全 文 ：西北农业学报　２０１５，２４（１１）：８０－８６
Ａｃｔａ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅ　Ｂｏｒｅａｌｉ－ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ　Ｓｉｎｉｃａ　 ｄｏｉ：１０．７６０６／ｊ．ｉｓｓｎ．１００４－１３８９．２０１５．１１．０１３
网络出版日期：２０１５－１１－１６
网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／６１．１２２０．Ｓ．２０１５１１１６．１７３１．０２６．ｈｔｍｌ
苦荞蔗糖合酶基因克隆及序列分析
收稿日期：２０１４－１１－２６　　修回日期：２０１５－０１－０３
基金项目：国家自然科学基金（３１１７１６０６）。
第一作者：燕雪芬，女，硕士研究生，从事蛋白质与酶的研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｘｕｅｆｅｎ３４１０２７＠１６３．ｃｏｍ
通信作者：陈　鹏，男，博士，教授，从事蛋白质与酶的研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｐｅｎｇｃｈｅｎ＠ｎｗｓｕａｆ．ｅｄｕ．ｃｎ
燕雪芬，李玉萍，张海纳，陈　鹏
（西北农林科技大学 生命学院，陕西杨凌　７１２１００）
摘　要　以苦荞基因组ＤＮＡ为模板，根据已构建的苦荞ｃＤＮＡ文库中蔗糖合酶（Ｓｕｃｒｏｓｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＳｕＳｙ）的
部分ｃＤＮＡ序列设计引物，ＰＣＲ扩增ＳｕＳｙ基因的核心片段，结合Ｇｅｎｏｍｉｃ　ｗａｌｋｉｎｇ技术获得ＳｕＳｙ基因的完
整序列。生物信息学分析表明，该基因序列全长４　４２８ｂｐ，含有１２个外显子和１１个内含子，剪接位点均符合
经典ＧＵ－ＡＧ法则，ＯＲＦ长度为２　４１２ｂｐ，共编码８０３个氨基酸。其氨基酸序列与籽粒苋（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ　ｈｙｐｏ－
ｃｈｏｎｄｒｉａｃｕｓ）、甜菜（Ｂｅｔａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）、红叶藜（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ　ｒｕｂｒｕｍ Ｌ）和大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ）的相似性分别为
８６％、８６％、８５％和８３％。保守结构域分析表明，ＳｕＳｙ含有１个ＧＴ１糖基化酶功能结构域（２７５～７６０）和４个
ＡＤＰ结合位点，能够催化果糖－６－磷酸和尿苷－５′－二磷酸葡萄糖形成蔗糖－６－磷酸。
关键词　苦荞；蔗糖合酶；基因克隆；生物信息学分析
中图分类号　Ｑ７８１　　　文献标志码　Ａ　　　　　文章编号　１００４－１３８９（２０１５）１１－００８０－０７
　　荞麦别名三角麦、乌麦，蓼科荞麦属植物，分
甜荞（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ　ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）和苦荞（Ｆａｇｏｐｙ－
ｒｕｍ　ｔａｔａｒｉｃｕｍ）２个品种。近年来，因其对高血
压、冠心病、糖尿病等有特殊的防治作用而备受关
注。在揭示苦荞的作用机制时，研究者主要研究
黄酮、高活性蛋白质、膳食纤维素等物质［１－２］，却很
少从糖类化合物方面来研究苦荞的作用。可溶性
糖是苦荞种子中重要的碳水化合物之一，含量为
２％～６％［３］，其中，蔗糖含量为 ０．００７　７％ ～
０．２０８　９％ ［４］，葡 萄 糖 含 量 为 ０．０５５　６％ ～
０．８４０　２％［５］，明显低于其他农作物籽粒中糖含
量。因此，苦荞作为低糖作物可被用来开发适合
糖尿病人食用的功能性食品。研究苦荞蔗糖代谢
的调控机制，对选育籽粒蔗糖含量更低的苦荞品
种具有重要的参考价值。
在植物体内参与蔗糖代谢的酶有３种：蔗糖
磷酸合成酶（Ｓｕｃｒｏｓｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＳＰＳ）、
蔗糖合酶（Ｓｕｃｒｏｓｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＳｕＳｙ）、转化酶（Ｉｎ－
