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费菜无性系建立的研究



全 文 :费菜(Sedum aizoon)又称土三七、救心菜、养心
菜、八仙草、吐血草等,属于景天科景天属多年生
草本植物[1]。生长于多石山坡、灌丛间、草甸子或沙
岗上,在我国的辽宁、吉林、黑龙江、河北、山东、甘
肃、湖北、四川、江西、浙江、江苏等地有分布 [2]。全
草含有杨梅树皮素、熊果酚甙等化学成分,根含齐
墩果酸、β-谷甾醇等成分。全草均可入药,具有镇
收稿日期:2010-04-06
基金项目:辽宁省高等教育教学改革研究项目 (3-4);辽宁师范大
学教学改革项目(LSJG:20090108)
作者简介:于 冲(1987-),女,本科,从事植物组织培养研究。
通讯作者:姜长阳,男,教授,E-mail : changyangjiang@126.com
静、安神、解毒和散瘀止血等功效,能治吐血、咯
血、便血、血尿、崩漏、紫斑、外伤出血、跌打损伤、
心悸、失眠、疮疖痈肿、毒虫螫伤等疾病 [3]。因费菜
具有多种药用价值,每年都被大量地采集作为药
用或出售,也有将其从山上挖回来后,栽种到花坛
上或花盆中,进行观赏栽培。多年来的大量采挖,
使费菜的野生资源遭到了严重破坏。在辽宁的南
部地区,现在已经很难采到野生费菜了。为了保护
这种野生资源,对其进行了嫩茎组织培养及无性
系建立的研究。虽然国内已有费菜离体培养的报
道 [4- 5],但迄今未见费菜嫩茎愈伤组织培养及无性
系建立的报道。
文章编号:1003- 8701(2010)04- 0022- 04
费菜无性系建立的研究
于 冲,张 蕾,李妮娜,张冬艳,姜长阳 *
(辽宁师范大学生命科学学院,辽宁 大连 116029)
摘 要:对费菜的嫩茎进行了无性系建立和快速繁殖的研究。结果表明:MS+BA0.5 mg·L-1+2,4-D1.2 mg·L-1是
诱导嫩茎形成愈伤组织的理想培养基;1/2 MS+NH4H2PO450 mg·L-1+AgNO31.0 mg·L-1+BA1.0 mg·L-1+NAA0.1
mg·L-1是愈伤组织分化培养的理想培养基;1/2 MS+NH4H2PO450 mg·L-1+AgNO31.0 mg·L-1+BA1.0 mg·L-1+NAA0.1
mg·L-1+ GA31.0 mg·L-1是费菜不定芽继代分化培养的理想培养基;以 1/2 MS+NAA0.1 mg·L-1 +IAA0.3 mg·L-1
为生根培养基,变温、自然光是费菜试管苗生根培养的理想条件;试管苗扦插成活率为 94.5%,移植成活的试管
苗株型大而整齐、根系发达,当年可正常开花结实。
关键词:费菜;无性系;植株再生
中图分类号:S567.23 文献标识码:A
Studies on Establishment of the Asexual Line of Sedum aizoon
YU Chong, ZHANG Lei, LI Ni- na, ZHANG Dong- yan, JIANG Chang- yang
(College of Life Sciences, Liaoning Normal University, Dalian 116029, China)
Abstract: A asexual line and method of rapid propagation of Sedum aizoon were established for the
young stem. The results showed that the best medium to induce the callus of Sedum aizoon was MS + 0.5
mg·L-1 BA + 1.2 mg·L -1 2,4-D. The best medium to induce differentiation of callus was 1/2 MS + 50
mg·L -1NH4H2PO4 + 1.0 mg·L -1AgNO3 + 1.0 mg·L -1BA + 0.1 mg·L -1NAA. The idea medium for
differentiation and subculture of the adventitious bud was 1/2 MS + 50 mg·L -1NH4H2PO4 + 1.0 mg·L -1
AgNO3 + 1.0 mg·L-1BA + 0.1 mg·L-1NAA + 1.0 mg·L-1GA3. The optimum medium for rooting under the
condition of heterotherm and natural light was 1/2 MS + 0.1 mg·L-1NAA + 0.3 mg·L-1 IAA. The rate of
surviving was 94.5%. The seedling grew great and neatly with flourishing root and blooming and seeding
in the year of transplanting.
