全 文 ：第 31 卷 第 7 期 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报 Vo l.31 No.7
2011 年 7 月 Journal of Central South University of Forestry & Technology Jul.2011
收稿日期:2011 —02 —10
基金项目:国家自然科学基金项目(30700643 , 30972343);中南林业科技大学研究生科技创新基金资助项目(2008sx09);湖南省研究生
科技创新基金(CX2010B323)
作者简介:明付焕(1983 —),男 ,硕士研究生 ,研究方向为生物化学与分子生物学
通讯作者:张党权(1976 —),男 ,副教授 ,博士 ,研究方向为植物分子生物学与基因工程;E-mai l:zhangdangquan@163.com
绵毛优若藜冷胁迫均一化全长 cDNA文库的构建
明付焕 , 张党权 , 宋志丹 , 谷振军 , 祝全东 , 韩　欣 , 郭林林
(中南林业科技大学 国家林业局栽培与育种重点实验室 , 湖南 长沙　410004)
摘　要:以绵毛优若藜叶片和嫰茎为材料 , 对盆栽的绵毛优若藜小苗进行梯度低温胁迫处理后 , 采用 SMART
(switching mechanism at 5′end o f RNA tr anscript)与 DSN(duplex-specific nuclease)均一化相结合技术构建绵毛优若
藜冷胁迫均一化全长 cDNA 文库。经测定 , 原始文库的库容量为 1.4×106 pfu。 PC R检测结果显示:插入片段的长度
在 0.5～ 3 kb 之间 , 平均大于 1 kb , 表明文库构建效果较好。该文库包含有大量的未知基因 ,有待进一步的发掘和研
究。
关键词:绵毛优若藜;全长 cDNA 文库;均一化;冷胁迫;抗逆基因
中图分类号:Q 785 文献标志码:A 文章编号:1673 —923X(2011)07 —0169 —05
Construction of cold-inducible normalized full-length cDNA
library of Ceratoides lanata
MING Fu-huan , ZHANG Dang-quan , SONG Zhi-dan , GU Zhen-jun , ZHU Quan-dong , HAN Xin , GUO Lin-lin
(The Key Lab of Non-wood Fo rest Pr oducts of Sta te Fore stry Administra tion ,
Central South Univ ersity of Forestr y and Technology , Changsha 410004 , H unan , China)
Abstract:Taking the leaves and young stems as material , a no rmalized full-leng th cDNA libr ary of Ceratoides lanata
was constructed.The seedling s o f potted Ceratoides lanata w ere t reated by gr adient co ld stress , no rmalized full-
length cDNA libr ary w as successfully construc ted by DSN (duplex-specific nulease)-no rmaliza tion combined w ith SM-
ARTTM (sw itching mechanism at 5′end o f RNA tr anscript)technique.The results show that the capacity of the pri-
mary librar y w as 1.4×106 pfu.The PCR re sults show that the inser tion size was between 0.5 kb and 3.0 kb , ave r-
agely about 1.0 kb , suggesting that the cDNA library was well norma lized and had been established successfully.The
analytic result suggested that this cDNA librar y contains larg e new genes , which need fur ther r esear ches and function-
al ana ly sis.
Key words:Ceratoides lanata;full-leng th cDNA libr ary;normalization;cold-stre ss;st ress-resistant g ene s
　　绵毛优若藜 Ceratoides lanata ,又称优若藜 、白
鼠尾草 ,为藜科驼绒藜属植物 ,原产美洲 ,是一种优
良的沙旱生常绿饲用灌木 ,在干旱沙区常作为冬季
牧场的主要牧草[ 1] ,因而得名冬季饲料(w interfat)。
绵毛优若藜由德国植物学家 Frederick Pursh 首先
发现 ,是美洲大陆特有种[ 2] ,在我国无分布[ 2-3] 。在