ｖｅｒｔａｓｅ　Ｉｖｒ）［６］。大量研究表明，ＳｕＳｙ主要参与植
物韧皮部的代谢［７－８］、蔗糖代谢调控［９］、纤维细胞
分化［１０－１２］和淀粉合成［１３］，在作物品质和产量调控
方面都具有重要意义。蔗糖合酶在植物中催化如
下可逆反应：蔗糖＋ＵＤＰ←→果糖＋ＵＤＰＧ，既可
催化蔗糖的分解，又可催化蔗糖的合成，但通常认
为分解作用是最主要的［１４－１６］。基因的克隆与其结
构和功能的分析是理解蛋白所发挥的生理作用与
代谢功能的第一步。目前，研究者已成功地从马
铃薯［１７］、玉米［１８］、甜菜［１９］、胡萝卜［２０］、甘蔗［２１］等
多种植物中克隆得到ＳｕＳｙ基因，它们大都有较
高的氨基酸序列同源性及相似的理化性质，但关
于苦荞蔗糖合酶基因方面的研究鲜见报道。因
此，以西北农林科技大学生命科学学院酶学实验
室构建的苦荞ｃＤＮＡ文库中的ＳｕＳｙ基因片段为
基础，利用基因组步移技术克隆ＳｕＳｙ基因的全
长序列，并对ＳｕＳｙ基因结构和翻译产物进行生
物信息学分析，以期为进一步研究蔗糖合酶在苦
荞籽粒蔗糖及碳水化合物累积中的调控机制奠定
基础。
１　材料与方法
１．１　材 料
１．１．１　菌种与质粒　含有Ｆ３Ｈ 基因的重组质
粒ｐＴｒｉｐｌＥｘ２－ＳｕＳｙ和大肠杆菌菌株 ＴＯＰ１０均
为西北农林科技大学生命科学学院酶学实验室保
存。Ｔ载体ｐＥＡＳＹ－Ｔ１购自北京全式金生物技
术有限公司。
１．１．２　主要试剂　质粒ＤＮＡ小量提取试剂盒
为杭州博日科技有限公司产品。ＰＣＲ产物纯化
试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司。
ＩＰｒｏｏｆ　ＤＮＡ 聚合酶购自 Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司。ＤＮＡ
Ｍａｒｋｅｒ、Ｇｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｉｎｇ　Ｋｉｔ为大连宝生物工程
有限公司产品。其他常用生化及分子生物学试剂
均为国产或进口分析纯。引物合成及测序由北京
奥科生物技术有限责任公司完成。
１．２　方 法
１．２．１　苦荞基因组ＤＮＡ的提取　采取大田种
植的苦荞无病虫害叶片为材料，利用ＣＴＡＢ法提
取苦荞叶片基因组ＤＮＡ。提取结果用８ｇ／Ｌ琼
脂糖凝胶电泳进行检测。
１．２．２　ＳｕＳｙ基因核心片段的扩增　根据西北
农林科技大学生命科学学院实验室构建的苦荞
ｃＤＮＡ文库中ＳｕＳｙ的ｃＤＮＡ序列设计并合成引
物，为避免所设计的引物跨越内含子与外显子的
剪接处，设计３条上游引物和３条下游引物（共９
对）同时对ＳｕＳｙ基因的序列进行扩增。
上游引物：Ｓ１－１，５′－ＴＧＣＡＡＧＣＧＡＡＧＣＣＴ－
ＧＡＴＴ－３′；Ｓ２－１，５′－ＴＧＡＧＡＡＧＧＴＴＴＡＣＧＧＡ－
ＡＣＡＧＡＡ－３′；Ｓ３－１，５′－ＣＧＴＡＴＣＣＴＣＡＴＴＧＴＡ－
ＡＣＴＣＧＧＣＴＴＣＴ－３′。下游引物：Ｓ４－２，５′－ＧＧＴ－
ＡＡＣＣＡＧＡＣＴＴＧＣＣＡＴＴＣＡＣ－３′；Ｓ５－２，５′－ＡＡ－
ＡＣＣＡＴＡＡＡＣＴＣＣＡＧＣＣＡＡＡＧ－３′；Ｓ６－２，５′－ＴＣ－
ＡＣＴＣＣＴＣＡＡＴＡＧＣＣＡＡＴＧＧＡＡＣＡ－３′。
以苦荞基因组ＤＮＡ为模板，ＰＣＲ反应体系
为：基因组 ＤＮＡ　１μＬ（５０～１００ｎｇ），５×ＰＣＲ
ｂｕｆｆｅｒ　５μＬ，ｄＮＴＰｓ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）０．５μＬ，上下
游引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）各１μＬ，ＩＰｒｏｏｆ　ＤＮＡ聚合酶
（０．５Ｕ）０．５μＬ，ｄｄＨ２Ｏ　１６μＬ，共２５μＬ。反应
参数为９５℃３ｍｉｎ；９５℃２５ｓ，５６℃３０ｓ，７２℃
３ｍｉｎ，３０个循环；最后７２℃延伸７ｍｉｎ。ＰＣＲ
产物用１０ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶电泳检测。利用ＰＣＲ
产物回收试剂盒纯化特异的ＰＣＲ产物，并与克隆
载体ｐＥＡＳＹ－Ｔ１连接，连接产物转化大肠杆菌
ＴＯＰ１０。经菌落ＰＣＲ鉴定的阳性克隆送北京奥
科生物技术公司测序。
１．２．３　ＳｕＳｙ基因５′端的克隆　对西北农林科
技大学生命科学学院构建的苦荞ｃＤＮＡ文库中
ＳｕＳｙ基因的ｃＤＮＡ序列分析后发现，其３′端包
含终止密码子 ＴＧＡ、３′－ＵＴＲ区和ｐｏｌｙＡ结构，
但是５′端并不包含５′－ＵＴＲ、起始密码子ＡＴＧ等
结构，推测ｃＤＮＡ 文库中获得的序列并非苦荞