Keywords: Sedum aizoon; Clone; Regeneration
吉林农业科学 2010,35(4):22-25,42 Journal of Jilin Agricultural Sciences
DOI:10.16423/j.cnki.1003-8701.2010.04.015
1 材料与方法
1.1 试验材料
2007 年 5 月下旬,将大连旅顺英歌石山坡上
生长旺盛的费菜采挖回实验室备用。
1.2 外植体的灭菌
将具有腋芽的嫩茎切成长 4 cm左右的茎段
后,放到磨口广口瓶中,用自来水流水冲洗 30
min,再用蒸馏水在瓶中洗涤 3 次,移到超净工作
台上,接着用 0.01%安利洗涤液振荡洗涤 4~5
min,然后用 75%酒精灭菌 10 s,立即用无菌水洗
涤 2 次,10%NaClO灭菌 12 min 后,立刻用无菌
水振荡冲洗 6次,即获得无菌材料。
1.3 培养基及培养条件
以 MS 为基本培养基加入 30 g·L-1 蔗糖,以
1/2MS 为基本培养基加入 15 g·L-1 蔗糖,并用 l
mo1·L-1 NaOH 和 HCl 将 pH 值调至 5. 8~6.0,所
有固体培养基都加 5 g·L-1琼脂,培养基在 121℃
下高压灭菌 20 min。培养温度 26℃,光强 2 000
lx,光/暗周期 12 h/12 h。
1.4 试验方法
1.4.1 嫩茎愈伤组织诱导试验
将无菌嫩茎放到培养皿中,用手术刀切成长
0.3 cm左右的无芽嫩茎段,接种到以 MS为基本培
养基,附加不同浓度的细胞分裂素 BA和不同浓度
的生长素 IBA、2,4- D的培养基上,在无光的条件下
进行愈伤组织的诱导培养。愈伤组织的诱导培养试
验重复 3次,每种培养基接种 100个无芽茎段。
1.4.2 愈伤组织分化培养试验
将在 MS+BA0.5 mg·L-1+2,4-D1.2 mg·L-1培
养基中获得的愈伤组织用镊子分散为独立的颗粒
后,接种到以 1/2 MS +NH4H2PO4 50 mg·L -1 +
AgNO31.0 mg·L-1为基本培养基,附加浓度分别为
1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1细胞分裂素 BA 和浓度分别
为 0.1 mg·L-1、0.3 mg·L-1、0.5 mg·L-1、0.7 mg·L-1、0.9
mg·L-1NAA、IAA的培养基上,在光照条件下进行愈
伤组织的分化培养。愈伤组织的分化培养试验重复
3次,每种培养基接种 100个愈伤组织颗粒。
1.4.3 不定芽的继代分化培养试验
将在 1/2 MS+NH4H2PO4 50 mg·L-1+AgNO31.0
mg·L-1+BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1培养基中
获得的高在 0.4cm 以上的不定芽从基部剪下后,
接种到 1/2 MS+NH4H2PO4 50 mg·L-1+AgNO3 1.0
mg·L-1+BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1为基本培
养基,分别附加 0 mg·L-1、0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、
1.5 mg·L-1、2.0 mg·L-1 GA3的培养基上,进行不
定芽的继代分化培养。不定芽的继代分化培养试
验重复 3次,每种培养基接种 100个不定芽。
1.4.4 不同处理方法对试管苗生根培养的影响
将上述继代分化培养生长旺盛的不定芽从基
部剪下后,接种到 1/2 MS+NAA 0.1 mg·L- 1 +IAA0.3
mg·L- 1培养基上,进行不同条件对试管苗的生根
培养影响试验。生根培养试验重复 3次,每种处理
接种 100个材料。
1.4.5 试管苗的扦插与移植试验
将上述继代培养的生根试管苗的培养瓶打开
瓶塞,放到光照强度 4 000~5 000 lx的光照下炼
