全 文 ：小叶榕叶水提物浸膏的 HPLC指纹图谱初步研究
赖毅勤 1 ,刘峰 1 ,周宏兵 1 ,陈加林 2
(1.广东药学院 药物分析教研室 ,广东 广州 510006;2.广州白云山制药总厂 ,广东 广州 510515)
摘要:目的 研究小叶榕叶水提物浸膏的 HPLC指纹图谱。方法 色谱柱为大连依立特 ODSC18(250 mm×4.6 mm, 5 μm);以
90%甲醇-水-0.2%H3PO4为流动相 A, 以 20%四氢呋喃-水-0.2%H3PO4为流动相 B, 按一定比例配制 , 梯度洗脱;柱温为 31
℃;流速为 1mL/min;检测波长为 275.5nm;分析时间为 120 min。结果 初步建立了小叶榕叶水提物浸膏的 HPLC指纹图谱 ,
标定了 19个共有指纹峰 ,并对 7个共有指纹峰进行了标记。结论 该法建立的指纹图谱具有可靠性 , 可为进一步研究小叶榕
叶水提物的质量标准提供依据。
关键词:小叶榕叶;指纹图谱;高效液相色谱法
中图分类号:R284.1　文献标识码:A　文章编号:1006-8783(2008)01-0006-03
HPLCfingerprintsoftheextractsofFoliumficimicrocarpae
LAIYi-qin1 , LIUFeng1 , ZHOUHong-bin1 , CHENJia-lin2 (1.DepartmentofPharmaceuticalAnalysis, GuangdongColegeofPharmacy,
Guangzhou, Guangdong510006, China;2.GuangzhouBaiyunshanPharmaceuticalGeneralFactory, Guangzhou, Guangdong510515, China)
Abstract:ObjectiveTodeterminetheHPLCfingerprintsoftheaqueousextractsofFoliumficimicrocarpae.MethodsTheextractswas
analyzedonanODSC18 column(4.6 mm×250 mm, 5 μm)using90% methanol-water-0.2%H3PO4 asgradienteluteA, 20%
tetrahydrofuran-water-0.2%H3PO4 asgradienteluteB.Theflowratewas1 mL/minandcolumntemperature31 ℃.Thedetection
wavelengthwas275.5nm.ResultsHPLCfingerprintsoftheaqueousextractsofFoliumficimicrocarpaewasestablished.Atotalof19
commonpeakshavebeenidentifiedand7 compoundswhichwereseparatedfromleavescouldbefoundtherelativepeaksinchart.
ConclusionThefingerprintsarereliable, whichcouldbeusedforqualitycontroloftheaqueousextractsofFoliumficimicrocarpae..
Keywords:Foliumficimicrocarpae;fingerprints;HPLC
基金项目:广东省中医药局 2005年资助项目(1050044)
作者简介:赖毅勤(1980-),女 , 2004级在读硕士研究生;通讯
作者:周宏兵 ,男 , 教授 ,硕士研究生导师;主要从事
药品质量控制研究工作。
　　小叶榕叶是桑科植物榕属小叶榕 Ficus
microcarpaL.f.的干燥叶子 ,主要产于广东和广西[ 1] 。
小叶榕叶水提物浸膏作为咳特灵的主成分收载在部
颁标准[ 2]中 ,用于治疗哮喘和慢性支气管炎 。目前的
部颁标准 ,只对小叶榕叶水提物浸膏做了薄层鉴别 ,
质量标准较简单。本文对小叶榕叶水提物浸膏进行
了 HPLC指纹图谱的研究 ,为进一步研究和制订小叶
榕叶及其提取物 HPLC指纹图谱奠定实验依据。
1　仪器与试药
1.1　仪器
福立 2000高效液相色谱仪:N2000色谱工作站 ,
二元泵 ,柱温箱 ,紫外检测器。
1.2　试剂
试剂均为色谱纯 ,并用 0.45 μm微孔滤膜过滤。
1.3　对照品
