全 文 ：文章编号:1001-4829(2007)06-1304-03
　　收稿日期:2007-06-26
　　作者简介:喻　晓(1982-)男 ,四川农业大学在读研究生 ,从事
花卉研究方 , E-mail:valen110@sina.com, ＊为通讯作者。
大百合 RAPD体系的建立与优化
喻　晓1 , 文　涛 1＊ ,曾　杨 2
(1.四川农业大学农学院 ,四川雅安　 625014, 2.四川农业大学林学园艺学院 ,四川雅安　 625014)
摘　要:以大百合 DNA为模板 ,采用正交试验设计 ,对影响大百合 RAPD-PCR扩增的重要参数进行了优化试验 ,以期建立大百合
RAPD反应的优化体系。结果表明最优大百合 RAPD-PCR的反应体系(20 μl):Mg2+(2.0mmol/L)1.0 μl、dNTPs(0.2mmol/L)
1.0μl、primer(0.6umol/L)1.3μl、DNA(30ng/μl)1.0μl、Taq酶 1U、10×bufer2μl;扩增程序为:在 94℃下预变性 5min,然后进
行 35个循环(94℃变性 30s、37℃退火 50s、72℃延伸 1min),最后在 72℃延伸 10min,在电压为 50V下电泳 1h。
关键词:大百合;RAPD;遗传多样性;mili-Q
中图分类号:S664.3　　　文献标识码:A
EstablishmentandoptimizationofCardiocrinumgiganteum sRAPDsystem
YUXiao1 , WENTao1＊ , ZENGYang2
(1.AgriculturalInstituteofSichuanAgriculturalUniversity, SichuanYaan625014, China;2.ForestScienceandGardeningofSichuanAgri-
culturalUniversity, SichuanYaan625014, China)
Abstract:TousetheDNAofCardiocrinumgiganteumasatemplatetodotheoptimizationtestontheimportantparametersoftheRAPD-PCR
amplificationforCardiocrinumgiganteumtheCardiocrinumgiganteum sRAPDoptimizationsystem, andtheuseoforthogonaldesignmeth-
od, theCardiocrinumgiganteum sRAPD-PCRconditionswereoptimized.TheresultsshowedthatthebestRAPD-PCRreactionsystem(20
μl)mustfolowthoseconditionsasbelows:Mg2+(2.0mmol/L)1.0μl, dNTPs(0.2mmol/L)1.0μl, primer(0.6 μmol/l)1.3μl, DNA
(30ng/μl)1.0μl, Taqenzyme1U, 10 ×bufer2μl.PCRprocedurewasdiscribedasbalow:tobepredegeneratedat94℃for5min, then
befolowedby35cycles(denaturationat94℃ for30s, annealingat37℃ for50s, extensionat72℃for1min), finalytobeextendedat
72°Cfor10minandelectro-phoresisonehourin50V.
Keywords:Cardiocrinumgiganteum;RAPD;geneticdiversity;mili-Q
　　 大百合 (Cardiocrinumgiganteum),又名水百
合 ,属于百合科大百合属(Cardiocrinum),其植株巨
大特别耐寒 ,显著区别于百合属植物而得名[ 1] ,大
百合因其植株硕大壮观 ,花朵美丽芳香而成为极具
观赏价值的野生花卉;同时也有很高的药用价值 ,具
有补中益气 、清心安神 、润肺止咳等作用 [ 2] 。
大百合属植物全球仅有 3种 ,我国产 2种 ,分别
是大百合和荞叶大百合(C.cathayanum)[ 3] 。但许
