全 文 ：论 著
文章编号 1006－8147（2012）04-0412-04
东北鹤虱提取物 LEGPS-Ⅱ对小鼠巨噬细胞氧化损伤
的保护作用
王 萌1，杨 柳 1，杨风蕊 1，阎 嘉 2，孟 林 1
（1.天津医科大学药理学教研室，天津300070；2.天坛生物制品股份有限公司，北京100024）
摘要 目的：研究东北鹤虱提取物 LEGPS-Ⅱ对小鼠巨噬细胞氧化损伤的保护作用。方法：采用昆明种小鼠，培养腹腔巨噬细胞
（MФ），实验分为 5组：正常对照组；H2O2氧化损伤组；3个浓度的 LEGPS-Ⅱ（30、60、120 μmol/L）保护组。用 MTT法测定细胞存
活率，比色法测定细胞培养液中一氧化氮（NO）含量、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）活力、总超氧化物歧化酶(T-SOD)活力、丙二醛
(MDA)含量。结果：与正常对照组相比，经 H2O2处理过的氧化损伤组，细胞存活率明显降低( P<0.01)，NO的含量、iNOS的活力明
显升高（P<0.01），T-SOD活力明显下降（P<0.01），MDA含量明显升高（P<0.01）；与 H2O2损伤组相比，给 LEGPS-Ⅱ各组均显著
提高细胞存活率（P<0.05，P<0.01）；使细胞培养液中 NO的含量、iNOS的活力显著降低（P<0.05，P<0.01），T-SOD活力显著提高
（P<0.05，P<0.01），MDA含量显著降低（P<0.01），且呈现剂量依赖性。结论：东北鹤虱提取物 LEGPS-Ⅱ可通过其抗氧化作用而
在不同阶段保护经 H2O2损伤的巨噬细胞
关键词 东北鹤虱；提取物；巨噬细胞；氧化损伤；小鼠
中图分类号 R965 文献标志码 A
Protective effects of LEGPS-Ⅱ from Lappula Echinata Gilib on murine peritoneal macrophages with
oxidative damage
WANG Meng1, YANG Liu1, YANG Feng-rui1, YAN Jia2, MENG Lin1
（1.DepartmentofPharmacology,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China;2.TiantanBiologicalProductsCo,Beijing100024,China）
Abstract Objective: To research the protective effects of Lappula Echinata Gilib extract (LEGPS -Ⅱ ) on murine peritoneal
macrophage with oxidative damage. Methods: The peritoneal macrophages from KM mice were cultivated in this experiment. The
macrophage were divided into 5 groups randomly: Control group; H2O2 group; 30, 60, 120 μmol/L LEGPS-Ⅱgroups. The viabilities of
macrophage were detected using MTT method. Activity of total superoxide dismutase(T-SOD), inducible nitric oxide synthase（iNOS）and
content of malondialdehyde (MDA) and nitric oxide(NO) in the culture medium were detected using colorimetric method. Results: Com－
pared with control group, in the group treated with H2O2 , the cell viabilities was decreased significantly（P<0.01), the content of NO and
the activity of iNOS were increased significantly（P<0.01), the activity of T-SOD was decreased（P<0.01), the content of MDA were in－
creased significantly（P<0.01); Compared with H2O2 group, in LEGPS-Ⅱ groups, the cell viability was increased significantly (P<0.05,
P<0.01), the content of NO and the activity of iNOS were decreased significantly (P<0.05, P<0.01), the activity of T-SOD was increased
(P<0.05, P<0.01), and the content of MDA were decreased significantly (P<0.01), with the concentration dependent. Conclusion: LEG－
PS-Ⅱ can protect peritoneal macrophage with H2O2 damage in different stages through its antioxidant effects.
