全 文 ：利用 PCR和间接免疫荧光染色技术检测风信子黄腐病菌
胥婧 1 , 沈秀萍1 , 邵秀玲 2 , 胡白石 1＊ , 许志刚1
(1.南京农业大学植物保护学院 /农业部病虫监测与治理重点开放实验室 , 江苏 南京 210095;
2.山东出入境检验检疫局 , 山东 青岛 266002)
摘要:根据风信子黄腐病菌 (Xanthomonashyacinthi, XHA)的 fimA基因 , 合成了 1对特异性引物 JAAN/JARA, 目的片
段为 226 bp, 用来检测样本中有无目标细菌。用 XHA全菌体免疫家兔 , 获得抗血清 , 建立了检测风信子黄腐病菌的间
接免疫荧光染色检测技术。用上述两种方法对风信子黄腐病菌和人工接种发病样品进行检测。结果表明 , 这两种方法可
以准确 、 灵敏地检测风信子黄腐病菌及带菌样品 , 方法简单 、 快速 、 实用 , 可以在口岸检疫中推广使用 , 以减少风信子
黄腐病菌进入中国的风险。
关键词:风信子黄腐病菌;PCR检测;间接免疫荧光染色技术
中图分类号:S41-30　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-2030 (2007)04-0058-04
DetectionofXanthomonashyacinthibyPCRassayandindirect
immuno-fluorescentstainingmethod
XUJing1 , SHENXiu-ping1 , SHAOXiu-ling2 , HUBai-shi1＊ , XUZhi-gang1
(1.ColegeofPlantProtection/KeyLaboratoryofMonitoringandManagementofPlantDiseasesandInsects,
MinistryofAgriculture, NanjingAgriculturalUniversity, Nanjing210095, China;
2.ShandongEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau, Qingdao266002, China)
Abstract:PCRprimerpairJAAN/JARAwassynthesizedbasedonthefimAgene, todetectXanthomonashyacinthi(XHA)in
Hyacinthusplants.TheprimerpairwasspecificandcouldbeusedtodistinguishXHAfromotherbacteriainsamples.XHAwere
purifiedasanimmunogenforimmunizationofrabbit.TheantiserumagainstwholecelofXHAwasobtained.Usingthisantiserum,
indirectimmuno-fluorescentstaining(IIFS)wasdevelopedandappliedfordetectionofXHAculturesandartificiallyinoculated
plantsamples.TargetbacteriacouldbedetectedbyIIFSfrompureculturesandartificiallyinoculatedsamples.ThePCRandIIFS
proceduresdescribedinthisstudycanbeusedtodetectthisdiseaseinportsofChinaandreducetheriskofXHAentrytoChina.
Keywords:Xanthomonashyacinthi;PCRdetection;indirectimmuno-fluorescentstaining(IIFS)
风信子黄腐病菌 (Xanthomonashyacinthi)是各国限制入境的有害生物之一 , 也是我国禁止入境的
病原细菌之一。风信子黄腐病菌的寄主范围较广 , 主要危害风信子属 (Hyacinthus)植物 , 但也能侵害
百合科其他相关属的观赏植物 , 如蔓穗草 (Scilasp.)、 葡萄风信子 (Muscaribotryoides)、 条纹海葱
(Puschkiniasciloides)等 , 接种寄主有聚铃花 (S.hispanica)、 亚美尼亚麝香兰 (Muscariarmeniacun)
等 [ 1] 。据报道 , 风信子黄腐病最早发生在荷兰 , 其他发生地有日本 、 瑞典 、 丹麦 、德国等 , 但以荷兰
发生比较严重[ 1] , 我国尚未发现 。随着大量观赏植物的引进及种植 , 该病害传入我国的风险日渐加大 ,
