全 文 ：第３６卷第３期
２　０　１　３年５月
河 北 农 业 大 学 学 报
ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　ＯＦ　ＨＥＢＥＩ
Ｖｏｌ．３６Ｎｏ．３
Ｍａｙ．２　０　１　３
　 　
文章编号：１０００－１５７３（２０１３）０３－００７７－０５
葡萄根癌病病原菌类型鉴定及几种杀菌剂
和抗菌素对其抑菌效果
张　洁，　师校欣，　焦延静，　杨丽丽，　杜国强
（河北农业大学 园艺学院，河北 保定０７１００１）
摘要：以‘巨峰’葡萄茎部及根部癌瘤为材料，于培养基上分离根癌病原菌相似菌株，采用与生长素合成有关基
因序列引物及葡萄土壤杆菌６ｂ特异基因序列引物对这些菌株ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，其中有６株菌株中扩增获
得特异性目的条带，鉴定为葡萄土壤杆菌章鱼碱类型。通过对向日葵的接种试验，筛选出毒性最强株系。采用
抑菌圈法检测了９种杀菌剂和抗菌素对该菌株的抑菌效果。结果表明：７２％农用硫酸链霉素对该菌株的抑制作
用显著，其２００倍稀释液抑菌圈直径为３８．８４ｍｍ；其次为三氯异氰尿酸和８０％乙蒜素，二者抑菌圈直径分别为
１７．３７ｍｍ和１０．６６ｍｍ。参试的２０％龙克菌、８０％多菌灵、３％中生菌素、４０％可杀得三千、２％春雷霉素、２５％
叶枯唑对该菌株无明显抑制作用。
关　键　词：葡萄根癌病；病原菌类型；ＰＣＲ检测；致病性；杀菌剂和抗菌素
中图分类号：Ｓ６６３ 文献标志码：Ａ
Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｃｏｌｅｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｃｒｏｗｎ　ｇａｌ　ａｎｄ　ｅｆｆｉｃａｃｙ
ｏｆ　ｓｏｍｅ　ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄｅｓ　ａｎｄ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　ｔｏ　ｔｈｅｉｒ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｉｎ　ｇｒａｐｅｓ
ＺＨＡＮＧ　Ｊｉｅ，ＳＨＩ　Ｘｉａｏ－ｘｉｎ，ＪＩＡＯ　Ｙａｎ－ｊｉｎｇ，ＹＡＮＧ　Ｌｉ－ｌｉ，ＤＵ　Ｇｕｏ－ｑｉａｎｇ
（Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｈｅｂｅｉ，Ｂａｏｄｉｎｇ　０７１００１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｃｏｌｅｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｃｒｏｗｎ　ｇａｌ　ｔｈａｔ　ｌｏｃａｔｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｂａｓａｌ　ｐａｒｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｔｅｍｓ　ａｎｄ
ｏｎ　ｔｈｅ　ｒｏｏｔｓ　ｉｎ‘Ｋｙｏｈｏ’ｇｒａｐｅｖｉｎｅｓ　ｗｅｒｅ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ　ｉｎ　ｐｅｔｒｉ　ｄｉｓｈｅｓ．Ｔｈｏｓｅ　ｓｔｒａｉｎｓ
ｓｉｍｉｌａｒ　ｔｏ　ｔｈｅ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｗｅｒｅ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｂｉｏｔｙｐｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ＰＣＲ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｗａｓ　ｃａｒ－