ＳｕＳｙ的全长基因。因此，利用Ｇｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｉｎｇ
技术克隆ＳｕＳｙ基因５′端序列。
分析“１．２．２”中的测序结果，根据５′端序列
设计并合成３条特异性下游引物：ＧＷ３－１，５′－
ＴＴＣＣＣＡＣＣＧＴＧＴＣＣＴＴＧＣＴＧＴＴＧＡ－３′；ＧＷ３－２，
５′－ＣＧＣＧＧＴＧＡＡＣＴＧＡＣＡＣＧＡＧＡＡＡＴ－３′；ＧＷ３－３，
５′－ＣＴＴＣＧＣＴＴＧＣＡＧＣＴＣＧＧＣＴＡＧＧＡ－３′。 将
合成的３条特异性引物与 ＴａＫａＲａ公司的 Ｇｅ－
ｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｉｎｇ　Ｋｉｔ提供的兼并引物进行３轮巢
式ＰＣＲ扩增，获取ＳｕＳｙ基因的５′端侧翼序列，
具体步骤参考试剂盒说明书。ＰＣＲ产物经胶回
收纯化后与载体ｐＥＡＳＹ－Ｔ１连接，连接产物转化
大肠杆菌ＴＯＰ１０。经菌落ＰＣＲ鉴定的阳性克隆
送北京奥科生物技术公司测序。
１．２．４　ＳｕＳｙ基因序列分析　利用ＤＮＡＳｔａｒ软
件将ＳｕＳｙ基因的核心片段与克隆的５′端序列进
行拼接，并在软件 ＤＮＡＭＡＮ 中分析其序列结
构。ＳｕＳｙ基因序列及翻译的氨基酸序列在 ＮＣ－
ＢＩ中进行ＢＬＡＳＴ比对分析。
１．２．５　ＳｕＳｙ基因编码蛋白质的生物信息学分
析 　 利用 Ｐｒｏｔｐａｒａｍ、ＰｒｏｔＳｃａｌｅ、ＴＭＨＭＭ 和
ＳＯＰＭＡ等分析软件对蛋白质的理化性质、疏水
性、跨膜区以及二级结构进行分析，并用软件
ＳＷｌＳＳＭＯＤＥＩ进行序列结构的三维建模。
２　结果与分析
２．１　苦荞基因组ＤＮＡ的获得
利用ＣＴＡＢ法提取的基因组 ＤＮＡ，经琼脂
糖凝胶电泳检测，结果如图１所示，条带单一，未
出现降解，可用于后续的基因组扩增。
２．２　ＳｕＳｙ基因的扩增与克隆
以苦荞基因组ＤＮＡ为模板，ＳｕＳｙ基因核心
片段的扩增结果见图２，３条上游引物和３条下游
引物分别组合（共９对），均能扩增出单一条带，引
物Ｓ１－１和Ｓ６－２ＰＣＲ扩增结果（泳道９）片段最长
且较亮（１　９００ｂｐ左右），测序结果分析表明：扩增
结果为苦荞的ＳｕＳｙ基因序列。
２．３　ＳｕＳｙ基因５′端的克隆
ＳｕＳｙ基因５′端的Ｇｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｉｎｇ第３次
ＰＣＲ结果如图３所示，泳道１～４分别为兼并引
·１８·１１期 燕雪芬等：苦荞蔗糖合酶基因克隆及序列分析
物ＡＰ１、ＡＰ２、ＡＰ３、ＡＰ４与特异性引物的扩增结
果，由电泳图可知：引物 ＡＰ２与特异性引物扩增
出的片段最长（３　３００ｂｐ左右），ＡＰ１、ＡＰ３、ＡＰ４
所扩增的片段较短。说明引物 ＡＰ２成功步移
ＳｕＳｙ基因５′端序列。
　　Ｍ．ＤＬ　２０００相对分子质量标准　ＤＬ　２０００ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ；
１．苦荞基因组ＤＮＡ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ｏｆ　Ｆ．ｔａｔａｒｉｃｕｍ
图１　苦荞基因组ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳
Ｆｉｇ．１　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ
ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｆｒｏｍＦ．ｔａｔａｒｉｃｕｍ
　　Ｍ．ＤＬ　２０００相对分子质量标准　ＤＬ　２０００ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ；１～
９．分别为引物Ｓ１－１／Ｓ４－２、Ｓ１－１／Ｓ５－２、Ｓ１－１／Ｓ６－２、Ｓ２－１／Ｓ４－２、Ｓ２－
１／Ｓ５－２、Ｓ２－１／Ｓ６－２、Ｓ３－１／Ｓ４－２、Ｓ３－１／Ｓ５－２、Ｓ３－１／Ｓ６－２ＰＣＲ扩增结
果　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒ　Ｓ１－１／Ｓ４－２，Ｓ１－１／Ｓ５－２，Ｓ１－
１／Ｓ６－２，Ｓ２－１／Ｓ４－２，Ｓ２－１／Ｓ５－２，Ｓ２－１／Ｓ６－２，Ｓ３－１／Ｓ４－２，Ｓ３－１／Ｓ５－２，
Ｓ３－１／Ｓ６－２
图２　ＳｕＳｙ基因核心区域ＰＣＲ扩增
