全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (12): 2223~2230　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0274 2223
收稿 2015-05-15　　修定 2015-10-09
资助 国家自然科学基金(31160401)。
* 通讯作者(E-mail: diqiuliu@126.com; Tel: 0871-65920621)。
超表达岷江百合 类萌发素蛋白基因LrGLP2增强烟草对几种病原真菌的
抗性
韩青, 杨野, 陈瑞, 葛锋, 陈朝银, 刘迪秋*
昆明理工大学生命科学与技术学院, 昆明650500
摘要: 类萌发素蛋白(germin-like proteins, GLPs)是普遍存在于植物体内的具有多种功能的糖蛋白, 属于cupins蛋白家族。 岷
江百合类萌发素蛋白基因LrGLP2响应病原真菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的入侵。为了验证该基因的功能, 本文构
建了LrGLP2的植物超表达载体并转入烟草中, PCR筛选获得了35棵阳性转基因烟草。Southern杂交和qRT-PCR分析显示,
LrGLP2基因已成功整合到转基因烟草基因组中并稳定表达。体外抑菌实验表明LrGLP2转基因烟草叶片粗蛋白能够不同
程度地抑制葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)、尖孢镰刀菌和灰葡萄孢(Botrytis cinerea)菌丝的生长。活体接种结果显
示, 转基因烟草具有很强的抗尖孢镰刀菌和灰葡萄孢侵染的能力。此外, 尖孢镰刀菌侵染前后, 与野生型烟草相比, T2代转
基因烟草中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽硫转移酶和草酸氧化酶酶活性均显著增强。本文的研究结果表明岷江百合类萌发
素蛋白基因LrGLP2是一个抗真菌功能基因, 在烟草中超表达增强了T2代转基因烟草对几种病原真菌的抗性。
关键词: 岷江百合; 类萌发素蛋白; 尖孢镰刀菌; 病原真菌抗性
Overexpression of Germin-Like Protein Gene from Lilium regale Enhance
Resistance to Several Pathogenic Fungi in Transgenic Tobacco Plants
HAN Qing, YANG Ye, CHEN Rui, GE Feng, CHEN Chao-Yin, LIU Di-Qiu*
Faculty of Life Science and Technology, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China
Abstract: Germin-like proteins (GLPs) are ubiquitous plant glycoproteins and belong to the cupin super family.
The GLPs possess diverse functional roles in plants. Previously, a GLP gene from Lilium regale Wilson, Lr-
GLP2, responded to the infection of Fusarium oxysporum f. sp. lilii. In order to verify the function of LrGLP2,
the constitutive plant expression vector of LrGLP2 was constructed and transferred into tobacco (Nicotiana ta-
bacum L. cv Xanthi). Totally, there were 35 positive transgenic tobacco screened out through the polymerase
chain reaction (PCR) analysis. The LrGLP2 gene was successfully integrated into the genome of the transgenic
tobacco lines and expressed as expected in the transformants through Southern blotting and quantitative reverse
transcription-PCR (qRT-PCR) analysis. The antifungal activity of LrGLP2 was detected in vitro plates, and the
crude protein extract of transgenic tobacco lines inhibited the hyphal growth of the B. dothidea, F. oxysporum,
and B. cinerea, respectively. Furthermore, in vivo inoculation assay indicated that the transgenic tobacco lines
showed strong resistance to the infection of F. oxysporum and B. cinerea stress, respectively. Simultaneously,
the SOD, GST and OXO showed signifi cantly higher activities in the T2 transgenic lines than in wild type under
normal conditions or after inoculation with F. oxysporum. In conclusion, overexpression of LrGLP2 from L. re-
gale enhanced resistance to several pathogenic fungi in the T2 transgenic tobacco plants.