ｒｉｅｄ　ｏｕｔ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｔｈａｔ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ａｕｘｉｎ　ａｎｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　６ｂ
ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｇｅｎｅ　ｉｎ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ．Ｓｉｘ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈｅ　ｔｙｐｉｃａｌ　ｂａｎｄｓ，ｗｈｉｃｈ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ
ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｂｉｏｔｙｐｅ　ｏｆ　ｏｃｔｏｐｉｎｅ．Ｔｈｅ　ｓｔｒａｉｎ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｓｔｒｏｎｇｅｓｔ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　ｗａｓ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ
ｏｕｔ　ｂｙ　ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｓｔｅｍ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ．Ｔｈｅｎ，ｔｈｅ　ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｓｉｓ　ｏｆ　ｎｉｎｅ
ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄｅｓ　ｏｒ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　ｗａｓ　ｔｅｓｔｅｄ　ｔｏ　ｔｈｉｓ　ｓｔｒａｉｎ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｚｏｎｅ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ　ｒｅ－
ｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　７２％ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ　ｓｕｌｆａｔｅ　ｆｏｒ　ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ｕｓｅ　ｇｒａｄｅ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　２００ｔｉｍｅｓ　ｄｉｌｕ－
ｔｉｏｎ　ｈａｄ　ａ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｔｒａｉｎ　ｗｉｔｈ　ａ　ｄｉａｍｅｔｅｒ　ｏｆ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｚｏｎｅ　ｏｆ　３８．８４
