全 文 :地耳草提取物(MSN)对5/6肾切除模型
大鼠肾功能及免疫状态的影响
高秋莲1,梅 湘1,杨德乾1,米 军2,刘伟伟1,赵 静1,张宝成1,高永翔1*
(1.成都中医药大学,四川 成都610075;2.成都南山药业有限公司,四川 成都610041)
摘 要:目的:探讨地耳草提取物(MSN)对慢性肾衰大鼠免疫功能及肾功能的影响。方法:将108只SD
大鼠随机分为模型对照组、MSN高、中、低剂量组、阳性对照组(金水宝组)、正常对照组(假手术组)。除
正常对照组外其余大鼠均制备成5/6肾切除慢性肾衰大鼠模型。观察用药前后各组大鼠 Urea、Crea、
Cys-C及24h尿蛋白定量的变化,及用药后 CD4+/CD8+比值和NK细胞的活性。结果:治疗前各造模
组Urea、Crea、Cys-C及24h尿蛋白定量均显著高于假手术组 (P<0.05),治疗后各治疗组及假手术组
Urea、Crea、Cys-C及24h尿蛋白定量均低于模型组(P<0.05),且 MSN各组与金水宝组之间无差异(P
>0.05)。MSN各剂量组CD4+/CD8+比值较模型对照组明显升高(P<0.05)。各用药组 NK细胞活
性均显著高于模型对照组(P<0.05),低于假手术组。结论:地耳草提取物能够改善慢性肾衰大鼠的肾
功能,同时调节其免疫状态,增强细胞及体液免疫,从而延缓肾脏衰竭的进程。
关键词:地耳草;提取物;慢性肾衰;肾功能;免疫状态
中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1673-2197(2014)03-0007-03
收稿日期:2013-12-16
作者简介:高秋莲(1988-),女,成都中医药大学硕士研究生,研究方向为中医药防治变态反应性疾病的实验与临床。
通信作者:高永翔(1965-),男,成都中医药大学教授,博士生导师,研究方向为中医药防治变态反应性疾病的实验与临床。
The Influence of Herba HypericiJaponici Extract(MSN)on Renal Function and Immune
Status of Chronic Renal Failure Model Rats with Five Sixths Kidney Removal
Gao Qiulian1,Mei Xiang1,Yang Deqian1,Mi Jun2,Liu Weiwei 1,Zhao Jing1,Zhang Baocheng1,Gao Yongxiang1*
(1.Chengdu university of TCM,Chengdu 610075,China;2.Chengdu nanshan
pharmaceutical co.,LTD,Chengdu 610041,China)
Abstract:Objective:To explore the influence of Herba HypericiJaponici extract(MSN)on immunity and renal function of chronic
renal failure rats.Methods:108SD rats were randomLy assigned to model control group,MSN usage groups(high,moderate and
low dose group),positive control group(cordyceps usage group)and normal group(sham operation group).Other rats were made to
chronic renal failure models with five sixths kidney removed except those in normal group.To observe the changes of Urea,Crea,
Cys-C and 24hquantitative urinary protein value in each group before and after medical usage and the CD4+/CD8+ratio and cytoac-
tive of NK cel after medical usage.Results:Before medication,the Urea,Crea,Cys-C and 24hquantitative urinary protein in each
group presented significantly higher than normal group(P<0.05),while after medication the Urea,Crea,Cys-C and 24hquantitative
urinary protein in each medical usage group and normal group show lower than model control group(P<0.05).Moreover,there
shows no difference between MSN groups and cordyceps usage group(P>0.05).CD4+/CD8+ratio in MSN groups increase signifi-
cantly higher than model group(P<0.05),and cytoactive of NK cel in MSN groups show significantly higher than model group(P<
0.05)while lower than normal group.Conclusion:Herba HypericiJaponici extract is able to improve renal function of chronic renal
failure rats,regulate the immune status and reinforce celular and humoral immunity so as to postpone renal failure.