Key words: Lilium regale; germin-like protein; Fusarium oxysporum; resistance to fungal pathogen
植物类萌发素蛋白(germin-like proteins, GLPs)
是在植物中普遍存在的一类与小麦(Triticum aes-
tivum)萌发素(germin)序列高度相似的蛋白家族,
它们以糖蛋白的形式通过离子键结合存在于细胞
外基质中, 绝大多数GLPs为稳定的低聚物(Druka
等2002)。GLPs含有β-桶状结构, 与萌发素同属于
cupin蛋白家族。Cupin家族主要包括环化酶、异
构酶、双加氧酶、脱羧酶、糖或生长素结合蛋
白、单体或者二聚体球蛋白以及种子贮藏蛋白
(Druka等2002)。GLPs在植物生长发育过程中发挥
植物生理学报2224
重要的生物学功能, 同时也参与植物对生物及非
生物胁迫的防卫反应。
一些GLPs具有酶学活性, 如草酸盐氧化酶
(oxalate oxidase, OXO) (Lane等1993)、超氧化物歧
化酶(superoxide dismutase, SOD) (Christensen等
2004)。OXO催化草酸盐产生H2O2, SOD催化活性
氧(reactive oxygen species, ROS)产生H2O2。植物
受到病原菌感染后, GLPs催化产生的H2O2可在细
胞壁修复时的部分交联中起作用, 延缓并阻止病
原菌的侵入与扩散(Christensen等2004)。同时,
H2O2作为植物体内的一种信号分子, 能够诱导防
御基因表达, 进而提高植物的抗病性(Dunwell等
2008)。在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中超表达甜
菜(Beta vulgaris) BvGLP-1, 转基因植株不仅产生
的H2O2增加, 而且明显增强了对Ver t icillium longis-
porum和Rhizoctonia solani两种病原真菌的抗性
(Knecht等2010)。通过RNA干涉使水稻(Oryza sati-
va)类萌发素蛋白基因OsGLP1沉默, OsGLP1功能
缺失植株的高度只有大约正常植株的一半, 谷粒
也不饱满, 同时转基因植株对真菌病害的敏感度
增加, 如纹枯病和稻瘟病(Banerjee和Maiti 2010)。
岷江百合(Lilium regale)又名王百合, 多年生
草本植物, 是中国特有的野生百合, 仅分布于四川
西部岷江流域海拔800~2 700 m的河谷到山腰的岩
石缝中, 具有极强的抗病性(Lim等2003)。在前期
研究中, 对岷江百合中一个GLP基因LrGLP2的全
长cDNA进行了克隆和表达特性分析, qRT-PCR分
析结果显示, 岷江百合接种尖孢镰刀菌2 h后, Lr-
GLP2的表达迅速上调, 12 h表达量急剧上升, 至24
h表达量达到最大值, 可见LrGLP2参与岷江百合对
尖孢镰刀菌的防卫反应(刘亚龙等2013)。本研究
构建LrGLP2的超表达载体, 转入烟草中过表达, 通
过对转基因烟草进行体内体外抑菌实验及几种抗
病相关酶活的检测以探讨LrGLP2参与植物抗病反
应的生物学功能, 为深入认识岷江百合抗尖孢镰
刀菌的分子机制奠定基础。
材料与方法
1 材料
植物材料为本实验室通过组织培养获得的烟
草(Nicotiana tabacum L. c v Xanthi)无 菌苗。将烟
草种子用75%乙醇浸泡30 s, 无菌水洗涤后用0.1%
HgCl2浸泡8~10 min, 然后再用无菌水洗涤若干次,
播种于1/2 MS培养基上, 28 ℃暗培养5~8 d, 待种
子发芽后转至光照培养箱(25 ℃, 16 h·d-1光照), 以
后每月继代一次。
所用LBA440 4根癌农杆菌(Agrobacterium tu-
