全 文 :
苦荞提取物成分分析及不同极性提取物
对α-淀粉酶的抑制作用
周晓婷,张根义*
( 江南大学食品学院,食品科学与技术国家重点实验室,江苏省 无锡市 214122 )
摘 要:实验探究了不同极性苦荞提取物对 α-淀粉酶的抑制作用及机理。通过采用石油醚、乙酸乙酯与正丁
醇萃取获得不同极性的苦荞提取物,采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱法(UPLC-Q-TOF/MS)分
析提取物的成分。结果表明苦荞提取物中含有大量的黄酮类物质,主要包括芦丁、槲皮素、异槲皮素及其糖
苷等,还含有羟基苯甲酸等酚酸类物质。再以抑制率、抑制类型、荧光猝灭效应实验来分析提取物对 α-淀粉
酶的抑制作用。实验结果表明苦荞提取物对 α-淀粉酶的抑制作用表现为乙酸乙酯相提取物(Ethyl acetate
Extract, EE)、正丁醇相提取物(N-butyl alcohol Extract, BE)与粗提物(Crude Extract, CE)的结果类似,都
有较为显著的抑制作用,而石油醚相提取物(Petroleum ether Extract, PE)则没有明显且规律的抑制效果,可
推断出苦荞提取物中是各成分共同发挥了对 α-淀粉酶活性的抑制作用,且抑制类型为非竞争性抑制。通过荧
光猝灭实验得知抑制的机理为苦荞提取物中的成分与 α-淀粉酶结合,从而使 α-淀粉酶的荧光特性发生静态猝
灭。
关键词:液质联用;苦荞提取物;α -淀粉酶;酶抑制;荧光猝灭
中图分类号:TS201.2 文献标志码:A 文章编号:
Identification of main chemical constituents in extracts of Tartary Buckwheat and analyze the
effect of different polarity extracts on inhibition of α-amylase
ZHOU Xiao-ting, ZHANG Gen-yi*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Food Institute of Jiangnan University, Wuxi 214122, China)
Abstract:The purpose of this study was to investigate the inhibition of α-amylase activities from different polarity
extracts of tartary buckwheat. The extracts were separated by different polar solvent, namely Petroleum ether, Ethyl
acetate and N-butyl alcohol. An ultra performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight
mass spectrometry (UPLC-Q-TOF-MS) method in negative ion mode was established to investigate the major
constitutions in the extracts. Results showed that the majority of the extracts were rutin, several types of flavonoids
such as quercetin, quercetin-3-rutinoglucoglucoside, isoquercetin, kaempferol-3-o-rutinoside and also some phenols
like hydroxybenzoic acid.Then the inhibition rate, inhibition type and fluorescence quenching of α-amylase were
analyzed, which revealed that Crude Extract(CE), Ethyl acetate Extract(EE) and N-butyl alcohol Extract(BE)
significantly inhibited the activities of α-amylase whereas Petroleum ether Extract(PE) didn’t show the inhibiting
ability. Therefore, it can be inferred that the inhibition of α-amylase by tartary buckwheat extracts is likely a
combined action of different extracts with a noncompetitive inhibition type which determined by the kinetic analysis.
As fluorescence quenching experiments revealed, the fluorescence of α-amylase was statically quenched as the
α-amylase formed complex with the extracts of tartary buckwheat.