目前我国尚未有检测该病菌的报道。本研究目的是建立快速 、灵敏的检测方法 , 对风信子的球茎或叶片
是否感染黄腐病菌进行检测及田间病害监测。
1　材料与方法
1.1　供试材料
参试菌株及样品见表 1。试验材料为新西兰大耳兔 , 12孔免疫荧光专用玻片 , FITC标记的羊抗兔
　　收稿日期:2007-04-27
　　基金项目:国家质检总局植物病原检测基金资助 (2005IK066)
　　作者简介:胥婧 , 硕士研究生。＊通讯作者:胡白石 , 副教授 , 从事植物检疫学研究 , E-mail:hbs@njau.edu.cn。
　南京农业大学学报　2007, 30 (4):58 ～ 61JournalofNanjingAgriculturalUniversity
IgG(华美公司), 缓冲甘油 [ 2] , Leica荧光显微镜等。 TaqDNA聚合酶 、 dNTP、 DNA标准分子质量购
自 TaKaRa公司。
表 1　供试菌株 、 样品及来源
Table1　Isolates, samplesandsources
病菌或样品 Isolatesorsamples 菌株代号 Code 来源 Source
风信子黄腐病菌 Xanthomonashyacinthi XHA (LMG739 ),XHA1, XHA2 比利时国家菌种收藏中心 BCCM/LMG
水稻白叶枯病菌 X.oryzaepv.oryzae Xoo 本研究室 Thislaboratory
水稻细菌性条斑病菌 X.oryzaepv.oryzicola Xooc 本研究室 Thislaboratory
甘蓝黑腐病菌 X.campestrispv.campestris Xcc 本研究室 Thislaboratory
柑橘溃疡病菌 X.axonopodispv.citri X.ci 本研究室 Thislaboratory
大豆斑疹病菌 X.axonopodispv.glycines Xag 本研究室 Thislaboratory
棉角斑病菌 X.axonopodispv.malvacearum X.mal 本研究室 Thislaboratory
麦类条斑病菌 X.translucenspv.cerealis Xtc 本研究室 Thislaboratory
卡特莱兰褐斑病菌 Acidovoraxavenaesubsp.catleyae A.a.cat R.WalcotGeorgiaUniversity
西瓜果斑病菌 A.avenaesubsp.citruli ATCC29625 R.WalcotGeorgiaUniversity
燕麦褐条病菌 A.avenaesubsp.avenae FC371 NW, SchaadISTA, USA
敏捷噬酸菌 A.facilis A.f-019 NW, SchaadISTA, USA
香石竹萎蔫病菌 Burkhoderiacaryophyli BSC 本研究室 Thislaboratory
番茄溃疡病菌 Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis CMM 本研究室 Thislaboratory
苜蓿细菌性萎蔫病菌 C.michiganensissubsp.insidiosus 2621 本研究室 Thislaboratory
菊欧文氏菌 Erwiniachrysanthemi E.ch 本研究室 Thislaboratory
大白菜软腐病菌 E.carotovorasubsp.carotovora E.c.c 本研究室 Thislaboratory
大肠杆菌 Escherichiacoli E.coli 本研究室 Thislaboratory
豌豆细菌性疫病 Pseudomonassyringaepv.pisi PSP 本研究室 Thislaboratory
桑疫病菌 P.syringaepv.mori P.mori 本研究室 Thislaboratory
黄瓜角斑病菌 P.syringaepv.lachrymans Psl8 中国农业科学院 CAAS
番茄细菌性叶斑病菌 P.syringaepv.tomato DC3000 本研究室 Thislaboratory
萝卜细菌性黑斑病菌 P.syringaepv.maculicola PSM 本研究室 Thislaboratory
青枯劳尔氏病菌 Ralstoniasolanacearum R.so 本研究室 Thislaboratory
金黄葡萄球菌 Staphylococcusaureus St.au 本研究室 Thislaboratory
风信子试验样本 Hyacinthplants 南京花神庙市场NanjingHuashenmiaoMarket
郁金香试验样本 Tulipplants 南京花神庙市场NanjingHuashenmiaoMarket