Ｆｉｇ．２　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｏｆ　ｃｏｒｅ　ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　ＳｕＳｙｇｅｎｅ
２．４　ＳｕＳｙ基因完整序列分析
将克隆的５′端序列进行测序，利用ＤＮＡＳｔａｒ
软件对测序结果与ＳｕＳｙ基因的核心片段进行拼
接，获得一段长度为４　４２８ｂｐ的完整序列，命名
为ＳｕＳｙＱ。ＳｕＳｙＱ含有１２个外显子和１１个内
含子，内含子剪接位点均符合经典的 ＧＵ－ＡＧ法
则。将ＳｕＳｙＱ去除内含子序列后命名为ＳｕＳｙｃ，
ＳｕＳｙｃ序列长为２　９８０ｂｐ，包含１个长度为２　４１２
ｂｐ的开放阅读框（ＯＲＦ）以及２８５ｂｐ的５′非编码
区（ＵＴＲ）和２８３ｂｐ的３′非编码区（ＵＴＲ），其中
ＯＲＦ共编码８０３个氨基酸（图４）。ＢＬＡＳＴ同源
比对结果显示，ＳｕＳｙ推导的氨基酸序列与籽粒
苋、甜菜、红叶藜和大豆的同源性分别为８６％、
８６％、８５％和８３％。
　　Ｍ．ＤＬ２０００相对分子质量标准　ＤＬ２０００ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ；１－４．
引物ＡＰ１、ＡＰ２、ＡＰ３、ＡＰ４与特异性引物的扩增结果　Ａｍｐｌｉｆｉ－
ｃａｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ＡＰ１，ＡＰ２，ＡＰ３ａｎｄ　ＡＰ４ｗｉｔｈ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｐｒｉｍｅｒ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ
图３　ＳｕＳｙ基因５′端的Ｇｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｉｎｇ
第３次ＰＣＲ扩增的电泳检测
Ｆｉｇ．３　Ｅｌｅｃｔｒｏｇｒａｍ　ｏｆ　ｔｈｅ　３ｒｄ　ＰＣＲ　ｏｆ　Ｇｅｎｏｍｅ
Ｗａｌｋｉｎｇ　５′ｅｎｄ　ｏｆ　ＳｕＳｙｇｅｎｅ
２．５　ＳｕＳｙ蛋白质的生物信息学分析
通过ＥｘＰＡＳｙ－ＰｒｏｔＰａｒａｍ　ｔｏｏｌ（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．
ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／）在线生物软件对ＳｕＳｙ
氨基酸序列进行分析，结果显示：苦荞ＳｕＳｙ蛋白
由８０３个氨基酸组成，分子式为 Ｃ４１４６Ｈ６４４３Ｎ１１０９
Ｏ１２０２Ｓ２６，分子质量约为９１．９ｋｕ，理论等电点ｐＩ
为５．７１；蛋白的不稳定指数估算值是３６．０８，总的
亲水性平均系数为－０．２７５＜０，与ＰｒｏｔＳｃａｌｅ预测
的肽链亲／疏水性分布曲线结果吻合。因此，推测
该蛋白是亲水性的稳定蛋白。ＳｕＳｙ氨基酸序列
功能位点预测显示（图５）：苦荞蔗糖合酶具有１
个保守功能域 ＧＴ１＿Ｓｕｃｒｏｓｅ＿ｓｙｎｔｈａｓｅ（２７５～
７６０）和４个 ＡＤＰ结合位点，与糖基转移酶家族
ＧＴ１相似性很高，期望值（Ｅ）为９．８０Ｅ－１１５，能够
催化果糖－６－磷酸和尿苷－５′－二磷酸葡萄糖合成蔗
糖－６－磷酸。
在线工具ＴａｒｇｅｔＰ１．１和ＳｉｇｎａｌＰ分析认为，
苦荞ＳｕＳｙ蛋白位于细胞质中，没有信号肽，是一
种非分泌蛋白。ＴＭＨＭＭ 软件分析显示该蛋白
不存在跨膜结构域，可推测苦荞蔗糖合酶是胞内
酶，直接在细胞内参与蔗糖的代谢活动。
·２８· 西　北　农　业　学　报 ２４卷
　　黑色下划线部分为５′端非编码区　Ｂｌａｃｋ　ｕｎｄｅｒｌｉｎｅ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ　５′－ＵＴＲ，红色下划线部分为３′端非编码区　Ｒｅｄ　ｕｎｄｅｒｌｉｎｅ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ
３′－ＵＴＲ，加框部分为终止密码子　Ｓｔｏｐ　ｃｏｄｏｎ　ｉｓ　ｆｒａｍｅｄ
图４　ＳｕＳｙ的ＯＲＦ序列及其对应的氨基酸序列
Ｆｉｇ．４　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ＯＲＦ　ｏｆ　ＳｕＳｙｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ＳｕＳｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ
·３８·１１期 燕雪芬等：苦荞蔗糖合酶基因克隆及序列分析