ｍｍ，ｆｏｌｏｗｅｄ　ｂｙ　ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｉｓｏｃｙａｎｕｒｉｃ　ａｃｉｄ　ａｎｄ　８０％ｅｔｈｙｌｉｃｉｎ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｄｉａｍｅｔｅｒ　ｏｆ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｚｏｎｅ　ｏｆ
　　　　　　　　　　　
收稿日期：２０１２－１１－２６
基金项目：国家葡萄产业技术体系（ＣＡＲＳ－３０－３）．
作者简介：张　洁（１９８８－），女，山西省运城人，在读硕士生，研究方向为果树生物技术．
通讯作者：杜国强（１９６６－），男，河北省石家庄人，教授，从事果树生物技术研究．Ｅ－ｍａｉｌ：ｇｄｕ＠ｈｅｂａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ．
７８　 河 北 农 业 大 学 学 报　　　　 第３６卷　 　
１７．３７ｍｍ　ａｎｄ　１０．６６ｍｍ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｔ　ｏｎｅｓ　ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　２０％ｔｈｉｏｄｉａｚｏｌｅ－ｃｏｐｐｅｒ，８０％
ｃａｒｂｅｎｄａｚｉｍ，３％ｚｈｏｎｇｓｈｅｎｇｍｙｃｉｎ，４０％ｃｏｃｉｄｅ，２％ ｋａｓｕｇａｍｙｃｉｎ，ａｎｄ　２５％ ｂｉｓｍｅｒｔｈｌａｚｏｌ
ｓｈｏｗｅｄ　ｎｏ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｇｒａｐｅ　ｃｒｏｗｎ　ｇａｌ；ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｉｏｔｙｐｅ；ＰＣＲ　ａｎａｌｙｓｉｓ；ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ；ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄｅｓ
ａｎｄ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ
　　葡萄根癌病是一种世界性病害，在我国葡萄产
区普遍发生，其典型症状是形成肿瘤，破坏植株的皮
层并堵塞其疏导组织，影响水分及营养的吸收，致使
植株生长迟缓、树势衰弱、果穗小而少、果粒不均一、
产量降低，严重时枝蔓或全株枯死，甚至造成毁
园［１］。２００９年冬我国北方葡萄根癌病大发生，在新
疆、山东、河北、北京等地一些葡萄园病害十分严重，
感病品种的发病率在３０％～９０％以上，对葡萄生产
影响巨大。目前国内外已报道的引起葡萄根癌病的
病原菌有葡萄土壤杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｖｉｔｉｓ）、根
癌土壤杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ），其中葡
萄土壤杆菌是主要的致病菌［２］。不同杀菌剂和抗生
素因土壤杆菌生物型不同而表现出不同的抑制效
果，如福美双对生物ＩＩＩ型根癌菌有较强抑制作用，
对Ｉ、ＩＩ型仅有轻微抑制作用；而青霉素对Ｉ、ＩＩ型根
癌菌无抑制作用，对ＩＩＩ型抑制作用较强［３］。明确
不同地区葡萄根癌病菌的株系类型，可为筛选有效
的化学杀菌剂和抗生素提供理论依据。当前运用分
子生物学方法检测葡萄根癌病菌的报道很少，多集
中在引起其他树种根癌病的根癌土壤杆菌方面。
Ｂｉｎｉ等［４］利用ｉａａＨ－Ｆ２／ｉａａＨ－Ｒ１及Ｓ４ｉａａＭ５／Ｓ４ｉａａＭ３
引物对从章鱼碱型、胭脂碱型根癌土壤杆菌和葡萄土
壤杆菌中扩增出ｉａａＨ 基因及从冠瘿碱类型为精氨
酸的葡萄土壤杆菌中扩增出ｉａａＭ 基因，为病原菌类
型鉴别及明确致病机理提供了有益参考。
葡萄根癌病病原菌的致病能力主要是由其Ｔｉ
质粒决定的，病原菌可以将Ｔｉ质粒的Ｔ－ＤＮＡ转移