苗 3 d 后,将试管苗从培养瓶中取出,并剪成长 2
cm左右、至少具有 3 个叶片的茎段后,把茎段下
部的 1个叶片剪掉,接着把茎段的下部切口浸入
60 mg·L- 1的 IAA溶液中处理 4 min,再扦插到上
面铺着一层约 6 cm厚河沙、下面为肥沃的园土、
事先已经浇透水、并打上了深约 1 cm的温室苗床
的小孔中,进行试管苗的扦插试验。扦插后前半个
月要保持温度 18℃以上、湿度 90%以上、没有直
射光的条件,半个月后按照温室正常条件管理。扦
插试验重复 3次,每次扦插 400个茎段。
于 5 月下旬,把在温室中扦插成活的试管苗
移植到旅顺英歌石山坡上。移植试验进行了 3次,
每次移植 200株试管苗。
2 结果
2.1 嫩茎愈伤组织诱导试验
接种后 50 d 统计,表 1 表明,在不加细胞分
裂素 BA和生长素的培养基上,在加入浓度分别
为 0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1BA 培养基上和加入浓
度分别为 0.4 mg·L-1、0.8 mg·L-1、1.2 mg·L-1、1.6
mg·L-1IBA的培养基上,均不能诱导培养的无芽嫩
茎形成愈伤组织。而在加入浓度分别为 0.5 mg·L-1、
1.0 mg·L-1BA与浓度分别为 0.4 mg·L-1、0.8 mg·L-1、
1.2 mg·L-1、1.6 mg·L-12,4-D的培养基上,均能诱
导嫩茎形成愈伤组织。但不同浓度激素的组合,愈伤
组织的诱导效果不同。其中在浓度为 0.5 mg·L-1BA
与浓度为 1.2 mg·L-12,4-D 的培养基上,培养嫩
茎的愈伤组织不仅诱导率达到了 93%,而且长势
好。观察还表明,在浓度为 0.5 mg·L-1BA 与浓度
为 1.2 mg·L-12,4-D 的培养基上培养到 15 d 时,
接种的嫩茎两端切口开始膨大,随后就会生长出
大小不等的愈伤组织块。初期生长的愈伤组织为
半透明的不规则状,后来逐渐变成了质地较为疏松
4期 23于 冲等:费菜无性系建立的研究
表 1 不同浓度激素对愈伤组织诱导的影响
BA(mg·L-1) 2,4- D(mg·L-1) IBA(mg·L-1) 诱导愈伤组织数 愈伤组织诱导率(%) 长势
0 0 0 0 0 -
0.5 0.4 0 41 41 +
0.5 0.8 0 45 45 +
0.5 1.2 0 93 93 ++
0.5 1.6 0 70 70 ++
0.5 0 0.4 0 0 -
0.5 0 0.8 0 0 -
0.5 0 1.2 0 0 -
0.5 0 1.6 0 0 -
1.0 0.4 0 30 30 +
1.0 0.8 0 54 54 +
1.0 1.2 0 63 63 +
1.0 1.6 0 61 61 +
1.0 0 0.4 0 0 -
1.0 0 0.8 0 0 -
1.0 0 1.2 0 0 -
1.0 0 1.6 0 0 -
注:++为长势好;+为长势一般;- 为不生长。
表 2 不同浓度激素对愈伤组织分化的影响
BA(mg·L-1) NAA(mg·L-1) IAA(mg·L-1) 愈伤组织分化数 愈伤组织分化率(%) 分化不定芽长势
0 0 0 0 0 -
1.0 0.1 0 93 93 ++
1.0 0.3 0 52 45 ++
1.0 0.5 0 31 93 +
1.0 0.7 0 20 70 +
1.0 0.9 0 13 13 +
1.0 0 0.1 0 0 -
1.0 0 0.3 0 0 -
1.0 0 0.5 0 0 -
1.0 0 0.7 0 0 -
1.0 0 0.9 0 0 -
2.0 0.1 0 46 46 +
2.0 0.3 0 48 48 +
2.0 0.5 0 24 24 +
2.0 0.7 0 11 11 +
2.0 0.9 0 6 6 +
2.0 0 0.1 0 0 -
2.0 0 0.3 0 0 -
2.0 0 0.5 0 0 -
2.0 0 0.7 0 0 -