Key words:UPLC-Q-TOF/MS; extracts of tartary buckwheat; α -amylase; inhibition; fluorescence quenching
收稿日期:
基金项目:国家自然科学基金项目(31471585)
作者简介:周晓婷(1992-),女,硕士研究生,研究方向:营养与食品卫生。E-mail:zxtcelia@163.com
*通信作者:张根义(1969-),男,教授,博士,研究方向:食品安全。E-mail:genyiz@gmail.com
2016-11-14
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网络出版时间:2016-11-15 14:17:58
网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20161115.1417.002.html
苦荞[Fagopyrum tataricum Gaertn]又名鞑靼荞麦,是中国独有的一个荞麦栽培品种。主要栽培区域
集中在我国西南部的云贵川红土高原和北方黄土高原高海拔山岳地区,是当地人民十分重视的一种粮食
作物[1]。相比与其他禾谷类粮食作物,苦荞的营养价值十分丰富,苦荞麸皮及籽粒中含有多种生物活性
物质,已有的研究表明苦荞中所含的功能性物质主要包括苦荞黄酮,如芦丁、槲皮素、异槲皮素等[2,3]。
研究证实苦荞中的黄酮类物质具有降血糖、降血脂、抗氧化和抗肿瘤等功效,并且可以防治心脑血管硬
化、增强机体免疫力[4-6]。苦荞中的 D-手性肌醇是荞麦糖醇的生物降解产物,可以通过影响胰岛素的信
号传导发挥显著的降血糖作用[7]。
本实验先通过超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱法分析了提取物的成分,再采用粗分苦荞提
取物的方法,探究了不同极性苦荞提取物对 α-淀粉酶的抑制作用,并进一步分析抑制类型和作用机理,
为更深入的研究和应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
苦荞籽粒:江苏兴隆种业提供; α-淀粉酶(来源于猪胰腺)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼:西格玛奥
德里奇(上海)贸易有限公司 ;2-氯-4-硝基苯-α-半乳糖-麦芽二糖苷:上海田源生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
RE-52AA 型旋转蒸发仪:上海亚荣生化仪器厂;Spectra M5 型酶标仪:美国 Molecular Devices 公
司;ZNCL-GS 型恒温磁力搅拌器:上海科升仪器有限公司;F-7000 型荧光光谱仪:日本日立公司;Waters
MALDI SYNAPT MS 型液相色谱四极飞行时间串联质谱联用仪:美国沃特世公司。
1.3 方法
1.3.1 苦荞提取物的制备
苦荞籽粒先经粉碎机粉碎后,过 40 目筛待用。以 63%乙醇为提取溶剂,料液比 M 苦荞粉:V 乙醇=1:35
( g/mL ),80 ℃回流提取[8],抽滤所得的沉淀干燥后过 40 目筛,所得为苦荞残粉。上清液经旋蒸浓缩,
所得即为苦荞粗提物(Crude Extract, CE)。
将部分苦荞粗提物用相同体积的石油醚进行萃取,重复三次,合并滤液,减压蒸馏干燥。萃取所得
水相继续用乙酸乙酯进行萃取,重复操作,滤液减压蒸馏干燥。乙酸乙酯萃取所得水相继续用正丁醇进
行萃取,重复以上操作,从而制备出三种不同极性的苦荞提取物:石油醚相提取物(Petroleum ether Extract,
PE)、乙酸乙酯相提取物(Ethyl acetate Extract, EE)和正丁醇相提取物(N-butyl alcohol Extract, BE)[9]。
为便于实验操作,将已干燥在锥形瓶中的提取物溶解在 63%的乙醇中,制备成 20 mg/mL 的提取液。
1.3.2 液质联用分析苦荞提取物的成分
在经过 1.3.1 中方法处理得到苦荞粗提物溶液后,通过 UPLC-Q-TOF MS 分析苦荞提取物的成分。
实验采用美国沃特世公司生产的 Waters MALDI SYNAPT MS 型液相色谱四极飞行时间串联质谱联用
仪,色谱柱为 Waters ACQUITY UPLC BEH C18(100mm)柱,流动相 A 为乙腈,流动相 B 为水-甲酸溶
液(99.9:0.1,v/v),梯度洗脱条件如表 1 所示,流速为 0.3 mL/min,进样量为 1 μL,检测波长范围
为 200~600 nm,柱温为 45 ℃。质谱条件:离子源为 ES(-),离子源温度为 100℃,锥孔反吹气流量为
50 L/h,毛细管电压为 3 kV,碰撞能量 6 eV/ 20 eV,进样锥电压为 20 V,扫描范围 m/z 20~1000,检测