　　Note:BCCM/LMG:BelgianCo-ordinatedColectionsofMicro-organisms;ISTA:InternationalSeedTestingAssociation;CAAS:Chinese
AcademyofAgriculturalSciences
1.2　特异性引物的设计
特异性引物 JAAN和 JARA来源于风信子黄腐病菌 fimA基因 (GenBank登录号:AF281159), 所处
位置分别为 468 ～ 490bp和 671 ～ 694 bp, 引物序列分别是 5′-ACAACGACTCAGGCCGATGTTGG-3′和 5′-
CAGGTGGCAGGACGCAATTTCTCC-3′[ 3 -4] , 由 Invitrogen公司合成 。
1.3　PCR检测方法
PCR反应体系为:10×Bufer(10 mmol· L-1 Tris-HCl, pH8.3, 50 mmol· L-1 KCl)2.5 μL, 25
mmol·L-1 MgCl2 1.5 μL, 2.5 mol· L-1 dNTP1 μL, rTaqpolymerase0.5 U, 引物 JAAN、 JARA(20
mmol·L-1)各 0.5μL, 菌悬液 1μL, 双蒸水补足 25μL。 PCR反应程序为:95 ℃ 5min;94℃ 30s,
62 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 30循环;72 ℃ 7 min。取 8 μL扩增产物于 1%琼脂糖凝胶上电泳 , 120 V30
min, 溴化乙锭 (EB)染色 , Bio-RAD凝胶成像系统观察并进行图像采集和保存 。PCR的灵敏度测定:
将 XHA菌悬液用灭菌水稀释至 2×108 ～ 2×100 CFU· mL-1 , 取 1 μL作为模板进行扩增 , PCR产物在
1%琼脂糖凝胶电泳上检测 。
1.4　抗血清的制备
取 XHA在 NA平板上划线 , 挑取单菌落在 LB液体培养基中扩大培养 , 28 ℃培养 15 h, 离心去上
清液 , 用 0.008 g·mL-1 NaCl溶液洗涤 , 重复 3次 , 最后用相同质量浓度 NaCl溶液悬浮 , 使菌悬液为
10
9 CFU· mL-1。采用戊二醛法固定[ 5] 。常规免疫家兔 [ 6] , 最后一次免疫 10 d后采血 , 分离抗血清。
1.5　间接免疫荧光染色技术
1.5.1　间接免疫荧光染色程序　取 10μL用无菌水配制的约 107 CFU·mL-1的菌悬液 , 分别加到免疫荧光专
用玻片的孔中 (直径为 5mm), 热风吹干 , 玻片通过火焰固定。抗血清用 PBS(0.01mol·L-1 , pH7.4)稀
·59·第 4期　　　　　　　　　胥婧等:利用 PCR和间接免疫荧光染色技术检测风信子黄腐病菌
释 1 000倍 , 取 10μL加到相应的孔中 , 37℃保湿孵育 30 ～ 60min, 蒸馏水轻轻淋洗 (避免用水直接冲洗样
品), 风干。加 FITC标记的羊抗兔 IgG(用 0.01mol· L-1 PBS稀释至工作浓度), 每孔 10μL, 37℃保湿孵
育 30 ～ 60min, 淋洗 , 风干。加浮载液 (缓冲甘油), 盖玻片封片 , 荧光显微镜观察 、记录并照相。
1.5.2　灵敏度检测　将 XHA菌悬液用灭菌生理盐水 (0.008 g·mL-1)稀释到 2×108 ～ 2×100 CFU·
mL-1 , 荧光显微镜观察 、 记录并照相。
1.5.3　专化性检测　将所有参试菌株菌悬液稀释到约 2×106 CFU·mL-1 , 将 XHA菌悬液与其他参试菌株
菌悬液等体积混合 , 以不含 XHA的其他参试菌株混合菌悬液作对照 , 荧光显微镜观察 、记录并照相。
1.6　人工接种样品的检测
用无菌牙签蘸取 XHA菌苔 , 在风信子和郁金香叶片背面针刺接种 , 以接种无菌水的叶片做阴性对
照 。保湿 24 h, 人工气候箱中 (白天 25℃, 相对湿度 70%, 12 h;晚上 10 ℃, 相对湿度 95%, 12 h)
培养 14d[ 3] 。将接种发病样品叶片及健康叶片剪成 1cm2小段 , 每份样品加 1mL无菌水 , 4℃浸泡 1h,
吸取浸出液 。取 1 μL浸出液作为模板进行 PCR检测 。取 10 μL浸出液进行免疫荧光检测 。
2　结果与分析
2.1　风信子黄腐病菌的 PCR检测
将所有供试菌株配制成 2×108 CFU· mL-1的悬浮液 , 进行直接 PCR反应 。结果表明只有 XHA菌
株能扩增出 226bp的特异性片段 , 而其他参试菌株均无此片段。表明这对引物能特异地将 XHA与其他
细菌区分开 。由于参试菌株较多 , 只给出部分参试菌株的结果 (图 1)。