mefaciens)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、
葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)和灰葡萄孢
(Botrytis cinerea)由本实验室保存。
2 方法
2.1 LrGLP2超表达载体构建
本研究采用的植物超表达载体是pCAM-
BIA2300S, 其T-DNA区含有2个花椰菜花叶病毒
(CaMV) 35S启动子 , 具有卡 那霉素抗性基因
NPTII。在扩增LrGLP2 ORF的特异引物上游分别
添加限制性内切酶BamHI和EcoRI的识别位点(正
向引物5′ GGATCCGCAGTGGTATCAACGCA-
GAGTACA 3′和反向引物5′ GAATTCATCCAT-
CAGAACTTAGCCTGGAGC 3′), 扩增产物最初连
接至pMD-18T载体(Takara, 日本)中。用BamHI和
EcoRI双酶切pMD-18T-LrGLP2载体得到LrGLP2
的全长ORF, 用同样的限制性内切酶消化pCAM-
BIA2300S空载体后, 对LrGLP2的ORF以及pCAM-
BIA2300S空载体进行连接。并将连接产物转化到
大肠杆菌DH5α菌株中, 通过PCR筛选得到重组质
粒pCAMBIA2300s-LrGLP2 (图1)。
2.2 阳性转基因烟草筛选
采用CTAB法提取转基因烟草植株叶片的基
因组DNA, 取1 μL提取的基因组DNA进行琼脂糖
凝胶电泳检测其完整性和浓度。以转基因植株的
基因组DNA为模板用扩增LrGLP2的特异引物进
图1 岷江百合LrGLP2的表达框示意图
Fig.1 Expression cassette of LrGLP2 from L. regale
韩青等: 超表达岷江百合 类萌发素蛋白基因LrGLP2增强烟草对几种病原真菌的抗性 2225
行PCR反应。PCR结束后, 取8 μL产物进行琼脂糖
凝胶电泳以检测阳性转基因植株。
2.3 Southern杂交
为明确LrGLP2基因在烟草基因组中的拷贝
数, 我们随机挑选了5个T0代阳性转基因烟草株系
及野生型烟草进行Southern杂交分析。取10 μg
DNA样品, 用EcoRI进行酶切反应16 h。酶切结束
后, 将酶切产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳分离
并转移至尼龙膜(Hybond N+, Amersham, 英国)。
以pCAMBIA2300s T-DNA的新霉素磷酸转移酶基
因(NPTII)片段(460 bp)作为特异性探针并用同位
素32P (Prime-a-Gene Labeling System Kit, Promega)
标记。杂交及放射自显影方法参照Liu等(2006)反
向Northern杂交的方法。
2.4 qRT-PCR
采用异硫氰酸胍法提取正常生长的5个Lr-
GLP2转基因烟草株系的总RNA, 逆转录合成第一
链cDNA后进行real-time PCR以分析LrGLP2在转
录水平的表达。以烟草NtACT基因(GenBank登录
号AB158612.1)为内参基因, 扩增内参基因NtACT
的特异引物序列为5 ′ TCCCATTGAGCATG-
GAATAGTAAGC 3′和5′ TACATGGCAGGTA-
CATTGAAAGTCT 3′。扩增LrGLP2基因的特异引
物序列为5′ CTTCCTTCCCTGACTTCCGTCTC 3′
和5′ CCGTCAACTGTCTTCTTGTCCAACT 3′。
qRT-PCR的反应条件为: 50 ℃ 2 min, 95 ℃ 10 min;
95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 40个循环; 之后是熔解曲线
分析。qRT-PCR每个反应均设置3次重复, 以相对
表达量最低的转基因T2代株系中LrGLP2的表达量