器电压为 2 kV。通过 Masslynx V4.1 软件进行数据分析,以鉴定苦荞提取物中的物质成分。
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表 1 UPLC-Q-TOF/MS 色谱梯度洗脱条件
Tab.1 Gradient elution program of UPLC-Q-TOF/MS
时间(min) 乙腈(wt) 水-甲酸(wt)
0 2 98
15 30 70
25 80 20
27 100 0
27.1 2 98
1.3.3 不同极性苦荞提取物对 α-淀粉酶的抑制作用
采用 GalG2CNP 速率法来测定 α-淀粉酶的活性。 α-淀粉酶催化 GalG2CNP 生成 CNP 后在 405 nm
处有特异吸收峰,因 CNP 生成的速率与 α-淀粉酶的活性成正比,故可用此方法通过测定 405nm 处的吸
光值来探究提取物对 α-淀粉酶活性的抑制率。
实验用 pH 6.0 的 2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液(MES 缓冲液)将 α-淀粉酶配制成酶液。将不同浓度
的粗提物提取液、石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相苦荞提取液与酶液等体积混合,使 α-淀粉酶的终
浓度为 145 U/mL,相应提取液浓度为 0~10 mg/mL。底物 GalG2CNP 溶液用添加了 50 mmol/L 的氯化钙
和 10 mmol/L 的氯化镁的 MES 缓冲液配制成 3 mmol/L。
将提取物与酶的混合液加入到 96 孔板中,每孔 5 μL,加入 200 μL 的底物 GalG2CNP 溶液,混合
后 37 ℃保温 60 s,在波长 405 nm 处测定 2 min 内的吸光度变化。因为此反应为速率动态反应,故可根
据反应速率求出抑制率:抑制率 = (V0-Vx) / V0×100%。
1.3.4 不同极性苦荞提取物对 α-淀粉酶的抑制类型实验
采用 Michaelis-Menten 动力学模型来探究苦荞提取物对 α-淀粉酶的影响。通过把不同极性的苦荞
提取物与不同浓度的特异性底物混合,使体系中 α-淀粉酶的最终浓度为 145 U/mL,苦荞提取物的终浓
度为 2 mg/mL,特异性底物 CNP 溶液的浓度在 0~2.5 mmol/L 的范围。
溶液混合后 37 ℃保温 60 s,在波长 405 nm 处测定 2 min 内的吸光度变化,相应的对照组不添加提
取物。反应结束后,以 1 / c[CNP]为横坐标,1 / [V]为纵坐标做 Lineweaver-Burk 双倒数曲线,分析图像,
根据交叉点所在位置来判断苦荞提取物对 α-淀粉酶的抑制类型[10]。
1.3.5 不同极性苦荞提取物对 α-淀粉酶荧光猝灭特性的影响
用无水乙醇和 pH 为 6.9 的磷酸盐缓冲液配制 1.2:8.8 的混合液体,并用其配制 α-淀粉酶液,使酶
在与提取物混合后的浓度为 145 U/mL。同时用 pH 为 6.9 的磷酸盐缓冲液配制终浓度在 0~2 mg/ml 范围
内的提取物溶液。
将酶液与提取物溶液混合后,37 ℃条件下反应 30 min,利用 F-7000 荧光仪测定荧光强度,设定激
发波长 EX为 282 nm,发射波长 Em为 300~450 nm[11,12]。
1.3.6 数据处理
在酶动力学实验中,每次实验重复三次,每个实验组设置 3~5 个平行。实验结果采用 Origin 8.5 软
件进行绘图与线性拟合。
2 结果与分析
2.1 UPLC-Q-TOF MS 分析苦荞提取物成分
UPLC-Q-TOF MS 技术被广泛用来分析药物、天然产物中的化学成分[13]。使用此技术对苦荞粗提物
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溶液进行成分分析得到图 1 。图像依次为一级质谱总离子图谱、二级质谱总离子图谱和紫外吸收液相色
谱图。一级质谱图中离子碰撞能量为 6 eV,二级质谱为 20 eV,故二级质谱图像中有更多的离子碎片峰。
为了鉴别苦荞粗提物溶液中所含物质,对色谱和质谱图进行综合分析。可知在保留时间为 0.87 m/z
时的峰为进样时的气泡,选取特征峰时锁定保留时间为 3.35、6.34 ~ 6.37、9.21、10.25、13.36 m/z 的峰
进行分析,并分别记为 A,B,C,D,E。其质谱图如图 2 所示,由于离子源为 ES(-),故 A 的分子量
应该为 354.2,考虑为绿原酸;化合物 B 分子量为 772.3,结合文献[14]可知此处的物质为槲皮素-3-芸香
糖葡萄糖苷;化合物 C 分子量为 610.3,此物质应为芦丁;化合物 D 分子量为 594.3,结合文献[14,15]可知
此物质为山柰酚-3-O-芸香糖苷;化合物 E 分子量为 302.1,可知此物质为槲皮素。
除上述的物质外,通过液质分析可知苦荞粗提物中还含有其他的黄酮类和少量的酚酸类物质,于是