到植物细胞并整合进植物基因组。Ｔ－ＤＮＡ上有致
瘤基因区编码生长素和细胞分裂素的合成，这些基
因表达合成的产物参与寄主细胞内激素的合成与分
解代谢，导致寄主细胞内激素失衡而无控增生形成
肿瘤［１］，由于其特殊的致病机制目前生产上尚未找
到有效的防治措施。Ｋａｗａｇｕｃｈｉ等研究结果表
明［５－６］，非致病葡萄农杆菌株系ＶＡＲ０３－１和ＡＲＫ－１
的浸提液对葡萄根癌病病原菌具有一定抑制作用，
且两者作用机制不同；Ｚｏｋ等［７］利用植物基因工程
方法将ｖｉｒＥ１基因转入葡萄杂交种Ｒｉｃｈｔｅｒ　１１０中，
获得了抗葡萄根癌病株系；同时，运用中草药对大樱
桃根癌病菌、植物提取物或有机化合物对根癌土壤
杆菌的室内抑菌作用研究也取得了一定进展［８－１０］；
然而应用化学杀菌剂和农用抗生素对葡萄根癌病的
防治作用依旧不可忽视。目前生产中存在对于细菌
性病害防治有效的杀菌剂或抗菌素即会对葡萄根癌
病菌有防治效果的认识误区，致使果农盲目用药，或
仅结合葡萄常见病害防治用药，对根癌病防治效果
很不理想。有关常见广谱性化学杀菌剂及农用抗生
素对葡萄根癌病菌的抑菌效果鲜见报道，本研究拟
通过分离培养葡萄根癌病病原菌，并运用分子生物
学手段明确我国定州发生的葡萄根癌病菌的致病菌
类型；采用２０％龙克菌、８０％多菌灵可湿性粉剂
ＷＰ、３％中生菌素、７２％农用硫酸链霉素、８０％乙蒜
素、三氯异氰尿酸、４０％可杀得三千、２％春雷霉素、
２５％叶枯唑等９种杀菌剂和抗生素对所分离到的最
强毒性菌株进行室内药效评价，以期为葡萄根癌病
的有效防治提供理论依据。
１　材料和方法
１．１　试材
试材采于河北省定州市葡萄园，供试葡萄品种为
‘巨峰’，树龄１２年生，单篱架栽培，栽植密度１．０ｍ×
１．８ｍ。向日葵种子品种为‘美国矮大头６５８’，保定
市富奥种子有限公司生产。供试药剂：２０％龙克菌
（浙江龙湾化工有限公司）、８０％多菌灵可湿性粉剂
ＷＰ（河北安格诺农化有限公司）、３％中生菌素（福
建凯立生物制品有限公司）、７２％农用硫酸链霉素
（河北三农农用化工有限公司）、８０％乙蒜素（浙江平
湖农药厂）、三氯异氰尿酸（武汉驰飞化工制造科技
有限公司）、４０％可杀得三千（上海杜邦农化有限公
司）、２％春雷霉素（北兴化学工业株式会社）、２５％叶
枯唑（深圳诺普信农化股份有限公司）。
１．２　病原菌的分离培养和分子生物学鉴定
１．２．１　病原菌的分离和培养　根癌瘤的采集：于６
月上旬采集葡萄茎部及根部幼嫩癌瘤，放入自封袋
带回实验室，４℃冰箱保存。
第３期 张　洁等：葡萄根癌病病原菌类型鉴定及几种杀菌剂和抗菌素对其抑菌效果 ７９　　 　
病原菌分离和培养：参照马德钦等［２］的方法，取
根癌瘤内部新鲜组织，经表面灭菌、捣碎，加少量无
菌水混合后，取上清液涂于改良 Ｗｈｉｔｅ（ＭＷ）培养
基［２］平板上，２８℃条件下培养５～７ｄ。挑取表面光
滑、圆形突起菌落，置于酵母提取物肉汤（ＹＥＢ）培
养基平板上纯化２次，于４℃保存待用。
供试阳性对照为根癌土壤杆菌２－２－１菌株，由
河北农业大学林学院杜克久教授惠赠。
１．２．２　病原菌的分子生物学鉴定　细菌质粒提取
参照《分子生物学实验指南》第３版［１１］，ＰＣＲ扩增引
物序列及用途见表１，引物由上海生工生物技术有
限公司合成。
表１　试验用引物及用途
Ｔａｂｌｅ　１　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｐｕｒｐｏｓｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｅｓｔ
引物名称
Ｐｒｉｍｅｒ
引物序列
Ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５’→３’）
用途
Ｐｕｒｐｏｓｅ
ｉａａＨ－Ｆ２／ｉａａＨ－Ｒ１
５’ＡＣＡＴＧＣＡＴＧＡＧＴＴＡＴＣＧＴＴＴＧＧＡＡＴ３’