Key Words:Herba HypericiJaponici;Extract;Chronic Renal Failure;Immune Status;Renal Function
慢性肾衰竭(chronic renal fail,CRF)是指慢性肾脏病
引起的肾小球滤过率下降以及与此相关的代谢紊乱和临床
症状组成的综合征。在其发展过程中,常伴有各种感染,从
而加速了肾脏衰竭的进程,甚至导致死亡、感染的发生,与
CRF患者机体的免疫功能受损有密切关系。地耳草提取物
(MSN)为地耳草的有效成分提取,地耳草为藤黄科植物,具
—7—
有利湿、解毒、活血、消肿的功效,临床应用地耳草治疗肾脏
疾病。本研究通过观察地耳草提取物(MSN)对5/6肾切除
法造成的大鼠慢性肾衰模型用药前后 Urea、Crea、Cys-C及
24h尿蛋白变化,及用药后各组CD4+/CD8+的比值与 NK
细胞活性的比较,探讨地耳草提取物对慢性肾衰大鼠的肾
功能及免疫状态的影响。
1 实验材料
1.1 动物
SPF级雄性SD大鼠108只,200~220g,质量合格证
号:No.0006045,许可证号:SCXK(川),由成都中医药大学
实验动物研究中心提供。
1.2 药物
地耳草提取物(由成都南山药业有限公司提供),为棕
黄色粉末,微溶于水,黄酮含量为65.20%,与0.5%CMC-
Na混悬后灌胃用。金水宝胶囊(规格0.33/粒,江西济民可
信金水宝制药有限公司,批号:20111203)。0.5%CMC-Na
(中国医药集团上海化学试剂公司,批号:F20111128)。
1.3 试剂
10%水合氯醛,乙醚,75%酒精,碘伏消毒液,甲硝唑氯
化纳注射液,无菌生理盐水。
1.4 仪器
TMS-1024i全自动生化仪:日本 TOKYO BOEKI公
司;酶标仪:Thermo Muliskan Ascant公司;流式细胞仪:
Beckman-Coulter Quanta SC流式细胞分析系统。
2 实验方法
2.1 分组及造模
SD大鼠先适应性喂养7天随机分为模型对照组、地耳
草提取物高、中、低剂量组、阳性对照组、正常对照组(假手
术组),18只/组。以10%水合氯醛(0.3mL/100g)腹腔注射
麻醉大鼠,常规消毒铺巾,对模型对照组、MSN高、中、低剂
量组、阳性对照组行左肾2/3切除术,用明胶海棉压迫切面
止血,1周后行第2次手术摘除右肾[1]。手术时要特别注意
避免损上肾上腺;正常对照组作平行假手术对照。
2.2 方法
于二次手术后第31天开始 MSN高、中、低剂量组分别
给予浓度为24、12、6mg/mL地耳草提取物,假手术组和模
型对照组以0.5%CMC-Na溶液灌胃,剂量均为1mL/100g,
bw,1次/d,连续30天。各组大鼠分别于二次手术后第14
天(治疗前)及给药结束次日(治疗后),由眼眶取血及腹主
静脉取血,检测各组大鼠Urea、Crea、Cys-C。并在两次采集
标本前1天将所有大鼠置于代谢笼中,收集24h尿蛋白。
并于给药结束次日大鼠解剖取残余肾脏组织,于10%甲醛
中固定,HE染色后观察组织学变化。
2.3 观察指标
用流式细胞仪测定二次手术后及给药结束次日各组大
鼠的CD4+、CD8+,用单克隆抗体 ADAAP进行检验,并计
算CD4+/CD8+的比值,治疗前后的大鼠 Urea、Crea、CysC
及24h尿蛋白由生化自动分析仪测定。
2.4 数据处理方法
计量资料以均数±标准差(珚x±s)表示,采用t检验及单
因素方差分析,SPSS17.0统计分析软件分析,P<0.05表
示差异有统计学意义。
3 结果
3.1 地耳草提取物(MSN)对Urea、Crea及Cys-C的影响
二次手术后14天(治疗前),通过眼眶取血,做血生化
检测,结果显示各造模组 Urea、Crea、Cys-C均显著高于假
手术组 (P<0.05),用药30天后于次日(治疗后)腹主静脉