可得出结论:苦荞粗提物中含有以芦丁为主的多种黄酮类物质,还包括槲皮素、槲皮素-3-芸香糖葡萄糖
苷、异槲皮素、山柰酚、山柰酚-3-O-芸香糖苷等,除此之外还有酚酸类物质如绿原酸、羟基苯甲酸等等。
图 1 苦荞粗提物的 UPLC-Q-TOF/MS 图
Fig. 1 The MS spectra and UV chromatogram of tartary buckwheat extracts
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图 2 苦荞粗提物的化合物负离子质谱图
Fig. 2 The MS spectra of tartary buckwheat extracts
2.2 不同极性苦荞提取物对 α-淀粉酶的抑制率
通过测定不同极性苦荞提取物对 α-淀粉酶的抑制率得到图 7:
0 2 4 6 8 10
-40
-20
0
20
40
60
80
100
抑
制
率
(
%)
提取物浓度(mg/mL)
CE
PE
EE
BE
图 3 不同极性苦荞提取物对 α-淀粉酶的抑制率曲线
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Fig. 3 Inhibition rate of different polarity extracts on α-amylase
从图 3 中粗提物、乙酸乙酯相与正丁醇相苦荞提取物的曲线可以看出,其对 α-淀粉酶的抑制作用
随提取物浓度的增大而增加,这表明了苦荞提取物对淀粉酶的抑制作用与其含量有关,但抑制率最高能
只达到 80%~90%的范围内,随后基本保持不变。而石油醚相中主要含有脂肪以及脂溶维生素和色素,
提取物在低浓度时有很小的抑制作用,在浓度增加时有一定的促进作用,并由于成分复杂不能确定其规
律。通过对实验数据进行多项式拟合可以得出不同极性苦荞提取物抑制 α-淀粉酶活性的 IC 50 值,数据
见表 1。乙酸乙酯相与正丁醇相苦荞提取物抑制 α-淀粉酶的 IC 50 值分别为 3.99 mg/mL 和 2.98 mg/mL,
粗提物抑制 α-淀粉酶的 IC 50 为 3.27 mg/mL,因此几种极性苦荞提取物对 α-淀粉酶的抑制能力由强到
弱为:正丁醇相提取物 > 粗提物 > 乙酸乙酯相提取物。综合上述实验结果可以得知苦荞提取物对 α-
淀粉酶的抑制作用可能是多种活性成分综合作用的结果,对于酶的抑制作用机理可以进行更深一步的分
析。
表 1 不同极性苦荞提取物抑制 α-淀粉酶活性的 IC50 值
Tab. 2 IC 50 of different polarity extracts on α-amylase
样品 拟合方程 决定系数 R2 IC50(mg/mL)
粗提物 y = - 1.18x3 + 10.41x2 - 6.12x - 1.42×10-14 0.999 3.27
石油醚相提取物 - - -
乙酸乙酯相提取物 y = - 0.16x3 + 1.43x2 + 9.60x - 0.75 0.979 3.99
正丁醇相提取物 y = 0.11x3 - 1.21x2 + 20.53x - 0.82 0.975 2.98
注:IC 50 : Half maximal inhibitory concentration
2.3 不同极性苦荞提取物对 α-淀粉酶的抑制类型
对 α-淀粉酶的抑制类型分析则着重于粗提物、乙酸乙酯相苦荞提取物与正丁醇相苦荞提取物。通
过将一定浓度的提取物和 α-淀粉酶混合再加入不同浓度底物的方式进行实验,做出 Lineweaver-Burk 双
倒数图,见图 4。
-1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
-100
0
100
200
300
400
500
600
对照组
2mg/mL CE
2mg/mL EE
2mg/mL BE
1/[
V]
1/[c](1/mmol/L)
图 4 含有不同极性苦荞提取物的 α-淀粉酶反应的 Lineweaver-Burk 图
Fig. 4 Lineweaver-Burk plot of the reaction of α-amylase in the presence of different polarity extracts
以 1/[c]为横坐标,1/V 为纵坐标做出双倒数图,得到图 4。从图中可以看出,实验组的拟合曲线与
对照组的拟合曲线均相交于 X 轴负轴,这代表了实验组中的苦荞提取物对 α-淀粉酶的抑制类型为非竞
争性抑制。添加的抑制剂与底物结构并不相似,抑制剂与酶的活性位点以外的部位结合,使酶分子形状
发生了变化,活性位点不适于接纳底物分子,从而降低了酶的活性。
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2.4 不同极性苦荞提取物对 α-淀粉酶荧光特性的影响