由图 2可见 , 大于 2×103 CFU· mL-1的菌悬液均可扩增出明显条带;而 2×102 CFU· mL-1的菌悬
液只出现了微弱条带 。表明该方法的灵敏度为 2×103 CFU· mL-1。以人工接种发病的风信子叶片的浸
出液作为模板进行 PCR检测 , 结果表明 , 除健康叶片外 , 发病部位的浸出液 PCR检测结果均呈阳性 。
图 1　引物特异性测定
Fig.1　Primerspecificitytest
1.XHA;2.XHA1;3.XHA2; 4.Xooc; 5.Xcc;6.X.ci;
7.Xag; 8.X.mal;9.ATCC29625;10.Xtc;M.Marker
图 2　PCR检测灵敏度与人工接种样品的 PCR检测
Fig.2　Sensitivitytestanddetectionofartificialyinocula-
tedX.hyacinthi(XAH)
1-6.2×105 -2×100 CFU· mL-1 ofXHArespectively;7.H2O;
M.Marker;8, 10.Inoculatedsamples;9.XHA;CK.Negativecontrol
2.2　风信子黄腐病菌的间接免疫荧光检测
专化性和灵敏度测定:含 XHA的菌株菌悬液呈阳性反应 , 不含 XHA的其他菌株混合液未发现阳性
细胞 (图 3)。经间接免疫荧光染色方法检测与其他属细菌无明显交叉反应。间接免疫荧光染色方法的
灵敏度可达到 2×103 CFU· mL-1 (图 4)。
人工接种样品的检测:利用制备的抗血清 , 对人工接种 XHA发病叶片和健康叶片样品进行检测。结
果表明 , 所有接种样品均呈阳性反应 (图 5-A, B, C), 健康叶片则未见有发荧光的细菌 (图 5-D)。
图 3　间接免疫荧光染色检测专化性结果
Fig.3　Specificityofindirectimmuno-fluorescentstainingdetection
A.XHA+PSP;B.XHA+Xcc;C.XHA+St.au;CK.SuspensionofmixedbacteriawithoutofXHA
·60· 　　　　　　　　　　　　　　南　京　农　业　大　学　学　报　　　　　　　　　　　　　　第 30卷
图 4　间接免疫荧光染色检测灵敏度结果
Fig.4　Sensitivityofindirectimmuno-fluorescentstainingdetection
A. 2×105 CFU· mL-1;B. 2×104 CFU· mL-1;C. 2×103 CFU· mL-1;CK.H2O
图 5　风信子黄腐病菌人工接种样品的间接免疫荧光染色检测结果
Fig.5　Indirectimmuno-fluorescentstainingdetectionresultsofartificialyinoculatedsamples
A, BandC.人工接种样品 Artificialyinoculatedsamples;D.健康样品 Heathsample
3　讨论
风信子黄腐病菌是风信子上危害最重的种传病害。我国每年都从国外引进数量巨大的风信子和郁金
香等花卉球茎 , 病菌随之传入我国的风险很大 , 迫切需要建立一种快速 、 灵敏 、专一性好的检测技术来
阻止风信子黄腐病菌传入我国 。
已有一些分子生物学方法应用到病原物的检测中 , 通常都是将 ITS以及 rDNA序列作为检测靶
标 [ 7-8] 。本研究首次在我国建立了风信子黄腐病菌的分子生物学和间接免疫荧光染色检测技术。同时我
们也发现致病性相关基因也可作为分子检测靶标 , 这为病原物的检测提供了新的思路。本试验以 fimA
基因作为分子检测靶标 , 利用特异性引物 , 能特异地检测到风信子黄腐病菌。该方法具有专化性好 、灵
敏度高的特点 , 全部检测程序可在 4 h内完成。
本研究表明 , 利用风信子黄腐病菌菌体制备的抗血清所建立的间接免疫荧光染色方法检测风信子黄腐
病菌 , 耗时短 , 专化性较好 , 全部程序可在 3h内完成 , 适合口岸对该病菌的检测。间接免疫荧光染色方
法灵敏度与 PCR技术相当 , 该技术操作简单 , 不需要复杂设备 , 一般实验室均可随时进行检测 , 是一种准
确而简便的检测方法。该方法与其他血清学方法相比 , 具有更直观的效果 (能够观察到菌体形态)。
本研究建立的检测风信子黄腐病菌的间接免疫荧光染色技术和 PCR技术 , 可在我国口岸检疫部门
推广 , 以提高对风信子黄腐病菌的检测水平 , 减少风信子黄腐病菌进入的风险 。
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责任编辑:夏爱红
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