利用 ＳＯＰＭＡ（ｈｔｔｐ：／／ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／）在线预测
ＳｕＳｙ氨基酸序列的二级结构，结果显示：ＳｕＳｙ的
二级结构由５２．０５％的α－螺旋、２８．２７％的无规则
卷曲、６．４８％的β－转角以及１３．２０％的延伸链组
成。可以看出，α－螺旋和无规则卷曲是其主要的
结构元件，延伸链和β－转角则散布于整个蛋白质
中（图６），符合ＳｕＳｙ蛋白的典型特征。Ｓｗｉｓｓ－
Ｍｏｄｅｌ服务器搜索显示，苦荞ＳｕＳｙ蛋白序列与
拟南芥的ＳｕＳｙ蛋白同源性为７９．５％，以此结构
为模板，构建苦荞ＳｕＳｙ蛋白的三维结构，结果如
图７所示。
图５　苦荞ＳｕＳｙ氨基酸序列功能域分析
Ｆｉｇ．５　Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｄｏｍａｉｎ　ｏｆ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ＳｕＳｙ　ｉｎ　ｂｕｃｋｗｈｅａｔ
　　蓝色代表α－螺旋　Ｂｌｕｅ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔα－ｈｅｌｉｘ；红色代表延伸链　Ｒｅｄ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ　ｅｘｔｅｎｄｅｄ　ｓｔｒａｎｄ；绿色代表β－转角　Ｇｒｅｅｎ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔβ－
ｔｕｒｎ；紫色代表不规则卷曲　Ｐｕｒｐｌｅ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ　ｒａｎｄｏｍ　ｃｏｉｌ
图６　ＳｕＳｙ蛋白的二级结构预测
Ｆｉｇ．６　Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＳｕＳｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
图７　ＳｕＳｙ蛋白的三级结构预测
Ｆｉｇ．７　Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＳｕＳｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ　３－Ｄ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
３　讨 论
蔗糖合酶是高等植物体内参与蔗糖代谢的关
键酶之一，调控蔗糖在各个组织器官的累积含量。
同时ＳｕＳｙ的水解产物ＵＤＰＧ为淀粉的合成提供
前体物质。淀粉是植物中的主要贮藏碳水化合
物，它的组成和含量决定作物的产量和品质。在
淀粉的生物合成过程中涉及一系列酶的共同参
与，已经有研究［２２］证实，库器官淀粉的储存与Ｓｕ－
Ｓｙ水解活性有很大关系。Ｃｈｏｕｒｅｙ等［２３］研究玉
米ｓｈ１ 突变体胚乳发现，ＳｕＳｙ酶活性低于野生型
的１／１０，导致淀粉含量下降２０％，玉米籽粒扁平
且皱缩。Ｃｈｅｎｇ等［２４］报道，水稻胚乳在高温胁迫
下，淀粉含量在开花１４ｄ后急剧下降，与ＳｕＳｙ活
性变化结果相吻合，证实受高温影响淀粉含量的
降低与ＳｕＳｙ活性下降有关。Ｚｒｅｎｎｅｒ等［２５］发现，
在表达ＳｕＳｙ反义ＲＮＡ的转基因马铃薯块茎中，
蔗糖含量没有明显的变化，但是淀粉的累积受到
限制，同时转基因植株块茎的总干质量下降，进而
影响作物产量。而在马铃薯块茎中过表达ＳＵＳ４
基因，ＳｕＳｙ活性显著提高，淀粉含量也增加近一
倍［２４］。根据上述研究结果，不难推测：苦荞淀粉
的形成也受蔗糖合酶的调控。苦荞种子中淀粉的
消化性低，降低人体吸收葡萄糖的速率，加上含有
抑制淀粉转化糖的淀粉酶抑制物，使苦荞成为糖
尿病、高血压等患者的理想食品，既可作为糖尿病
人的良好补充饮食，又不会导致病人在餐后血糖
迅速升高。因此，通过借助分子手段增强蔗糖合
酶在苦荞种子的调控作用，可达到改良苦荞作物
的品质，同时为糖尿病治疗方面的药用价值奠定
基础。
本试验以苦荞ｃＤＮＡ文库中蔗糖合酶基因
的序列为基础，克隆出苦荞叶片中ＳｕＳｙ基因的
核心序列，并结合Ｇｅｎｏｍｉｃ　ｗａｌｋｉｎｇ技术对ＳｕＳｙ
基因的５′端序列进行步移，成功克隆出苦荞Ｓｕ－
Ｓｙ基因的５′端上游序列，从而获得苦荞ＳｕＳｙ基
·４８· 西　北　农　业　学　报 ２４卷
因的完整序列。利用生物信息学软件分析ＳｕＳｙ
基因序列和氨基酸序列，预测该酶的亲／疏水性、
亚细胞定位、蛋白结构及功能结构域，但是关于该