多研究者研究发现[ 4 ～ 5] ,大百合染色体结构不仅因
产地的不同有所差异 ,而且在相近分布区的两处材
料也明显不同 ,表明大百合很有可能存在变种 。因
此有必要对其进行遗传多样性研究 ,这对保护大百
合野生资源极具价值 ,对大百合的育种研究具有指
导意义。
RAPD是一种运用随机引物扩增 DNA片段 ,寻
找其多态片段的一种分子标记新技术 ,具有对 DNA
需要量极少 、操作简单易行 、不需要接触放射性物
质 、灵敏度高等优点 。目前已成功应用于遗传多样
性检测 、遗传图谱 、品种鉴定等多个领域 [ 6] 。但是
RAPD的 PCR易受到实验条件的影响 ,结果的重复
性不高 , 因此建立精确的 RAPD反应体系对保证
RAPD实验的准确可靠是非常必要的 ,本试验对大
百合 RAPD标记的 PCR条件进行正交试验设计比
较 ,优化了 RAPD标记的 PCR体系 ,使其能为大百
合基因定位和辅助育种奠定基础 。
1304
西　南　农　业　学　报
SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences　　　　　　　　　　　　　　
2007年 20卷 6期
Vol.20　　No.6
DOI :10.16213/j.cnki.scjas.2007.06.039
表 1　RAPD-PCR体系的因素水平
Table1　Factors-levelsofRAPD-PCRsystem
水平
Level
因素 Factors
Mg2+
(2.0mmol/L)
dNTPs
(0.2mmol/L)
Primer
(0.6μmol/L)
DNA
(30 ng/ μl)
1 1.0 1.0 0.7 0.5
2 1.5 1.5 1.0 1.0
3 2.0 2.0 1.3 1.5
1　材料与方法
1.1　材料
材料取自于四川农业大学农场 3#大棚和药用
植物园引种 1 ～ 2年的大百合 ,取植株始花期顶部的
幼嫩叶片 ,用封口袋装于冰盒带回实验室 -20 ℃保
存 。
1.2　方法
1.2.1　大百合 DNA提取及纯度检测　应用改良的
CTAB法提取大百合幼嫩叶片的总 DNA[ 7] 。利用核
酸蛋白仪测定 DNA纯度 ,在 260 nm/280 nm≥1.8,
260nm/230nm≥2.0时 ,作为 PCR反应的 DNA模
板 。
1.2.2　RAPD条件优化设计　RAPD反应体系各因
子梯度:以提取的大百合 DNA为模板 ,用筛选的引
物 SBS-B14进行扩增 ,在美国 Bio-RAD公司生产的
PCR仪上进行 PCR扩增 。对反应体系有影响的
Mg2 +, dNTPs, Primer,模板 DNA,采用 L9(34)正交设
计法进行实验筛选 ,方案见表 1、表 2。通过前期研
究本实验不再对 Taq酶进行优化 ,取 1U, 10×bufer
取 2 μl,反应体系为 20 μl,不足体积用 mili-Q水补
充 [ 7 ～ 9] 。
　　RAPD-PCR扩增退火温度筛选:退火温度对扩
增的影响较大 ,本实验设定退火温度梯度 27、37、
47、57 ℃,方案见表 3。其中变性 、退火 、延伸进行
表 2　RAPD-PCR正交试验设计表 L9(34)
Table2　OrthogonaldesigntoRAPD-PCRsystemL9(34)
编号 Mg2+ dNTPs Primer DNA
1 1.0 1.0 1.3 1.0
2 1.0 1.5 0.7 1.5
3 1.0 2.0 1.0 0.5
4 1.5 1.0 1.3 1.0
5 1.5 1.5 0.7 1.5
6 1.5 2.0 1.0 0.5
7 2.0 1.0 1.3 1.0
8 2.0 1.5 0.7 1.5
9 2.0 2.0 1.0 0.5
表 3　PCR循环参数设定
Table3　PCR-cycleparametersetting
反应步骤 温 度(℃) 时 间
预变性 94 5min
变性 94 50s
退火 27、 37、 47、57 30s
延伸 ＊ 72 1min
延伸 72 5min
35个循环。 (引物 SBS-D2、SBS-D8)。
　　电泳条件筛选:在 1.0%的琼脂糖凝胶中电泳 ,
设定电压梯度 30、50、80、100 V。溴酚蓝指示剂离
起点大约 5 cm时停止电泳。
2　结果与分析
2.1　PCR体系各因子梯度筛选