Key words Lappula Echinata Gilib; extracts; macrophage; oxidative damage; mice
基金项目 天津市自然科学基金资助项目（003608511）
作者简介王萌（1989-），女，硕士在读，研究方向：中药药理学；通信
作者：孟林，E-mail：mdndy@126.com。
东北鹤虱（LappulaEchinataGilib，LEG）为紫草
科植物东北鹤虱的果实，盛产于我国华北、东北等
地区。药书记载，其味苦、辛、平，入脾、胃、肝三经，
可治疗虫积腹痛[1]，民间用其果实或全草水煎治疗
各种腹疼、腹泻，尤其对慢性、迁延性腹泻有独到的
疗效。前期研究证明其提取物LEGPS-Ⅱ对淋巴细
胞及巨噬细胞功能有增强或调节作用[2-3]，本文旨在
研究该提取物对小鼠巨噬细胞氧化损伤是否有保
护作用，进一步探讨其可能的作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂和药物 LEG产地为我国黑龙江省，种
子类药材，呈卵形，长约3～3.5mm，由黑龙江中医
药大学药学院药用植物学教研室于加宾教授鉴定。
取干燥的LEG，粉碎至20目，水煎煮，过滤除药渣
后合并药液，以水提醇沉法及Sevag法收集并除蛋
白，得到粉末状淡黄色提取物LEG-I。LEG-I经阴离
Vol． 18, No． 4
Dec． 2012
第 18卷 4期
2012年 12月
天津医科大学学报
Journal of Tianjin Medical University412
子交换柱层析再浓缩透析冻干得东北鹤虱提取物
（LEGPS-Ⅱ），淡黄色粉末，易溶于水，纯度为
38.7%。药物用PBS缓冲液配制成1mg/mL储备液，
0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，-20 ℃冰箱保存，临用
前用PBS缓冲液稀释成所需浓度。
RPMI-1640培养液，北京天润善达生物科技有
限公司；超级新生牛血清，美国Gibco公司；四甲基
偶氮唑盐（Methylthiazolyltetrazole,MTT），瑞士Flu-
ka公司；二甲基亚砜（Dimethylsulfoxide,DMSO），美
国Amresco公司；一氧化氮（NO）测试盒(硝酸还原
酶法)，南京建成生物研究所，批号 20101229；分型
一氧化氮合成酶（NOS）测试盒，南京建成生物研究
所，批号20101220；BCA蛋白浓度测定试剂盒,碧云
天生物技术研究所；总超氧化物歧化酶（SOD）试剂
盒，南京建成生物工程研究所，批号20110104；微量
丙二醛（MDA）试剂盒，南京建成生物工程研究所，
批号20101228。
1.1.2 实验动物 近交系清洁级昆明种小鼠，体质
量均为（20±0.25）g，4～6周龄，雌雄不拘，购自中国
人民解放军军事医学科学院实验动物中心（批准文
号：SCXK-2010-003），实验前置动物于室内适应环
境 1周，不限食水，室温 18～22 ℃，相对湿度 50%～
70%。
1.1.3 仪器 SW-CJ-1F型超净工作台（苏州净化
设备有限公司）；Forma SeriesⅡ型二氧化碳孵箱
（Thermo Electron Corporation）；CK40 生物倒置显微
镜（Olympus）；Model 680型酶标仪（Bio-Rad）；超声
波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；
BFX5-320型低速自动平衡离心机（白洋离心机厂）。
1.2 实验方法
1.2.1 小鼠腹腔巨噬细胞的制备 昆明种小鼠 1
只，颈椎脱臼处死，完全浸入 75 %酒精内消毒 5 min
后取出，移入超净台内固定其四肢。小鼠腹腔内注
入冷 PBS缓冲液 5 mL，轻揉腹部 5 min后，用眼科
剪小心剪开腹部皮肤，暴露腹膜。于腹膜上剪一小
口，用无菌吸管深入腹腔内吸回 PBS液。将吸出液