基因在苦荞中的表达调控以及与淀粉之间的作用
关系还有待进一步研究。因此，深入研究ＳｕＳｙ
对揭示蔗糖合酶在苦荞种子的生物学功能以及了
解整个糖代谢具有重要意义。
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ＨＵＡＮＧ　Ｋ　Ｆ，ＳＨＩ　ＺＨ，ＳＯＮＧ　Ｙ　Ｘ，ｅｔ　ａｌ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｎ　ｖａｒｉ－
ａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｓｕｃｒｏｓｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ｔａｒｔａｒｙ　ｂｕｃｋｗｈｅａｔ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ
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ｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｌｔｅｒｅｄ　ｃｅｌ　ｗａｌ　ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ［Ｊ］．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ
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ｃｒｏｓｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ　ｗｉｔｈ　ｃｅｌ　ｗａｌ　ｔｈｉｃｋｅｎｉｎｇ　ｂｙ　ｃｅｌ－
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ｐｒｅｓｅｎｔ　ｉｎ　ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ　ｍａｉｚｅ　ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ　ａｒｅ　ｃｒｉｔｉｃａｌ，ｏｎｅ　ｆｏｒ
ｃｅｌ　ｗａｌ　ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｏｔｈｅｒ　ｆｏｒ　ｓｔａｒｃｈ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
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·５８·１１期 燕雪芬等：苦荞蔗糖合酶基因克隆及序列分析
ｓｙｎｔｈａｓｅ－１ｃＤＮＡ　ｆｒｏｍ　ｓｕｇａｒｃａｎｅ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ
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ｓｕｃｒｏｓｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｉｎ　ｐｌａｎｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ［Ｊ］．
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ａｌ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｒｕｃｉａｌ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｓｕｃｒｏｓｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｆｏｒ　ｓｉｎｋ
ｓｔｒｅｎｇｔｈ　ｕｓｉｎｇ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｏｔａｔｏ　ｐｌａｎｔｓ（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｔｕｂｅｒｏｓ－
ｕｍ Ｌ．）［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｆｏｒ　Ｃｅｌｌ　＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ－