2.0 0 0.9 0 0 -
注:++为长势较好;+为长势一般;- 为不生长。
的浅黄色颗粒状。一般认为,这样的愈伤组织是具有
分化能力的。上述结果说明:MS+BA 0.5 mg·L-1+
2,4-D 1.2 mg·L- 1这种培养基是诱导费菜无芽嫩
茎形成愈伤组织的理想培养基。
2.2 嫩茎愈伤组织分化培养试验
接种培养后45 d统计结果见表2。在不加激素的
培养基上愈伤组织不能分化,在加入浓度分别为1.0
mg·L-1、2.0 mg·L-1BA的培养基上和加入浓度分别
为0.1 mg·L-1、0.3 mg·L-1、0.5 mg·L-1、0.7 mg·L-1、
0.9 mg·L-1IAA的培养基上,也不能诱导愈伤组织
分化。在加入浓度分别为1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1BA
与浓度分别为0.1 mg·L-1、0.3 mg·L-1、0.5 mg·L-1、0.7
mg·L-1、0.9 mg·L-1NAA的培养基上,均能诱导愈伤
组织分化。但BA与NAA的浓度配比不同,其分化的
效果也不同。其中在BA的浓度为1.0 mg·L-1与NAA
的浓度为0.1 mg·L-1配合使用的培养基上培养的愈
伤组织分化的效果最好。在这种培养基上进行分化
培养的愈伤组织颗粒不仅分化率达到了93%,而且
分化不定芽长势好。观察还表明,在这一培养基上培
养10d左右愈伤组织颗粒开始分化出绿色的芽点,
伴随着培养时间的延长,分化的不定芽数不断地增
多,分化芽逐渐长大,培养到45 d时,1个培养的愈伤
组织颗粒就会分化出长势较好、高在0.4 cm以上、
由3~8个不定芽组成的丛生不定芽。平均1个愈伤组
织颗粒能分化培养出4.4个不定芽。以上结果证明:
1/2 MS+NH4H2PO4 50 mg·L-1+AgNO3 1.0 mg·L-1+
BA1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1的培养基是费菜嫩
茎愈伤组织分化培养的理想培养基。
24 35卷吉 林 农 业 科 学
表 3 不同处理方法对生根培养的影响
不同条件 生根率(%) 生根试管苗长势
变温(18~28℃)、自然光照培养(室内与 99 非常旺盛、枝叶伸展、叶色浓绿、
外界隔一层玻璃,光照度:3 000~7 400 lx) 茎粗 0.2cm以上、根系发达而多
恒温 25℃、光照培养箱 91 较旺盛、叶色淡绿、茎粗 0.13~
培养(光照度:3 000 lx) 0.18cm、根系生长一般
恒温 25℃暗培养箱培养 44 生长较弱、叶色淡黄、茎粗
0.1cm以下、根系少而细弱
2.3 不定芽的继代分化培养试验
培养到 30 d时观察统计表明,1/2 MS +
NH4H2PO4 50 mg·L-1+AgNO3 1.0 mg·L-1+BA 1.0
mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+ GA3 1.0 mg·L-1这种基
本培养基不定芽分化培养的效果最好。观察统计
表明,在这种培养基上培养30 d,1个培养不定芽
就会分化出长势旺盛、高在2 cm以上的、由4~9个
不定芽组成的丛生不定芽。培养到30d时,将由不
定芽分化培养的丛生不定芽剪成长0.5 cm左右、
具有2个生长点的有芽茎段,接种到相同的培养基
上进行不定芽茎段的连续继代培养。经过3次试验,
每次连续继代3代,每种处理接种100个材料的试验
证明:在连续的继代培养中,平均每继代培养1代的
繁殖系数为13.6个。以上观察统计的结果说明:1/2
MS+NH4H2PO4 50 mg·L-1+AgNO3 1.0 mg·L -1+BA
1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+ GA3 1.0 mg·L-1是费
菜不定芽分化继代培养的理想培养基。
2.4 不同处理方法对试管苗生根培养的影响