取血,血生化检测显示,各用药组均能降低Urea、Crea、Cys-
C的含量,较模型组有差异(P<0.05),但地耳草提取物与
金水宝之间无明显差异(P>0.05)。见表1。
表1 各组治疗前后Urea、Crea、Cys-C测定结果比较
(珚x±s)
组别 时间 鼠数Urea(mmol/L)Crea(mmol/L)Cys-C(mg/L)
模型对
照组
治疗前
治疗后
15
12
16.51±2.34#
14.16±2.93#
98.52±10.56#
76.38±7.76#
0.98±0.21#
0.92±0.13
MSN高
剂量组
治疗前
治疗后
16
13
18.04±3.81#
9.35±1.43*#
92.84±13.85#
57.20±6.13*#
0.89±0.10#
0.67±0.16*
MSN中
剂量组
治疗前
治疗后
14
14
16.61±3.43#
8.84±0.86*#
89.68±20.56#
53.46±1.92*#
0.88±0.12#
0.56±0.04*
MSN低
剂量
治疗前
治疗后
14
13
16.08±3.84#
9.10±0.50*#
90.48±12.72#
54.73±3.10*#
0.92±0.10#
0.58±0.08*
阳性对
照组
治疗前
治疗后
13
10
17.21±3.38#
9.00±1.88*#
96.80±16.0#
55.53±6.58*#
0.91±0.11#
0.58±0.09*
假手
术组
治疗前
治疗后
14
14
5.82±0.98
5.91±1.04*
33.88±2.38
32.39±3.72*
0.29±0.03
0.30±0.03*
注:*P<0.05,与模型对照组比较;#P<0.05,与假手术组比较。
3.2 地耳草提取物(MSN)对CRF模型大鼠治疗前后
24h尿蛋白定量的影响
本实验于二次术后第14天,将大鼠置于代谢笼,检测
其尿蛋白定量。各造模组尿蛋白显著高于假手术组
(P<0.05),该结果符合慢性肾衰发展的过程。用药4周
后,MSN各组尿蛋白含量减少,与阳性药物组相比无明显
差异,但仍明显高于假手术组,说明 MSN可以延缓慢性肾
衰恶化的进程,显著减少蛋白尿(P<0.05)。
表2 治疗前后对各组大鼠24h尿蛋白
定量(g/24h)的影响 (珚x±s)
组别 治疗前 治疗后
模型组对照组 1.27±0.22# 1.23±0.25#
MSN高剂量组 1.17±0.36# 0.87±0.28#
MSN中剂量组 1.12±0.11# 0.90±0.16#
MSN低剂量组 1.20±0.17# 0.81±0.20#
阳性对照组 1.13±0.17# 0.86±0.13#
假手术组 0.49±0.07 0.51±0.07
注:#P<0.05,与假手术组比较。
3.3 地耳草提取物(MSN)对CRF模型大鼠T细胞亚群
及NK细胞活性的影响
于给药结束次日,取外周血抗凝,加相应荧光素孵育,
上流式细胞(Beckman-Coulter Quanta SC流式细胞分析系
统)检测,结果如下:MSN各剂量组CD4+/CD8+比值较模
型对照组明显升高(P<0.05),但是仍低于正常水平。各用
药组NK细胞活性均显著高于模型对照组(P<0.05),低于
假手术组。见表2。
3.4 肾脏病理改变
图A、B均来自模型对照组切除剩余肾组织,光镜下图
A示肾小管上皮细胞水肿,部分肾小管萎缩消失,部分小管
扩张,少数极度扩张呈囊性。小管中可见较多蛋白和细胞
管型。肾脏间质慢性炎性细胞浸润,伴纤维组织增生。图B
示肾小球系膜细胞增生,细膜间质增厚,肾小球球囊扩张。
本组残余肾脏形态学改变说明肾小体内细胞增生,系膜基
—8—
质增生,肾小管扩张,间质纤维组织增生,炎细胞浸润,出现
慢性肾衰纤维化早期病理改变,肾衰模型建立成功[2-4]。
表2 地耳草提取物(MSN)对CRF模型大鼠CD4+/CD8+
