43
Extraction of
petroleum ether乙酸乙酯提取物 0 10.0 0 100.0 33
Extraction of ethyl
acetate甲醇提取物 0 75.8 0 100.0 20
Extractionof methanol
对照(CK) 0 100.0 0 100.0 0
　注:表中各馏分的浓度均为 5%(W/ V)。
　Note:Concentrations of all distillation cuts are 5%(W/ V)。
表2　河朔荛花 3种提取物对 5种病菌菌丝生长的抑制作用
Table 2 　 Inhibiting activities of the extracts from Wikstroemia
chamaedaphne Meissn.against five pathogens
供试样品
Sample
抑制率 Inhibiting rate∥%
西瓜枯
萎病菌
苹果炭
疽病菌
马铃薯干
腐病菌
番茄早
疫病菌
小麦赤
霉病菌
石油醚提取物 23.33 11.54 4.08 14.53 12.50
Extraction of
petroleum ether乙酸乙酯提取物 26.67 13.79 16.33 12.50 14.29
Extraction of ethyl
acetate甲醇提取物 46.67 17.24 10.20 14.53 14.29
Extractionof methanol　注:3种提取物浓度均为500 mg/ L。
　Note:Concentrations of 3 extracts are all 500 mg/L.
2.1.2　抑菌活性。由表 2可知 ,河朔荛花的 3种提取物在浓
度为 500 mg/L时对苹果炭疽病菌 、西瓜枯萎病菌 、马铃薯干
腐病菌 、小麦赤霉病菌及番茄早疫病菌的抑制作用不明显 ,
其抑制率均不超过 50.00%。
2.2　河朔荛花石油醚浸膏中活性成分的分离
2.2.1　一级柱层析分离。样品 8 g用石油醚溶解 ,拌入 5 g
硅胶(100～ 200目),通风橱中吹干。层析硅胶 200 ～ 300目 ,
湿法装柱 ,柱长度为 20 cm ,柱径 4 cm ,干法上样 ,上样高度 2
cm 。以 V石油醚∶V乙酸乙酯(100∶0、90∶10、80∶10、60∶10、50∶10 、
30∶10)为洗脱剂 ,甲醇清柱。每个体系洗 1000 ml ,等体积 100
ml收集馏分 ,共得馏分 65份 , TLC 检测合并 ,记为 E1～ E8 。
测定各馏分对蚜虫的生物活性 ,结果见表 3 。由表 3可知 ,E4
对蚜虫的杀虫活性最高 ,其死亡率为 56.67%。故对E4进行
了进一步分离 。
表3　河朔荛花石油醚提取物一级柱层析 8个组分对蚜虫的杀虫活性
Table 3　Insecticidal activities of the fractions of 1st stage column chro-
matography against aphid
样品编号
Samples
处理虫数
Total treated larvae
24 h后活虫数
Survival number after 24 h
致死率∥%
Mortality
E1 30 23 　23.33
E2 30 18 40.00
E3 30 25 16.67
E4 30 13 56.67
E5 30 18 40.00
E6 30 23 23.33
E7 30 24 20.00
E8 30 25 16.67
对照(CK) 30 30 0
　注:表中各馏分的浓度均为 5%(W/ V)。
　Note:Concentrations of all distillation cuts are 5%(W/V)。
2.2.2　二级柱层析分离。对 E4采用常压柱层析分离 ,柱长
度 20 cm ,柱径 2 cm ,共上样品 0.218 g ,V三氯甲烷∶V甲醇(100∶0 、
90∶10、80∶10、60∶10 、50∶10 、30∶10)梯度洗脱 ,甲醇清柱。每个
体系洗 100ml ,等体积 20 ml收集馏分 ,共收集馏分 35份 ,TLC
检验合并为 5份 ,记为 F1～ F5 ,测定各馏分对蚜虫的生物活
性 ,结果见表 4。由表 4可以看出 ,馏分F4对蚜虫的杀虫活
性高于其他馏分 ,其致死率为 60.00%。其次 ,馏分 F2对蚜
虫的致死率为 43.33%。
表4　河朔荛花石油醚提取物二级柱层析 5个馏分对蚜虫的杀虫活性
Table 4　Insecticidal activities of the fractions of 2nd stage column chro-
matography against aphid
样品编号
Samples
处理虫数
Total treated larvae
24 h后活虫数
Survival number after 24 h
致死率∥%
Mortality
F1 30 21 　　30.00
F2 30 17 43.33
F3 30 19 36.67
F4 30 12 60.00
F5 30 20 33.33
对照(CK) 30 30 0
　注:表中各馏分的浓度均为 1%。
　Note:Concentration of all distillation cuts are 1%.