ｇｙ，１９９５，７（１）：９７－１０７．
［２６］　ＢＡＲＯＪＡ－ＦＥＲＮＡＮＤＥＺ　Ｅ，ＭＵＮＯＺ　Ｆ　Ｊ，ＭＯＮＴＥＲＯ　Ｍ，
ｅｔ　ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ　ｓｕｃｒｏｓｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｏ－
ｔａｔｏ（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｌ．）ｔｕｂｅｒｓ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ
ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ｓｔａｒｃｈ，ＡＤＰ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ａｎｄ　ＵＤＰ　ｇｌｃｏｓｅ　ａｎｄ　ｔｏｔａｌ
ｙｉｅｌｄ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００９，５０（９）：１６５１－
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Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｓｕｃｒｏｓｅ　Ｓｙｎｔｈａｓｅ
Ｇｅｎｅ（ＳｕＳｙ）ｆｒｏｍＦａｇｏｐｙｒｕｍ　ｔａｔａｒｉｃｕｍ
ＹＡＮ　Ｘｕｅｆｅｎ，ＬＩ　Ｙｕｐｉｎｇ，ＺＨＡＮＧ　Ｈａｉｎａ　ａｎｄ　ＣＨＥＮ　Ｐｅｎｇ
（Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａ＆Ｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ　Ｓｈａａｎｘｉ　７１２１００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｗｅ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ｔｈｅ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｃＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｕｃｒｏｓｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｇｅｎｅ（Ｓｕ－
Ｓｙ）ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｆｒｏｍ　ｃＤＮＡ　ｌｉｂｒａｒｙ　ｏｆ　ｂｕｃｋｗｈｅａｔ　ｉｎ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．Ｔｈｅ　ｃｏｒｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｕｃｒｏｓｅ　ｓｙｎ－
ｔｈａｓｅ　ｇｅｎｅ（ＳｕＳｙ）ｗａｓ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ＰＣＲ　ａｎｄ　ａ　ｆｕｌ－ｌｅｎｇｔｈ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｗａｓ　ｃｌｏｎｅｄ　ｂｙ　Ｇｅｎｏｍｉｃ
Ｗａｌｋｉｎｇ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｆｕｌ－ｌｅｎｇｔｈ　ｏｆ　ＳｕＳｙ　ｇｅｎｅ　ｏｆ　Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ　ｔａｔａｒｉｕｍ
ｗａｓ　４　４２８ｂｐ　ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　１１ｉｎｔｒｏｎｓ　ａｎｄ　１２ｅｘｏｎｓ．Ｔｈｅ　ＯＲＦ　ｏｆ　ＳｕＳｙｇｅｎｅ　ｗａｓ　２　４１２ｂｐ，ｐｒｏｂａｂｌｙ　ｅｎｃｏ－
ｄｉｎｇ　ａｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　８０３ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ．Ｆｕｒｔｈｅｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ＳｕＳｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｈａｄ　ｈｏｍｏｌ－