离心 1 500 r/min 10 min后弃上清，用含 10 %超级新
生牛血清的 RPMI-1640完全培养液重悬沉淀。台盼
蓝测定细胞存活率为 90 %以上，计数，用 RPMI-
1640培养液调整细胞浓度为 2×106/mL。无菌条件下
收集正常小鼠腹腔 MΦ悬液完毕。
1.2.2 LEGPS-Ⅱ对小鼠腹腔巨噬细胞活性的影
响 RPMI-1640 培养液调整细胞浓度为 2×106/mL
接种于 96孔板，将培养的细胞分为 5组：正常对照
组：加入等量培养液，不加任何药物；H2O2损伤组：
加入终浓度 0.2 mmol/L的 H2O2作用 0.5 h；LEGPS-
Ⅱ（30，60，120 μg/mL）保护组：分别加入不同浓度
的 LEGPS-Ⅱ孵育 3 h 后加入 0.2 mmol/L 的 H2O2，
继续孵育 0.5 h。每个浓度组设重复孔 6个，37 ℃二
氧化碳培养箱培养，后弃原培养基，各孔加入含
MTT 20 μL（终浓度 0.5 mg /L）的培养基继续培养
4 h，吸弃孔内培养液，每孔加入 100 μL DMSO，震荡
5 min，用酶标仪于 570 nm 波长处测定吸光度值，
以 OD 测定组/OD 对照组×100%计算细胞存活率。
1.2.3 NO、T-SOD、MDA的测定 实验分组同上，指
标测定按南京建成生物工程研究所试剂盒方法操作。
1.2.4 诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的测定 将巨
噬细胞接种于 6孔板中，实验分组同上，用细胞刮
将细胞刮下，将培养液在室温条件下 1 000 r/min离
心 10 min，弃上清留细胞沉淀。在细胞沉淀中加入
0.5～1 mL的生理盐水（等渗），轻轻颠倒混匀，将培
养液在室温条件下 1 000 r/min离心 10 min，弃上清
留细胞沉淀。重复这一操作 1～2次。超声破碎细胞，
功率 300 W，每 3~5 s超声 1次，间隔 4次（每次间
隔时间 30 s～1 min），超声过程中保证冰水浴。最后
1 000 r/min离心 10 min，所得上清即为样品。样品按
南京建成生物工程研究所试剂盒方法操作。
1.3 统计学方法 实验数据应用 SPSS17.0统计软
件进行处理，结果均以 x±s形式表示。多样本均数比
较进行方差齐性检验，组间比较采用单因素方差分
析（ONE WAY ANOVA），方差齐者采用 LSD法检
验，方差不齐者采用 Dunnett’s T3法检验。
2 结果
2.1 LEGPS-Ⅱ对 H2O2损伤的巨噬细胞存活率的
影响 见图1。
与对照组比较，H2O2处理使细胞存活率明显降
低（P<0.01）；与 H2O2组比较，LEGPS-Ⅱ各浓度组均
第 4期 王 萌，等.东北鹤虱提取物 LEGPS-Ⅱ对小鼠巨噬细胞氧化损伤的保护作用 413
显著提高细胞存活率（P<0.05，P<0.01），且各给药组
之间差异也有显著性（P<0.05，P<0.01）。
2.2 LEGPS-Ⅱ对小鼠腹腔巨噬细胞 NO及其合酶
的影响 与对照组相比，H2O2损伤组 NO的含量增
加 1倍以上（P<0.01）、iNOS活力提高 2倍（P<0.01）；
与 H2O2组相比，LEGPS-Ⅱ各浓度组均使 NO 的含
量降低（P<0.05，P<0.01）、iNOS的活力下降，且各组
间存在统计学差异（P<0.05，P<0.01）。见图 2、3。
2.3 LEGPS-Ⅱ对小鼠腹腔巨噬细胞 SOD 的影响
与对照组比较，H2O2处理使 T-SOD活力显著降
低（P<0.01）；与 H2O2组相比，LEGPS-Ⅱ各浓度组均
显著提高 T-SOD活力（P<0.05，P<0.01），但 60 μg/mL
及 120 μg/mL LEGPS-Ⅱ给药组之间 T-SOD活力差
异无统计学意义。见图 4。
2.4 LEGPS-Ⅱ对小鼠腹腔巨噬细胞 MDA 的影
响 与对照组比较，H2O2处理使 MDA含量明显升
高（P<0.01)；与 H2O2组相比，LEGPS-Ⅱ各组均显著
降低 MDA 含量（P<0.01），且各组间均有统计学意