3　结论与讨论
(1)一般植物源农药均不表现触杀活性 ,而河朔荛花作
为一种有毒植物 ,对蚜虫却表现出一定的触杀活性 ,对3龄
(下转第 223页)
22137卷 1期　　　　　　　　　　　　　　　杨华等　河朔荛花农药生物活性初探
到较好的分离纯化。
图 1　木瓜 SOD Sephadex G-100洗脱曲线
Fig.1　The SOD Sephadex G-100 elution curve of papaya
2.2　皱皮木瓜 SOD纯化结果　由表 1可知 ,酶的最终提纯
倍数是 178.72 倍 ,活力回收率是 4.94%,比活力是 303.82
U/mg蛋白。
表 1　皱皮木瓜 SOD纯化结果
Table 1　 SODpurification results of wrinkled papaya
纯化步骤
Purification
procedures
总活力
U
Total
activity
总蛋白
mg
Total
protein
比活力
U/mg蛋白
Specific
activity
回收率%
Rate of
recovery
纯化倍数
Purifi-
cation
times
粗提液 Crude extract 5 597.00 3 300.00 　 1.70 100.00 　　-
硫酸铵盐析 Ammonium 934.70 177.36 5.27 16.70 　 3.10
sulfate salting out
丙酮沉淀 Acetone 636.90 38.23 16.66 11.38 9.80
precipitation
SephadexG-100 276.48 0.91 303.82 4.94 178.72
2.3　皱皮木瓜 SOD纯度鉴定结果　通过 SDS-PAGE纯度鉴
定 ,对不同量样品进行电泳 ,电泳图是一条谱带 ,表明样品得
到较好的分离纯化 ,已达电泳纯(图 2)。
3　结论与讨论
(1)皱皮木瓜含有很多氧化酶类 ,提取过程中溶液颜色
比较深 ,含有很多杂蛋白。该研究采用 Sevage法除杂蛋白和
用丙酮再次沉淀脱色 ,达到了理想的效果。
图 2　SOD样品SDS-PAGE纯度鉴定结果
Fig.2　SOD sample-SDS-PAGE purity detection result
　　(2)在分离纯化皱皮木瓜 SOD的步骤中 ,硫酸铵盐析这
步对活力的损失影响比较大。硫酸铵盐影响皱皮木瓜 SOD
活性的机制有待于进一步研究 ,以便在生产上提高酶的产
量 ,充分利用原材料。
(3)木瓜资源非常丰富 ,近年来 ,木瓜大量用于美容 、食
品等 ,如木瓜香皂 、洗面奶 ,木瓜饮料 、酒系列 、果脯等 ,营养
丰富 ,对人体有保健功能 ,所以有必要进一步研究皱皮木瓜
SOD的性质以及药理作用 ,为后期的开发利用奠定基础。
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(上接第 221页)
粘虫表现出一定的拒食活性 ,其作用机理值得进一步研究。
(2)从不同溶剂提取液的杀虫生物活性来看 ,河朔荛花
石油醚提取物对蚜虫具有触杀活性 ,乙酸乙酯提取物对粘
虫具有一定的拒食活性 ,说明该植物中所含的杀虫活性成
分较多 ,且分布在不同的极性部分中 ,对其活性部分值得进
一步分离。
(3)用硅胶柱层析对石油醚提取物进行分离时 ,淋洗液
依次从非极性溶剂逐渐向极性溶剂过渡 ,而对蚜虫触杀活
性高的馏分主要集中于F2、F4 2个馏分中 ,说明该植物中所
含的杀虫活性成分可能是一类极性较弱的物质 。
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22337卷1期　　　　　　　　　　　　　　　　柳建平　皱皮木瓜超氧化物歧化酶分离纯化研究