值及NK细胞活性的影响 (珚x±s)
组别 n CD4+/CD8+ NK细胞活性
模型对照组 12 1.87±0.13# 25.27±1.12
MSN高剂量组 13 2.06±0.12* 33.47±2.11*
MSN中剂量组 14 2.08±0.23* 32.78±1.84*
MSN低剂量组 13 2.06±0.18* 31.27±2.09*
阳性对照组 10 1.94±0.09 31.55±1.64*
假手术组 14 2.22±0.22 40.35±1.65
注:*P<0.05,与模型对照组比较;#P<0.05,与假手术组比较。
图A 肾小管
图B 肾小球
器官肾染色方法及放大倍数:HE,×10,组别:模型组对照组
4 讨论
MSN为地耳草的有效提取成分,地耳草为藤黄科植物
地耳草的全草,别名田基黄、刘寄奴,具有利湿退黄,清热解
毒,活血化瘀之功效,《福建民间草药》:“活血,破瘀,消肿,
解毒”,广州部队《常用中草药手册》:“清热解毒,渗湿利水,
消肿止痛”。而CRF属于祖国医学“癃闭”、“关格”等范畴,
基本病理变化为脾肾衰惫,气化不利,湿浊毒邪内蕴三焦。
与地耳草的功效相契合,临床研究中,地耳草可以治疗肾脏
疾病,并且能够明显改善CRF的症状,推迟患者进入透析
或移植治疗的时间[5-6]。现代药理研究表明[7-8],地耳草的化
学成分主要为黄酮类、内酯、香豆素、酚类、蒽醌等,药理作
用包括保肝,抑制癌细胞,增强免疫,抑菌,抗病毒,抗氧化,
止血以及对心血管的双向调节作用等。实验研究证明,用
药30天后(治疗后),各用药组均能降低 Urea、Crea、Cys-C
的含量,但MSN各组与金水宝之间无明显差异(P>0.05)。
MSN和阳性药物金水宝均能明显增加吞噬细胞的吞噬功
能(P<0.05);地耳草提取物各剂量组与金水宝相比无统计
学差异(P>0.05),表明地耳草提取物对CRF模型大鼠的
肾功能有一定的改善作用。T CD4+和CD8+是T淋巴细胞
的两个主要亚群,这两类细胞的数量及比例可反映机体的
免疫状态和功能,对维持机体内的免疫平衡具有重要作用,
高玲[9],孙脊峰[10]等证实慢性肾衰时CD3+、CD4+、CD8+细
胞及CD4+/CD8+细胞比值均较正常对照组显著下降。本
实验发现 MSN能不同程度地升高CD4+/CD8+比值,提示
其具有一定的调节免疫的作用。模型组的CD4+/CD8+下
降的极为显著,表明慢性肾衰会影响大鼠的免疫功能。用
药后,CD4+/CD8+有所增加,说明地耳草提取物对辅助性T
细胞(Th)具有增强作用,且对抑制性T细胞(Ts)具有抑
制作用,证明了 MSN对免疫功能具有调节作用。NK细
胞,即自然杀伤细胞,能够参与非特异免疫,同时对T、B淋
巴细胞有调节作用。本实验证实地耳草提取物能够明显增
强NK细胞活性。单核巨噬细胞不仅参与非特异性免疫防
御作用,而且也是特异性免疫应答的关键细胞,起抗原呈递
作用,广泛参与免疫应答、免疫效应与免疫调节。所以单核
巨噬细胞吞噬能力增强即机体免疫功能增强。地耳草提取
物能够明显提升免疫功能。
地耳草提取物(MSN)可以通过活化NK细胞和单核巨
噬细胞,增强其吞噬功能增强免疫,影响T细胞分化,改变
T细胞亚群,增大CD4+/CD8+,调节免疫,减少感染的发
生,同时,地耳草提取物能降低血 Urea、Crea、Cys-C的含
量,改善慢性肾衰大鼠的肾功能,延缓肾小球的病理改变,
从免疫与肾功能两个方面影响CRF发病的进程和肾脏相
关病理改变。虽然本实验在对地耳草提取物的研究取得一
定进展,但其在其他免疫细胞、因子等的影响有待进一步研
究。
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(责任编辑:姜付平)
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