蛋白质的色氨酸残基、酪氨酸残基和苯丙氨酸残基,在一定的激发波下可以产生荧光效应,若添加
了外来物质可能会造成荧光猝灭的现象[16]。故采用添加不同浓度的各极性苦荞提取物后再测定 α-淀粉
酶的荧光特性可以进一步探究苦荞提取物对 α-淀粉酶的作用。
300 330 360 390 420 450
0
50
100
150
200
250
300
350
荧
光
强
度
波长(nm)
对照组
0.4mg/mL BE
0.8mg/mL BE
1.2mg/mL BE
1.6mg/mL BE
2.0mg/mL BE
图 5 不同极性苦荞提取物对 α-淀粉酶荧光特性的影响
Fig. 5 The effect of different polarity extracts of tartary buckwheat on α-amylase fluorescence characteristic
注:CE:粗提物;EE:乙酸乙酯相提取物;BE:正丁醇相提取物
图 5 中分别为添加不同浓度粗提物、乙酸乙酯相苦荞提取物、正丁醇相苦荞提取物后,α-淀粉酶的
荧光特性曲线。从图中可以看出,添加了提取物的曲线明显比未添加的平缓,峰值明显减小,并且随着
提取物添加量的增加,效果越明显,故可得出结论:苦荞提取物对 α-淀粉酶的荧光特性有猝灭作用,
并随着浓度的增加,猝灭效果越明显。且正丁醇相苦荞提取物组中发生的荧光猝灭效应最显著,粗提物
次之,乙酸乙酯相苦荞提取物组最弱。
同时可以看到,随着苦荞提取物添加量的增加,整体的吸收峰发生蓝移,峰蓝移或者强度发生变化
说明提取物中的某些物质与 α-淀粉酶发生了结合,从而导致了荧光性质的改变。荧光猝灭分为动态猝灭
与静态猝灭,而静态猝灭是基态荧光分子与猝灭剂结合形成配合物的结果,往往会引起荧光分子吸收光
谱的变化。故可判断提取物和 α-淀粉酶在实验中发生了结合,并初步确定整个过程中苦荞提取物使 α-
淀粉酶发生了静态猝灭[17]。这一结论也与已有的研究相吻合,已有很多实验证实芦丁、槲皮素均可使蛋
白质的荧光特性发生静态猝灭,进一步的热力学数据分析亦可证实它们通过特定的结合位点与蛋白质结
合产生了配合物[18-23]。
300 330 360 390 420 450
0
50
100
150
200
250
300
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荧
光
强
度
波长(nm)
对照组
0.4mg/mL CE
0.8mg/mL CE
1.2mg/mL CE
1.6mg/mL CE
2.0mg/mL CE
300 330 360 390 420 450
0
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100
150
200
250
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荧
光
强
度
波长(nm)
对照组
0.4mg/mL EE
0.8mg/mL EE
1.2mg/mL EE
1.6mg/mL EE
2.0mg/mL EE
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3 结论
(1) 苦荞粗提物中含有以芦丁为主的多种黄酮类物质,还包括槲皮素、槲皮素-3-芸香糖葡萄糖苷、异
槲皮素、山柰酚、山柰酚-3-O-芸香糖苷等,除此之外还有酚酸类物质如绿原酸、羟基苯甲酸等等。
(2) 乙酸乙酯相与正丁醇相苦荞提取物均对 α-淀粉酶有一定的抑制作用,几种极性苦荞提取物对 α-
淀粉酶的抑制能力由强到弱为:正丁醇相提取物 > 粗提物 > 乙酸乙酯相提取物;石油醚相提取物主要
包含的是脂溶性的物质,例如脂肪以及脂溶维生素和色素等,在苦荞提取物对 α-淀粉酶的抑制中没有起
主要作用。
(3) 粗提物、乙酸乙酯相和正丁醇相苦荞提取物对 α-淀粉酶的抑制均属于非竞争性抑制,提取物与酶
的活性位点以外的部位结合,改变了酶的性质,使酶的活性位点不适于接纳底物分子,从而降低了酶的
活性。荧光猝灭效应的结果也证明了提取物的确和 α-淀粉酶发生了反应,并产生了配合物使酶的活性
降低。
几种极性苦荞提取物对 α-淀粉酶的抑制能力不一,提取物是混合后共同抑制了 α-淀粉酶的活性。如
果欲进行进一步研究,可先通过液质联用分析不同极性苦荞提取物中几种主要成分的含量,再探究几种
提取物在对 α-淀粉酶抑制中的相互作用关系。
苦荞中功能性活性物质含量丰富,苦荞中的黄酮类物质尤其受到国内外研究学者的重视,已有很多
研究表明其对自由基清除能力、还原能力、对脂质体过氧化的抑制、清除一氧化氮的能力等等都有很显
著的作用[24-27]。但不同极性提取物间的相互作用的研究尚不明确,故可以进一步探究不同极性苦荞提取
物间的相互作用类型,对苦荞提取物功能性的实际应用也具有十分深远的意义。
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