北美洲 ,从加拿大的育空地区 ,到美国华盛顿州的东
部 ,堪萨斯州的南部 ,一直到新墨西哥州和加利福尼
亚州的南部都有天然生长的绵毛优若藜 ,主要用于
退化草场和植被的改良与恢复 、生态重建[ 2-4] 。在
DOI :10.14067/j.cnki.1673-923x.2011.07.030
　 　中 南 林 业 科 技 大 学 学 报 第 31卷
国内 ,自 2002年甘肃省治沙研究引进绵毛优若藜以
来 ,主要对其进行育苗 、抗盐瘠以及水胁迫下的酶活
性变化等研究[ 1 , 5-7] 。2010 年 , 张党权等[ 8] 成功构
建了绵毛优若藜的 SSH 文库 ,获得了几百个富集了
绵毛优若藜冷诱导表达的相关基因 cDNA 的克隆。
均一化 cDNA 文库也称等量化 cDNA 文库 ,是
某一特定组织或细胞内所有表达基因且含量大致相
等的 cDNA 文库。它克服了基因在转录水平上的
巨大差异 ,有利于文库筛选和分析及研究和分析基
因的表达和序列 ,是一种大量发掘新基因和研究功
能基因组的新方法。储昭晖等[ 9] 以优良杂交水稻的
恢复系明恢 63为材料构建了水稻全生育期均一化
cDNA 文库:该文库含 62 000 个克隆 ,插入片段平
均长度为 1.4 kb;对随机的 10 750个克隆进行了测
序 ,序列比对分析得到 6 399 条非重复的 ES T 序
列 ,非重复序列占 59.5%;文库制作成的 cDNA 芯
片已被用于功能基因组的研究。崔东辉等[ 10] 构建
了玉米杂交种雌穗均一化 cDNA 文库 ,随机抽取
150个克隆进行测序 ,对结果进行功能聚类分析 ,发
现文库序列涉及水解酶 、转移酶 、核苷酸结合蛋白 、
蛋白激酶 、转录因子等基因 ,涉及环境应答 、蛋白代
谢 、物质转运 、个体发育等多个生化途径。王玉荣
等[ 11]构建了亚洲棉 Gossypium arboreum 全生育期
均一化全长 cDNA 文库 ,并对其进行了 EST 分析 ,
结果有 78.31%的为新 EST 。吴东等[ 12] 构建了中
棉所 36均一化全长 cDNA 文库 ,用 PCR方法测得
文库重组率达 100%,插入片段平均长度为 1.2 kb 。
王晓光等[ 13] 以破色期番茄果实为材料 ,构建了均一
化 cDNA 沉默文库 ,并对其进行了功能基因研究 。
目前对法国梧桐[ 14] 、硅藻[ 15] 、小麦[ 16] 、黄豆[ 17] 等也
构建了 cDNA 文库并对其进行了研究 。
绵毛优若藜是一种多年生抗逆性极强的沙生常
绿灌木。绵毛优若藜种子无需冬眠 ,在无盐条件下
种子的萌发率约为 90%。其种子萌发率随盐度增
加而减低 , NaC l浓度为 900 mmol/L 时 ,种子萌发
率大于 10%。绵毛优若藜的适应性极强 ,可在零下
30 ℃、年降雨量为 70 ～ 500 mm 、pH 值为 7.0 ～ 9.0
的环境中生长 ,其耐盐极限值为 27.1 ds/m ,故有抗
旱 、耐高温 、抗寒[ 5] 、耐瘠薄[ 6] 、耐贫瘠 、耐沙埋[ 18] 等
优点。因此 ,绵毛优若藜是一种超抗冻 、抗旱 、耐盐
碱贫瘠沙埋的常绿灌木 ,具有宝贵的抗逆性基因。
基于此 ,拟构建绵毛优若藜冷胁迫均一化全长 cD-
NA 文库 ,有助于林木超冻机理的研究 ,同时还可获
大量新的抗逆相关基因 ,为后期抗冻蛋白基因的克
隆奠定基础。
1　材料与方法
1.1　材　料
实验材料为绵毛优若藜沙生小苗 ,采自甘肃省
治沙研究民勤沙生植物园 ,小苗高度在 20 ～ 40 cm
之间 。
1.2　方　法
1.2.1　总 RNA 的提取
材料预处理:将盆栽绵毛优若藜小苗进行梯度
降温至 4 ℃后恒温处理一周 ,然后迅速降温至零下
15 ℃处理 4 h 。随后采用改良 CTAB 法与 OME-
GA 的 Plant RNA Kit试剂盒相结合方法提取绵毛
优若藜叶子总 RNA ,用琼脂糖凝胶(1.0%)电泳检
测 、紫外分光光度法测定总 RNA的浓度和纯度。
1.2.2　全长 cDNA 的合成
采用 CLON TECH 公司的 Creator SMART
cDNA Construction Ki t合成一二链 。首取 2 μL
产物于 1.1%琼脂糖凝胶电泳检测其 cDN A合成
结果 。
1.2.3　全长 cDNA 的均一化
利用 QIA quick PCR Purification Ki t对合成的
cDNA 进行纯化 。采用 Trimme r-Directo r ki t 对
cDNA进行 DSN 均一化处理 。在 0.2 mL 无菌离
心管中加入 3μL cDNA 、1 μL杂交缓冲液和 2滴矿
物油 , 室温 , 13 000 r/min 离心 2 min 。接着 98 ℃
变性 2 min , 68 ℃杂交 5 h 后 ,加入 68 ℃下预热好
的 DSN master buffer 5 μL , 68 ℃保温 10 min ,然
后加入经梯度稀释的 DSN 处理液 , 68 ℃保温
25 min ,加入 10μL stop solution终止反应 。
1.2.4　均一化后 cDNA 的 2次扩增
以 1 μL DSN 处理稀释后的 cDNA 为模板 ,依
次加入 ddH2O 40.5 μL 、 5 μL 10×A dvantage 2
PCR buf fe r、 1 μL 50×dNT P mix 、 1.5 μL Evro-
gen PCR primer M 1 、 1μL 50×Advantage 2 Poly-
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第 7 期 　明付焕 ,等:绵毛优若藜冷胁迫均一化全长 cDNA 文库的构建　