3次生根培养重复试验,培养 30 d的统计观察
结果见表 3。由表 3可见,在变温自然光的条件下,
生根效果最好。不仅生根率达到了 99%、根系发达
而多,而且植株生长非常旺盛。把在这种条件下培养
的生根试管苗,剪成长 1~1.5 cm、至少具有 2个叶片
(实际上是具有 2个生长点)的茎段,再接种到相同
的生根培养基上后,接着放到变温、自然光的条件下
进行生根继代培养。经过 30 d的培养,又会培养出
1代生长非常旺盛的生根试管苗。3次生根培养重复
试验在变温、自然光的条件下都进行 5代生根继代
培养。继代培养的生根试管苗不仅生根率达到了
99%,高 5 cm左右,根系发达而多,植株生长非常旺
盛,而且培养的试管苗没有无效苗,平均繁殖系数为
3.8。上述统计观察的结果说明:以 1/2 MS+NAA 0.1
mg·L-1+IAA 0.3 mg·L-1为生根培养基,变温、自然光
是费菜试管苗生根培养的理想条件。
2.5 试管苗的扦插与移植试验
观察表明,扦插 10~14 d 可见试管苗成活并
开始生长。3次扦插的平均成活率为 94.5%。
移植成活率为 99.5%。与同期常规扦插成活
苗相比,移植成活的试管苗具有初期生长较慢、植
株较小,后期生长速度快而旺盛、植株大 20%左
右、株型整齐、根系增加 1倍左右等特点。当年移
植的试管苗可正常开花结实,但开花结实时间较
野生植株晚 20~30 d。
3 讨 论
在本研究中,能通过以下 3 种方法进行快速
繁殖:一是愈伤组织分化法,其繁殖的速度是1个
愈伤组织颗粒经过45 d的培养能分化培养出4.4
个不定芽;二是不定芽继代分化法,其繁殖速度是
1个不定芽经过30 d的培养,能分化出 13.6个不定
芽;三是生根继代培养法,其繁殖速度是30 d为1
个继代培养周期,繁殖系数为3.8。以上3种进行快
速繁殖的方法中,不定芽继代分化法的繁殖速度
最快,但在生产实践中,应该采用生根继代培养法
进行繁殖。这是因为用这种方法繁殖的试管苗不
仅生长旺盛,而且没有无效苗,为保证在温室中的
扦插成活率奠定了基础。同时,茎段扦插到苗床的
方法使试管苗的繁殖速度又增加了1倍左右。
在植物试管苗生产应用研究中,一般认为由
愈伤组织诱导分化途径形成的试管苗,后代容易
发生变异 [6- 7],而在本研究中由嫩茎愈伤组织获得
的试管苗,不仅没有出现变异,而且移植后株型整
齐。这可能与以下原因有关:一是本研究中所采用
的研究条件稳定,不易引起变异;二是费菜本身遗
传性稳定,从而保证了由愈伤组织获得植株的稳
定性。
在试管苗的生根培养中,在变温、自然光的条
件下,不仅生根率高,而且生根试管苗生长旺盛。这
种现象说明:即使是试管苗,在自然环境条件下也
更有利于其生长。而其较强的光照不仅会促进自身
生长素的合成,同时也有利于生长素向根部的极性
传导[8],从而促进了根系和整个植株的生长。
参考文献:
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[M] . 北京:科学出版社,1980:88 .
(下转第 42页)
4期 25于 冲等:费菜无性系建立的研究
(上接第 25页)
[2] 李书心,主编 . 辽宁植物志(上册) [M] . 沈阳:辽宁科学技术
出版社,1988:681 .
[3] 南京中医药大学,编著 . 中药大辞典(下册)[M] . 上海:上海
科学技术出版社,2006:3316- 3317 .
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理学通讯,2004,40(6):715 .
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学出版社,1996:70- 72 .
[7] 龚振辉,申书兴,主编 . 植物组织培养[M] . 北京:化学工业出
版社,2007:149- 150 .
[8] 潘瑞炽,主编 . 植物生理学 [M] . 北京:高等教育出版社,
2008:168- 171 .