根据本实验正交设计进行的 PCR扩增和电泳 ,
结果如图 1所示 , 1、2、3、4、5、7泳道可以清楚的看
见扩增条带 ,其中 1、3、4泳道条带明显。 Mg2+设定
3个梯度 ,从 1、4、7泳道可看出 Mg2+取 1.0、1.5 μl
条带明显 , 2.0 μl条带明显变淡 ,表明 Mg2 +过量 ,再
从 3、6泳道可知道 Mg2+的最适量应为 1.0μl。第 2
泳道条带不明显 ,而 1、3泳道比较 ,发现 1泳道条带
较亮且较粗 , 3泳道较细且稍有拖尾现象 。从而可
知 ,大百合最优 PCR反应体系中 Mg2 +(2.0 mmol/
L)1.0 μl、dNTPs(0.2 mmol/L)1.0 μl、primer(0.6
μmol/l)1.3 μl、DNA(30 ng/μl)1.0 μl、Taq酶取
1U, 10×bufer取 2 μl。
2.2　PCR退火温度筛选
从图 2可以看出 , 1、2、3、4泳道为 SBS-D2对应
温度下跑出的条带 ,其中 1、2泳道出现了明显的条
带 ,表明退火温度在 27 ～ 37 ℃左右时 ,扩增能够很
好的进行 , 3、4泳道未有明显的条带出现 ,表明此时
的退火温度不能正常的扩增;5、 6、 7、8泳道为作
SBS-D8对应温度下跑出的条带 , 6泳道能清楚的出
现条带 ,此时的退火温度为 37 ℃, 5、7、8泳道未有
图 1　RAPD-PCR体系筛选(引物 SBS-B14)
Fig.1　RAPD-PCRsystemscreening(primerSBS-B14)
13056期 　　　　　　喻　晓等:大百合 RAPD体系的建立与优化
图 2　RAPD-PCR体系退火温度筛选
Fig.2　RAPD-PCRsystemannealingtemperaturescreening
图 3　电压 50V扩增条带
Fig.3　Thestripesofamplificationin50V
条带出现。通过不同引物的两次筛选 ,发现退火温
度在 37 ℃左右时 ,电泳的条带较为清晰。
2.3　电泳条件筛选
从图 3、图 4中可以看出 ,在电压为 30、50 V的
时候 ,条带明亮未弯曲 ,且没有拖尾现象;在电压为
80、100 V时 ,条带出现弯曲 ,且中间断裂 ,可能是由
于电压太大造成 。综合比较 ,电泳电压为 50 V左右
时条带清晰且用时较短 ,确定此电压为最适电压。
3　讨　论
　　RAPD引物是 10个碱基或更短的寡核苷酸片
段 ,在退火温度下引物与模板的互补结合不很稳定 ,
这种随机扩增容易受到诸多因素的影响:Mg2+的浓
度 、引物与 dNTPs用量 、缓冲系统的种类与 pH、模板
浓度与纯度 、扩增程序与循环周期等。不同厂家生
产的不同型号的 PCR仪具有不同的变温速率 ,这个
参数决定扩增片段的大小范围。因此 ,不同实验室
往往由于使用的 PCR仪型号不同 , RAPD数据也不
可比较 。所以 RAPD标记的稳定性一直是人们关注
的问题 [ 10] 。但实践证明 ,同一实验室如果采用相同
图 4　电压 80 V扩增条带
Fig.4　Thestripesofamplificationin80V
的 RAPD流程(反应程序与反应成分),在同一型号
的 PCR仪上运行有很好的重复性 ,将各种条件优化
以后固定下来 ,实现 RAPD分析的标准化势在必行。
　　本实验在严格的实验条件下 ,对大百合 RAPD-
PCR中 Mg2+、dNTPs、primer、DNA的浓度进行了优
化 ,结果表明较为理想的各因子用量和扩增程序为:
Mg2+(2.0 mmol/L)1.0 μl、dNTPs(0.2mmol/L)1.0
μl、primer(0.6μmol/L)1.3 μl、DNA(30ng/μl)1.0
μl、Taq酶取 1U、10×bufer取 2 μl,总反应体系为
20μl;扩增程序为:在 94 ℃下预变性 ,然后进行 35
个循环(94℃变性 30s、37℃退火 50 s、72℃延伸 1
min),最后在 72℃延伸 10 min下。电泳电压为 50
V,时间为 1 h。
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(责任编辑　陈　虹)
1306 西　南　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　20卷