ｏｇｙ　ｏｆ　８６％，８６％，８５％ ａｎｄ　８３％ ｗｉｔｈ　Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ　ｈｙｐｏｃｈｏｎｄｒｉａｃｕｓ，Ｂｅｔａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ，Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ
ｒｕｂｒｕｍ Ｌ，Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ．Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｄｏｍａｉｎ　ｓｅａｒｃｈｉｎｇ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ＳｕＳｙ　ｃｏｎｔａｉｎｅｄ　ａ　ＧＴｌ
ｓｕｃｒｏｓｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｄｏｍａｉｎ　ａｎｄ　ｆｏｕｒ　ｐｕｔａｔｉｖｅ　ＡＤＰ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｏｃｋｅｔｓ　ｗｈｉｃｈ　ｍａｙ　ｃａｔａｌｙｚｅ　ｔｈｅ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ
ｓｕｃｒｏｓｅ　６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｆｒｏｍ　ｆｒｕｃｔｏｓｅ　６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ａｎｄ　ｕｒｉｄｉｎｅ　５′－ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｇｌｕｃｏｓｅ．Ｔｈｉｓ　ｒｅｓｕｌｔ　ｌａｉｄ
ｔｈｅ　ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｕｃｒｏｓｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｉｎ　ｔａｒｔａｒｙ　ｂｕｃｋ－
ｗｈｅａｔ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ　ｔａｔａｒｉｕｍ；Ｓｕｃｒｏｓｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ；Ｇｅｎｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ
Ｒｅｃｅｉｖｅｄ　２０１４－１１－２６　　　　Ｒｅｔｕｒｎｅｄ　２０１５－０１－０３
Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｉｔｅｍ　Ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ（Ｇｒａｎｔ　Ｎｏ．３１１７１６０６）．
Ｆｉｒｓｔ　ａｕｔｈｏｒ　ＹＡＮ　Ｘｕｅｆｅｎ，ｆｅｍａｌｅ，ｍａｓｔｅｒ　ｓｔｕｄｅｎｔ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｒｅａ：ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎｄ　ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｘ－
ｕｅｆｅｎ３４１０２７＠１６３．ｃｏｍ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ　ＣＨＥＮ　Ｐｅｎｇ，ｍａｌｅ，Ｐｈ．Ｄ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｒｅａ：ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎｄ　ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｅ－ｍａｉｌ：
ｐｅｎｇｃｈｅｎ＠ｎｗｓｕａｆ．ｅｄｕ．ｃｎ
·６８· 西　北　农　业　学　报 ２４卷