1.4 调查时间及方法
施药前未出穗,未调查病情基数,末次施药后
11 d 分别进行发病级数调查,每小区随机取 5 点
调查,每点查 50穗以上,以穗为单位记录分级。
0 级无病;1 级每穗损失 5%以下;3 级每穗损
失 6%~20%;5级每穗损失 21%~50%;7 级每穗
损失 51%~70%;9级每穗损失 71%~100%。
病情指数= Σ(各级病叶数×相对级数值)
调查总页数×9 ×100
防治效果(%)=(空白对照区病情指数-处理区病情指数
空白对照区病情指数
)×100
2 结果与分析
2.1 不同药剂处理对水稻稻瘟病的防治效果
从表 2 中可以看出:75%三环唑可湿性粉剂
对水稻穗瘟病具有较好的防治效果。在水稻穗瘟
发病初期(出穗 5%左右)施用 75%三环唑可湿性
粉剂 250 g/hm2、275 g/hm2、300 g/hm2(有效成分
用量)进行防治,防治效果分别为 62.18%、69.02%
和 79.25%,高剂量处理的防治效果最好,明显高
于其他药剂的处理,且高于对照药剂;对照药剂
75%三环唑可湿性粉剂防效为 72.98%, 在有效
成分用量相同的情况下略高于试验药剂中剂量的
效果。显著性测定采用 DMRT法,试验药剂中剂
量处理与对照药剂处理间无显著差异。
2.2 不同药剂处理对水稻安全性及产量的影响
试验中观察,在水稻出穗期前施药,水稻生长
正常,无药害发生。
从表 3 中可以看出,供试药剂 75%三环唑可
湿性粉剂有效成分用量为 250、275、300 g/hm2,各
小区水稻产量分别为 7 450.0 kg/hm2、7 600.0 kg/
hm2和 7 550.0 kg/hm2,与空白对照相比增产率分别
为 1.36%、3.40%和 2.72%。而对照药剂 75%三环
唑可湿性粉剂 275 g/hm2小区水稻产量为 7 650.0
kg/hm2,与空白对照相比增产率为 4.08%。均高于
空白对照小区的水稻 7 350 .0 kg/hm2的产量。
3 结 论
试验结果表明:75%三环唑可湿性粉剂对水稻
稻瘟病有良好的防效,试验过程观察供试药剂对
水稻未产生药害。根据试验结果,75%三环唑可湿
性粉剂防治水稻穗瘟病效果较高, 推荐使用剂量
250~300 g/hm2(有效成分用量),防治穗瘟在出穗
5%左右施药 2次, 可以取得较好的防治效果。
参考文献:
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水稻叶部病害[S] .北京:中国标准出版社,2000:78- 81 .
[2] 张战泓 . 20%咪酰胺·三环唑防治水稻稻瘟病田间药效试验
[J] . 湖南农业科学,2009(8):74- 75 .
[3] 徐秋菊,韦 彦,颜 群,等 . 0.3%多抗霉素水剂防治水稻稻瘟病田间
药效试验研究[J].安徽农业科学,2008,36(33):14635- 14664 .
表 1 供试药剂试验设计
处理编号 药剂
施药剂量
(制剂量)
施药量
(有效成分量)
1 75%三环唑WP 22 g/666.7 m2 250 g/hm2
2 75%三环唑WP 24 g/666.7 m2 275 g/hm2
3 75%三环唑WP 27 g/666.7 m2 300 g/hm2
4 75%三环唑WP(对照药剂) 24 g/666.7 m2 275 g/hm2
5 空白对照
表 2 75%三环唑可湿性粉剂防治水稻稻瘟病效果
处理
平均
病指
平均防效
(%)
差异显著性
5% 1%
75%三环唑可湿性粉剂 250 g/hm2 5.25 62.18 b B
75%三环唑可湿性粉剂 275 g/hm2 4.29 69.02 b B
75%三环唑可湿性粉剂 300 g/hm2 2.88 79.25 d C
75%三环唑可湿性粉剂 275 g/hm2
(对照药剂)
3.75 72.98 c B
CK 13.89 a A
表 3 75%三环唑可湿性粉剂对水稻产量的影响
处理 kg/20 m2 kg/hm2 增产(%)
75%三环唑可湿性粉剂 250 g/hm2 14.9 7 450.0 1.36
75%三环唑可湿性粉剂 275 g/hm2 15.2 7 600.0 3.40
75%三环唑可湿性粉剂 300 g/hm2 15.1 7 550.0 2.72
75%三环唑可湿性粉剂 275 g/hm2
(对照药剂)
15.3 7 650.0 4.08
CK 14.7 7 350.0 -
42 35卷吉 林 农 业 科 学
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