苯甲酸 、1-(4-羟基 -3, 5-二甲氧基苯基)-乙酮 、
2-羟基苯甲酸 、4-羟基 -3, 5-二甲氧基苯甲酸 、4-羟基
苯甲酸 、红花菜豆酸 、4-甲氧基 -3, 5-二羟基苯甲酸 ,
均为作者从小叶榕叶水提物中分离得到的化合物 ,
并经 IR、EI-MS、NMR鉴定结构 ,纯度经 HPLC检测
大于 98.5%。
1.4　药材
小叶榕叶水提物浸膏 ,白云山制药厂提供。
2　方法与结果
2.1　供试品溶液的制备
取小叶榕叶水提物浸膏约 1 g,蒸馏水溶解后 ,
乙醇醇沉使溶液醇浓度为 50%[ 3] ,滤除不溶物 ,挥
除乙醇直至没有醇味 ,得滤液。滤液用石油醚萃取
3次 ,再用乙酸乙酯萃取 3次[ 2] , 得乙酸乙酯层浸
膏。将乙酸乙酯层浸膏用适量的甲醇溶解 ,定容至
10 mL,用 0.45μm微孔滤膜过滤 ,取续滤液 ,即得 。
2.2　对照品溶液的制备
6
第 24卷第 1期 广　东　药　学　院　学　报 Vol.24 No.1
2008年 2月 JOURNALOFGUANGDONGCOLLEGEOFPHARMACY Feb.2008
取各对照品适量 ,甲醇溶解后 ,定容至 1 mL,用
0.45μm的微孔滤膜过滤 ,取续滤液 ,即得。
2.3　检测波长的选择
取按 “ 2.1”项方法制备的供试液进行紫外扫
描 ,所得图谱见图 1。从图 1可见 , 275.5 nm处有最
大吸收峰 ,故确定 275.5 nm为检测波长 。
图 1　小叶榕叶供试液的紫外扫描图
Fig.1　UVchromatogramoftheaqueousextractofFolium
ficimicrocarpae
2.4　色谱条件
色谱柱为大连依立特 ODSC18 (250 mm×4.6
mm, 5 μm);流动相:以 90%甲醇-水-0.2%H3PO4
为流动相 A,以 20%四氢呋喃-水-0.2%H3PO4为流
动相 B,按表 1比例配制进行梯度洗脱;柱温为 31
℃;流速为 1mL/min;检测波长为 275.5nm;分析时
间为 120 min;进样量为 20 μL。
表 1　梯度洗脱表
Tab.1　Gradientelutiontime
t/min 流动相 A/% 流动相 B/%
0 100 0
10 90 10
30 70 30
60 50 50
80 30 70
120 20 80
2.5　方法学考察
2.5.1　空白试验　吸取溶剂 20 μL,按 “ 2.4”项条
件进样测定 , 记录色图谱 , 结果见图 2。从图 2可
见 ,溶剂对测定无干扰 。
图 2　空白试验
Fig2　HPLCchromatogramoftheblankassay
2.5.2　精密度试验　取同一份供试品溶液 ,连续进
样 5次 ,比较共有峰的相对保留时间及峰面积比值。
结果各共有峰的相对保留时间在均值 ±1 min内 ,
RSD在 0.2% ～ 0.8%之间 ,各共有峰的峰面积比值
的 RSD在 0.7% ～ 2.7%之间 ,表明共有峰的相对保
留时间和峰面积比值的 RSD均符合指纹图谱检测
要求 [ 4] 。
2.5.3　稳定性试验　取同一份供试液 ,分别在 0、
2、4、6、24 h进样测定 ,比较共有峰的相对保留时间
及峰面积比值 。结果各共有峰的相对保留时间在均
值 ±1min内 , RSD在 0.3% ～ 0.8%之间 ,各共有峰
的峰面积比值的 RSD在 0.8% ～ 2.9%之间。表明
供试液在 24h内稳定 ,符合指纹图谱检测要求 [ 4] 。
2.5.4　重现性试验　取同一批小叶榕叶水提物浸
膏 ,按 “2.1”下制备 5份供试液 ,分别进样测定 ,比
较共有峰的相对保留时间及峰面积比值 。结果各共
有峰的相对保留时间在均值 ±1min内 , RSD在
0.3% ～ 0.8%之间 ,各共有峰的峰面积比值的 RSD
在 1.2% ～ 2.8%之间 ,表明共有峰的相对保留时间
和峰面积比值的 RSD符合指纹图谱检测要求 [ 4, 5] 。
2.6　指纹图谱及技术参数
2.6.1　共有指纹峰的标定　取 3批小叶榕叶水提
物浸膏 ,对其 HPLC指纹图谱做初步考察 ,初步确定
了 19个分离度较好且峰面积稳定的峰为共有峰。
结果见图 3。
图 3　小叶榕叶提取物浸膏的指纹图谱
Fig.3　HPLCfingerprintsoftheaqueousextractsof
Foliumficimicrocarpae
2.6.2　共有指纹峰的相对保留时间　根据 《中药