义（P<0.01），见图 5。
3 讨论
自由基是一种含有不成对电子的原子、分子或
基团。超氧阴离子 O2-·、羟自由基·OH、过氧化氢
H2O2等通常称为活性氧自由基（ROS）。NO是一种
小分子气体，含有一个未配对的电子，因而具有自
由基性质。NO·及其生物体内激发产物统称为活性
氮自由基（RNS）。生理情况下机体产生的自由基很
少并参与机体的多种生理生化过程，体内还存在抗
自由基系统：一类是酶性防御系统，包括 SOD、谷胱
甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)、过
氧化氢酶(catalase, CAT)等；另一类是非酶性防御系
统，包括维生素 C、维生素 E、谷胱甘肽（glutathione,
GSH）[4-5]等。它们对清除自由基、保护细胞及机体正
常生理功能起重要作用。氧化应激是指由于 OFR过
量生成或细胞内抗氧化防御系统受损，导致 OFR及
第 18卷天津医科大学学报414
其相关代谢产物过量聚集，从而对细胞产生多种毒性
作用的病理状态。ROS和 RNS均可引起氧化应激。
H2O2是一种重要的 ROS，极易透过细胞膜，与
细胞内铁离子通过反应形成高活性的自由基，导致
一系列反应，其易于获得，性质相对稳定，所以它已
成为研究细胞氧化损伤的重要工具。本实验以 H2O2
造成小鼠腹腔巨噬细胞的氧化应激状态，观察东北
鹤虱提取物 LEGPS-Ⅱ的抗氧化损伤作用[6]。
iNOS主要分布于巨噬细胞、肝细胞等，当受到
某些细胞因子，如内毒素、白介素、脂多糖及干扰素
刺激后而表达。NO是在 iNOS催化下 L-精氨酸生
成 L-瓜氨酸的反应中形成的小分子气体自由基，研
究证实 NO 在各种炎性疾病病理过程中起重要作
用，炎性反应时，主要由巨噬细胞生成 NO。适量的
NO有助于杀灭病原微生物、减轻炎性反应等，但过
量的 NO可与超氧阴离子（O2-）等氧自由基反应，表
现为明显的细胞毒效应。本实验中，H2O2处理使巨
噬细胞培养液中 iNOS 活力增加，NO 含量明显升
高，提示 H2O2可引起巨噬细胞氧化损伤。在 LEG－
PS-Ⅱ的干预下，iNOS活力明显降低，NO含量明显
减少。由 iNOS催化合成的 NO是介导细胞毒性的
NO的主要来源，刺激因素下细胞内 iNOS是 NO产
生的重要限速酶[7-8]，提示 LEGPS-Ⅱ可能是通过抑
制 iNOS表达从而抑制细胞内 NO产生，因而发挥
抗氧化作用。
SOD催化 O2-歧化为 O2和 H2O2。此酶是已知抗
氧化酶系中速率最快的抗氧化酶之一，Vmax 约为
2×109mol/Ls。SOD是生物体内清除自由基的首要物
质，保护机体免受 ROS损伤，其值可以间接反映机
体清除 ROS的能力[9]。本实验在 H2O2诱导的巨噬细
胞氧化损伤中，LEGPS-Ⅱ能提高巨噬细胞 T-SOD
活力，发挥抗氧化作用。
体内最重要的脂质过氧化代谢产物是 MDA[10]，
MDA为极活泼的交联剂，随即与磷脂酰乙醇胺交联
成荧光色素，然后与蛋白质、肽类或脂质结合成难
溶性的无生理活性的色素斑点，沉积于细胞内，称
为脂褐素。因此 MDA 是反映机体 ROS 损害的指
标，测试 MDA的量不仅可反映机体内脂质过氧化
的程度，而且可间接反映细胞受 ROS攻击而损伤的
程度[11-12]。本实验中，LEGPS-Ⅱ能降低 H2O2损伤下
巨噬细胞 MDA的含量，减少脂质过氧化损伤。
本实验结果表明，东北鹤虱提取物 LEGPS-Ⅱ
对自由基具有清除作用，能抑制 iNOS表达而减少
细胞内 NO产生，能减少脂质过氧化产物 MDA的
生成量,还能提高抗氧化酶 SOD活性，表现出多种
途径的抗氧化作用。东北鹤虱具有广泛的生物活
性，而抗氧化损伤是其重要的作用机制之一。
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（2012-07-11收稿）
第 4期 王 萌，等.东北鹤虱提取物 LEGPS-Ⅱ对小鼠巨噬细胞氧化损伤的保护作用 415