５’ＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＣＡＴＣＧＴＡＡＡＡＧＴＡＧＧＴ３’
扩增章鱼碱型和胭脂碱型土壤杆菌Ｔ－ＤＮＡ上的
ＩＡＡＨ 基因
Ｓ４ｉａａＭ５／Ｓ４ｉａａＭ３
５’ＣＧＣＧＴＣＣＣＣＧＴＴＴＡＣＡＣＴＡ３’
５’ＣＧＡＧＡＴＣＧＣＧＣＴＴＣＡＡＧＡＴ３’
扩增含精氨酸葡萄土壤杆菌Ｔ－ＤＮＡ上的ＩＡＡＭ
基因
ＴＦ／ＴＲ
５’ＴＧＧＣＣＧＡＡＡＴＴＧＴＴＴＡＣＴＴＣＣＡＣＣＣ３’
５’ＣＴＡＴＧＣＣＧＡＡＡＧＡＣＧＧＣＴＴＧＡＣＣＣ３’
扩增章鱼碱型葡萄土壤杆菌Ｔｉ质粒的６ｂ基因
ＮＦ／ＮＲ
５’ＴＴＡＡＣＣＣＡＡＡＴＧＡＧＴＡＣＧＡＴＧＡＣＧＡ３’
５’ＴＴＡＴＴＴＣＧＧＴＡＣＴＧＧＡＴＧＡＴＡＴＴＡＧ３’
扩增胭脂碱型葡萄土壤杆菌Ｔｉ质粒的６ｂ基因
　　２５μＬ反应体系中含有１０×ＰＣＲ缓冲液２．５
μＬ，５％二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）１．２５μＬ，各引物１．２５μＬ
（２．５μｍｏｌ／Ｌ），ｄＮＴＰ　Ｍｉｘ　２μＬ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ），Ｔａｑ
酶０．２５μＬ（５Ｕ／μＬ），模板１μＬ，无菌水补足至２５
μＬ。ｉａａＭ 及ｉａａＨ 基因的扩增于同一反应体系中
同时进行，以根癌土壤杆菌２－２－１菌株为阳性对照，
无菌水为阴性对照；扩增６ｂ基因时Ｌ－Ｒ菌株（本试
验室分离保存的章鱼碱类型葡萄土壤杆菌）为阳性
对照，２－２－１菌株为阴性对照。
反应程序：９４℃预变性１ｍｉｎ；３２个循环为９２℃变
性１ｍｉｎ，５４℃（ｉａａＨ－Ｆ２／ｉａａＨ－Ｒ１，Ｓ４ｉａａＭ５／Ｓ４ｉａａＭ３）、
６０℃（ＴＦ／ＴＲ）或５８℃（ＮＦ／ＮＲ）退火１ｍｉｎ，７２℃
延伸１．５ｍｉｎ；最后延伸７２℃３ｍｉｎ。
反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳并照相。
１．２．３　病原菌株致病性分析　将检测到目的基因
的各菌株于ＹＥＢ平板上划线培养，在２８℃恒温培
养箱培养２４ｈ后，挑选生长饱满的单菌落接种于
ＹＥＢ液体培养基中，２８℃下以２００ｒ／ｍｉｎ震荡过夜
培养至对数生长期。以划伤接种方式将菌液接种到
生长７～１０ｄ的向日葵幼苗根颈处，每菌株接种１０
棵苗，每株接菌１００μＬ，观察并记录发病情况，从
中筛选出致病力最强的菌株供以后室内药效评
价使用。
１．３　杀菌剂抑菌效果研究
室内抑菌试验采用纸片抑菌圈法进行，分别制
备２００，４００，８００，１　０００，１　２００，１　４００，１　６００倍各药
剂稀释液及ＹＥＢ平板，用上述方法制备毒性菌株活
性菌液，培养基上加入１５０μＬ已制备好的供试病原
菌菌悬液，细菌涂布器涂匀。将已灭菌且烘干的直
径６ｍｍ滤纸片（用打孔器自制）加入各药剂不同倍
数稀释液１５μＬ，在无菌条件下自然风干，分别放入
已接菌的培养基平板上，每皿２片，３次重复。培养
皿先于４℃冰箱中放置４～６ｈ，此时供试菌不生长，
而滤纸片上的药剂能够均匀渗透和扩散［１２］，然后置
于２８℃恒温培养箱中培养４８ｈ，从滤纸片的３个不
同方向测量抑菌圈直径。
２　结果与分析
２．１　病原菌的分离培养及类型分析
在琼脂培养基上典型的土壤杆菌菌落为白色、
光滑、圆形、半透明［１３］，在 ＭＷ 筛选培养基上为小
的圆形突起，半透明，带粘性［２］。从供试的２个茎部
癌瘤和２个根部癌瘤中共分离得到３２株与病原菌
相似菌株，分别提取ＤＮＡ后用扩增章鱼碱型和胭
脂碱型土壤杆菌 Ｔ－ＤＮＡ 上ｉａａＨ 基因的引物
ｉａａＨ－Ｆ２／ｉａａＨ－Ｒ１及扩增含精氨酸葡萄土壤杆菌
Ｔ－ＤＮＡ上ｉａａＭ 基因的引物Ｓ４ｉａａＭ５／Ｓ４ｉａａＭ３进
行ＰＣＲ扩增，其中有６个菌株扩增获得４２０ｂｐ的
片段（图１，Ａ），表明其冠瘿碱类型为章鱼碱或胭脂
碱型而非精氨酸类型，菌株编号分别为ＬＭ２，Ｌ７，
Ｇ１０，ＬＪ２，Ｌ３和ＬＨ。再以扩增章鱼碱型葡萄土壤