merase Mix , 总体积为 50 μL 。程序为:95 ℃
1 min , 95 ℃ 15 s , 66 ℃ 20 s , 72 ℃ 3 min , 7 个循
环 ,进行第一次 PRC后 ,取 5μL 于 1%琼脂糖凝胶
电泳检测 。同时以对照依次增加 2个循环来确定其
最佳循环数 。取最佳均一化扩增产物 2 μL 加入上
述组分进行11个循环的第二次扩增 。取 5 μL 进行
琼脂糖凝胶电泳检测 。
1.2.5　均一化全长 cDNA 文库的构建
使用 QIAquick PCR Puri ficat ion Kit将均一化
后的 cDNA 的 PCR产物纯化 ,对纯化后的 cDNA
进行 SfiⅠ酶切 ,将 0.75 ～ 3 kb酶切产物回收 ,并与
pDN R-LIB 载体连接 , 通过电击转化至大肠杆菌
DH10B中 。菌液涂于氯霉素平板上 , 37 ℃过夜
培养 。
1.2.6　菌落的鉴定
菌液涂于氯霉素平板上 ,计算平板上的库容数 ,
并随机挑取 30个克隆进行菌落 PCR 鉴定 ,电泳检
测插入片段的大小及小片段率 。
2　结果与分析
2.1　总 RNA的提取
以冷胁迫的绵毛优若藜小苗为材料 ,提取总
RNA ,经电泳检测(见图 1),18 S 和 28 S 特征条带
清晰 ,亮度比接近 1∶2。用紫外分光光度计测定
OD 值(见表 1), OD 260/OD280比值在 1.8 ～ 2.0 之
间 ,符合比值范围 ,可用于后续实验 。
图 1　总 RNA电泳检测结果
Fig.1　Gel analysis of total RNA
表 1　紫外分光光度计测定浓度及 OD 值
Table 1　The concentration and OD values by UV-spectro-
photometer
项目 浓度/(μg·μL -1) OD260/280 OD 260/230
绵毛优若藜 RNA 1.40 2.10 2.50
2.2　全长 cDNA的合成
经反转录得到的 cDNA 通过 LD-PCR扩增后 ,
电泳显示 dscDNA 条带在 0.25 ～ 5 kb 之间(见图
2),条带有明暗之分 ,表明大小不同 、丰度不同的
mRNA均得到了有效反转录及扩增。
图 2　均一化前后 cDNA琼脂糖凝胶电泳图谱
Fig.2　Agarose gel electrophoresis of non-normalized and
normalized amplified SMART-prepared cDNA
2.3　均一化效果检测
由图 2可知 , dscDNA 经过梯度 DSN 处理以及
2次 PCR扩增后 ,电泳条带呈一条均匀的弥散条
带 ,均一化前的亮带消失 ,且大小范围无明显变化 ,
说明高丰度基因的含量明显下降 ,均一化效果很好。
2.4　文库库容及插入片段大小的分析
菌液涂于氯霉素平板上 ,经计算 ,得到库容数为
1.4×106 cfu ,重组率为 100%。经 PCR鉴定 ,插入
片段大小在 1 ～ 3 kb之间(见图 3),平均大于 1 kb ,
表明文库质量很好 ,可进行后续的基因筛选和功能
基因鉴定 。
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　 　中 南 林 业 科 技 大 学 学 报 第 31卷
图 3　cDNA文库插入片段大小检测
Fig.3　Average size of inserts of full-length cDNA library
3　讨　论
cDNA 文库是大规模获取基因序列信息并进行
功能基因组研究的一种高效方法 ,而均一化 cDNA
文库克服了普通文库的一个缺点 ,从而使得基因在
转录水平上表达量处在相当水平上 ,这样有利于发
掘低表达的特殊基因 。目前 ,构建均一化 cDN A 文
库方法有 3种:(1)寡核苷酸列指纹(Oligonucleo ti-
de sequence signature ,OSS)技术:利用数据处理软
件和寡核苷酸探针对直接 cDNA 文库进行处理 ,以
实现均一化[ 19-21] 。该类方法最大特点是工作量大 ,
设备和试剂比较昂贵 ,自动化程度高。(2)基因组饱
和杂交法:根据基因组 DNA 在拷贝数上具有相对
一致的特点 ,用 cDNA 与基因组 DNA 进行饱和杂
交 ,使捕获的 cDN A丰度与基因组 DNA 丰度一致 ,
从而达到降低高丰度 cDNA 的目的 。(3)DSN(du-
plex specificenzyme)法[ 22] :DSN 酶能在特定条件
下特异性地降解双链DNA和 DNA-RNA 杂交体中
的 DNA 。因而通过控制 DNA 变性和复性(杂交)
条件 ,用 DSN 酶处理双链 cDNA ,使得高低丰度的
基因趋于一致 ,电泳时呈现出一条均匀的弥散条带 。
RNA 的质量是影响 cDNA 文库的最主要因素
之一 。本实验采取改良的 CTAB 法与试剂盒相结
合法成功提取了绵毛优若藜叶总 RNA , OD260/OD280
比值在 1.8 ～ 2.0之间 ,构建的文库均一化效果很
好 ,插入片段的平均长度大于 1 kb ,表明建库成功 ,
为后续的抗性基因筛选以及功能基因的研究提供了
良好基础 。
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[本文编校:谢荣秀]
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