注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》,确定平
均保留时间为 44.643 min的 8号共有峰为内标参
照峰 ,其余 18个共有指纹峰与参照峰相比 ,相对保
留时间依次为:0.1283、 0.1459、 0.1610、 0.2628、
0.3947、0.4878、 0.7581、 1.1026、 1.3346、 1.6920、
1.7398、1.8135、 1.8807、 1.8946、 2.0636、 2.0788、
2.1154、2.1421。
2.6.3　共有指纹峰的相对峰面积　根据初步研究 ,
共有峰面积占总峰面积比值为 66.310% ～
7
第 1期　赖毅勤 ,等.小叶榕叶水提物浸膏的 HPLC指纹图谱初步研究
80.094%。保留时间小于 30 min的共有峰:单峰面
积占总峰面积大于 10%而小于 20%的共有峰为 5
号 ,其相对峰面积比值为 0.9102 ～ 0.9717,差值小
于 ±25%。保留时间超过 30 min的共有峰:单峰面
积占总峰面积大于 10%而小于 20%的共有峰为 7
号和 8号 , 7号峰的相对峰面积比值为 0.5915 ～
0.6725,其差值小于 ±25%。结果符合《中药注射剂
指纹图谱研究的技术要求(暂行)》。
2.7　部分共有峰的标记
取各对照品溶液 20μL,分别注入高效液相色谱
仪 , HPLC色谱图见图 3。结果确认了以下 7个共有
峰:11号峰为苯甲酸(75.332min), 12号峰为 1-(4-
羟基-3, 5-二甲氧基苯基)-乙酮(77.298 min), 7号
峰为 3-羟基 -4-甲氧基苯甲酸(32.865 min),内标参
照峰为 4-羟基 -3 , 5-二甲氧基苯甲酸(43.832min),
6号峰为 4-羟基苯甲酸(21.232 min), 16号峰为红
花菜豆酸(91.398 min), 5号峰为 4-甲氧基-3, 5-二
羟基苯甲酸(17.165min)。
3　讨论
3.1　目前国内文献中 ,一般都以总黄酮作为咳特灵
中小叶榕叶水提物的质量指标 , 用 Al(NO3 )3-
NaNO2-NaOH比色法 [ 3] ,或以槲皮素为对照品 ,用紫
外分光光度法在 265 nm处[ 5]测定其总黄酮含量 。
但作者从小叶榕叶分离得到的 7个化合物 ,通过
HPLC检测均为含量较大的共有峰 ,均不是黄酮类
化合物 。另外 ,文献 [ 6 ～ 8]报道 ,在小叶榕叶中甲
醇提取物中分离出的 42个化合物中也仅有 3个黄
酮类化合物 。 Al(NO3)3 -NaNO2-NaOH的黄酮专属
性不强 ,一些具有邻二酚羟基的非黄酮物质也会发
生反应 [ 8] 。分别称量对照品 1至 7,每个化合物约
0.0003 g。将这 7个化合物混合后 ,用甲醇溶解 ,定
容至 10 mL。取少量混合液作为空白对照进行紫外
扫描 ,结果见图 4。吸取 6 mL混合液置 25 mL的容
量瓶中 ,加 1 mL质量分数为 5%的 NaNO2 ,摇匀 ,放
置 6 min,再加 1mL质量分数 10%的 Al(NO3)3 ,摇
匀 ,放置 6 min,最后加 1mL质量分数 4%的 NaOH,
加水至刻度 ,摇匀 。加入 NaOH后观察到溶液从透
明无色变为黄色 。在 15 min内对反应液进行紫外
扫描 ,结果见图 5。两图比较 ,反应后的溶液在 500
nm处有明显吸收 ,而反应前的空白液在 500 nm处
则无吸收。说明从小叶榕叶中分离得到的化合物 ,
混合后也能发生 Al(NO3)3-NaNO2 -NaOH反应 。综
上所述 ,作者认为以总黄酮作为小叶榕叶水提物浸
膏的质量指标 ,用 Al(NO3)3-NaNO2-NaOH比色法
进行测定的方法是否合理 ,值得进一步探讨 ,建立其
HPLC指纹图谱可能更科学。
3.2　由于条件和时间限制 ,本文只对 3批小叶榕叶
水提物浸膏的 HPLC指纹图谱做了初步研究 ,共有
峰面积占总峰面积的平均比值为 73.247%,暂未达
到《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》
中非共有峰总面积不得大于总峰面积 10%的要求。
今后将收集不同产地的小叶榕叶作进一步的研究 。
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(收稿日期:2007-10-27;修回日期:2008-01-16)
8
广东药学院学报 , 2008, 24(1)