杆菌Ｔｉ质粒６ｂ基因引物ＴＦ／ＴＲ进行ＰＣＲ扩增，
均检测到５２０ｂｐ的片段（图１，Ｂ），而采用扩增胭脂
碱型葡萄土壤杆菌Ｔｉ质粒６ｂ基因的引物 ＮＦ／ＮＲ
８０　 河 北 农 业 大 学 学 报　　　　 第３６卷　 　
进行扩增时所有菌株均未出现特异性条带，说明这
６个菌株均属章鱼碱型葡萄土壤杆菌类型。
　Ｍ：ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１：阳性对照；２：阴性对照；３：菌株ＬＭ２；４：菌株
Ｌ７；５：菌株Ｇ１０；６：菌株ＬＪ２；７：菌株Ｌ３；８：菌株ＬＨ。
图１　利用ＰＣＲ分析鉴定葡萄根癌病病原菌类型
Ｆｉｇ．１　ＰＣＲ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｔｏ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｂｉｏｔｙｐｅ　ｏｆ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｓｔｒａｉｎｓ　ｃａｕｓｉｎｇ　ｃｒｏｗｎ　ｇａｌ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｉｎ　ｇｒａｐｅｖｉｎｅｓ
２．２　致病菌的毒性分析
将分离得到的６个菌株活性菌液分别接种到向
日葵幼苗茎基部，１０ｄ后接种Ｌ３菌株的幼苗最先
出现小瘤体，２０ｄ时所有菌株均表现不同程度的致
病性，其中接种Ｌ３，ＬＭ２，Ｇ１０和ＬＪ２菌株的苗全部
发病，接种Ｌ７，ＬＨ 菌株的幼苗发病率分别为６０％
和７０％（表２），以接种Ｌ３菌株的幼苗瘤体最大（图
２），表明Ｌ３菌株致病性最强。
图２　接种葡萄土壤杆菌菌株向日葵幼苗肿瘤症状表现
Ｆｉｇ．２　Ａｐｐｅａｒａｎｃｅ　ｏｆ　ｃｒｏｗｎ　ｇａｌ　ｉｎ　ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ　ｓｅｅｄｌｉｎｇ　ａｆｔｅｒ
ｉｎｏｃｕｌａｔｉｎｇ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｖｉｔｉｓ　ｓｔｒａｉｎｓ
表２　不同葡萄土壤杆菌菌株对向日葵幼苗的致病性分析
Ｔａｂｌｅ　２　Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　ｔｅｓｔ　ｏｆ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｖｉｔｉｓ
ｓｔｒａｉｎｓ　ｉｎ　ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ
菌株
Ｓｔｒａｉｎ
接种株数／株
Ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ
ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ
ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ
初始发病时间／ｄ
Ｔｉｍｅ　ｏｆ　ｉｎｉｔｉａｌ
ｇａｌ　ａｐｐｅａｒｅｄ
发病株数／株
Ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ
ｄｉｓｅａｓｅｄ
ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ
发病率／％
Ｄｉｓｅａｓｅ
ｒａｔｅ
ＬＭ２　 １０　 １２　 １０　 １００
Ｌ７　 １０　 １７　 ６　 ６０
Ｇ１０　 １０　 １５　 １０　 １００
ＬＪ２　 １０　 １２　 １０　 １００
Ｌ３　 １０　 １０　 １０　 １００
ＬＨ　 １０　 １２　 ７　 ７０
２．３　杀菌剂和抗菌素对葡萄土壤杆菌的抑制作用
利用抑菌圈法分析了９种杀菌剂和抗菌素对菌
株Ｌ３的抑菌效果。结果表明，７２％农用硫酸链霉
素、三氯异氰尿酸和８０％乙蒜素对该菌株均有不同
程度的抑菌作用。其中７２％农用硫酸链霉素稀释
倍数在２００～１　６００倍范围内均具有极强的抑制作
用，抑菌圈直径为３８．８４～２１．７６ｍｍ。三氯异氰尿
酸稀释倍数为２００～４００倍时，对Ｌ３菌株有较强的
抑制作用，抑菌圈直径为１７．３７～１２．８７ｍｍ；稀释
倍数为８００～１　２００倍时抑制作用明显减弱，抑菌圈
直径为８．５２～６．７９ｍｍ，稀释倍数高于１　２００倍时
无抑菌作用；８０％乙蒜素稀释倍数为２００～８００倍时
只有轻微的抑菌作用（图３）。
参试的２０％龙克菌、８０％多菌灵、３％中生菌
素、４０％可杀得三千、２％春雷霉素、２５％叶枯唑２００
倍稀释液对Ｌ３菌株均无显著抑制作用。
图３　不同抑菌剂对葡萄土壤杆菌Ｌ３菌株抑菌效果
Ｆｉｇ．３　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄｅｓ　ａｎｄ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　ｏｎ　ｄｉａｍｅｔｅｒ
ｏｆ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｚｏｎｅ　ｏｆ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｖｉｔｉｓ　Ｌ３ｓｔｒａｉｎ
３　讨论与结论
３．１　关于葡萄根癌病病原菌的分离与鉴定
目前国内外报道的引起葡萄根癌病的病原菌有
葡萄土壤杆菌和根癌土壤杆菌，而这些病原菌侵染
葡萄植株形成肿瘤时又会分泌章鱼碱、胭脂碱、精氨
第３期 张　洁等：葡萄根癌病病原菌类型鉴定及几种杀菌剂和抗菌素对其抑菌效果 ８１　　 　
酸３种类型的冠瘿碱。对于病原菌类型的鉴定，虽
然运用选择性培养基可以初步鉴定出病原菌的生物
型，但是对于其冠瘿碱类型的确定，传统的方法是待
瘤体长出后运用高压纸电泳法最终确定，这整个过
程需要花费大量的时间［２］。本试验运用可扩增章鱼
碱型和胭脂碱型土壤杆菌Ｔ－ＤＮＡ上ｉａａＨ 基因的
引物ｉａａＨ－Ｆ２／ｉａａＨ－Ｒ１及扩增含精氨酸葡萄土壤杆
菌Ｔ－ＤＮＡ上ｉａａＭ 基因的引物Ｓ４ｉａａＭ５／Ｓ４ｉａａＭ３从
田间分离得到的菌株中检测到含致瘤基因的菌株，
再以扩增章鱼碱型葡萄土壤杆菌 Ｔｉ质粒６ｂ基因
引物ＴＦ／ＴＲ进行ＰＣＲ扩增，最终确定了分离到的
病原菌菌株类型为章鱼碱型葡萄土壤杆菌，结合指
示植物向日葵回接试验确定了其致病性，从而建立
了利用分子手段进行葡萄根癌病病原菌分离与鉴定
体系，同时引物序列对的综合运用大大缩短了鉴定
的时间，提高了鉴定效率。
３．２　关于杀菌剂和抗菌素的药效评价
在应用杀菌剂和抗菌素防治葡萄根癌病方面，
国内仅见李健强等［３］和游积峰等［１４］有关几种杀菌
剂和抗菌素对葡萄根癌病防治初步效果的报道，本
研究结果表明，硫酸链霉素对葡萄根癌病菌具有较
强的抑菌作用，而葡萄生产中常用的多菌灵无抑菌
效果，这与前人报道一致。硫酸链霉素对病菌较强
的抑制能力可能与其可以与病菌核糖体３０Ｓ亚单
位结合，抑制细菌蛋白质的合成有关。本试验中
８０％乙蒜素２００倍液对葡萄土壤杆菌Ｌ３菌株的抑
菌圈直径显著小于游积峰等［１４］报道的８０％乙蒜素
５００倍液的抑菌圈直径，体现了不同菌株对杀菌剂
耐受性的差异。三氯异氰尿酸是一种极强的氧化剂
和氯化剂，具有高效、广谱、较为安全的消毒作用，对
细菌、病毒、真菌、芽孢等都有杀灭作用，可用于环
境、饮水、畜禽饲槽等的消毒，其对葡萄根癌病菌的抑
菌作用尚未见报道。本研究结果表明，稀释２００～
４００倍的三氯异氰尿酸对致病性较强的葡萄土壤杆
菌Ｌ３菌株有较强的抑制作用，可作为进一步田间
试验的参考。
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（编辑：宗淑萍）