为对照, 用2-∆∆CT法计算LrGLP2在其他样品中的表
达水平。
2.5 转基因烟草体外平板抑菌实验
提取5个转基因株系和野生型烟草植株的叶
片总蛋白, 蛋白提取方法参照Liu等(2013a)方法。
将尖孢镰刀菌、葡萄座腔菌、灰葡萄孢3种真菌
接种于PDA固体培养基中央, 28 ℃倒置培养2 d左
右, 待菌落直径约为3 cm时, 在菌落周围均匀放置
无菌滤纸片(直径为6 mm), 并进行编号。将所提取
的总蛋白浓度稀释到5 mg·mL-1, 按编号分别取20
μL蛋白溶液滴于各滤纸片上, 同时添加等体积的
空白对照(蛋白提取缓冲液), 置于28 ℃培养, 培养
期间不断观察转基因烟草叶片总蛋白对真菌生长
的抑制情况, 并据此来评价转基因株系的体外抗
真菌活性。
2.6 转基因烟草活体接种实验
选取体外抑菌效果较好的3个转基因株系
G2-1、G2-2和G2-3进行后续实验。
2.6.1 叶片接种
选取完全展开且大小均一的转基因烟草和野
生型烟草叶片, 用无菌枪头形成大小一致的伤口,
分别接种200 μL尖孢镰刀菌和灰葡萄孢孢子悬液
(106孢子 m·L-1), 用保鲜膜包裹所接种叶片以保
湿。接种7 d后收集接种叶片以观察受病菌侵染情
况。同时, 参照Jayaraj和Punja (2007)的方法计算
病斑面积。
2.6.2 根部接种
为验证LrGLP2转基因烟草对尖孢镰刀菌侵
染的抗性, 挑选大小和生长状态一致的转基因和
野生型烟草组培苗, 洗去培养基后将根部完全浸
入尖孢镰刀菌孢子悬液30 min, 之后将接种的烟草
置于无菌水中培养, 10 d后记录发病情况。
2.7 转基因烟草抗病反应相关酶活的测定
取0.2 g烟草叶片加液氮研成粉末, 加入2 mL
预冷的提取液充分研磨, 于4 ℃、12 000×g离心20
min, 所得上清液即为粗酶液, 用于检测接种尖孢
镰 刀菌前后转基因及野生型烟草中3种抗病反应
相关酶活性。
2.7.1 SOD酶活性测定
SOD酶活性测定参照Gay和Tuzun (2000)的方
法。反应体系含有100 μL粗酶液、0.8 mL磷酸钠
缓冲液(pH 7.8, 50 mmol·L-1)、1.5 mL L-蛋氨酸
(Met, 26 mmol·L-1)、0.3 mL 0.75 mmol·L-1 NBT溶
液和0.3 mL核黄素(0.2 mmol·L-1, 含有1.0 μmol·L-1
EDTA)。于25 ℃、光照强度为3 650 μmol·m-2·s-1的
光照培养箱内反应15 min后, 立即取出, 终止反
应。于560 nm波长处测定OD值。以将NBT的还原
抑制到对照一半(50%)时所需的酶量为一个SOD
酶活性单位。
2.7.2 谷胱甘肽硫转移酶(glutathione S-transferase,
GST)酶活性测定
GST酶活性测定参照Liu等(2013b)的方法。
反应体系含有1.5 mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0, 50
植物生理学报2226
mmol·L-1), 75 μL 100 mmol·L-1的GSH, 15 μL GST
粗酶液。加入75 μL 100 mmol·L-1的CDNB启动反
应, 以不加CDNB的为空白对照管, 测定在OD340的
变化。以每分钟催化1 μmol CDNB结合GSH的酶
量为1个酶活性单位(1 U)。
2.7.3 OXO酶活性测定
OXO酶活性测定参照Zhang等(1996)的方
法。取100 μL粗酶液加入到3.5 mL OXO显色液(50
mmol·L-1丁二酸/NaOH缓冲液, pH 3.8, 60%乙醇, 5
U·mL-1辣根过氧化物酶, 250 μL·L-1 N,N-二甲基苯
胺, 80 mg·L-1 4-氨基安替比林), 37 ℃水浴5 min后
加入0.4 mL草酸(50 mmol·L-1, pH 4.0)溶液, 混匀,
37 ℃水浴10 min, 加入20 μL NaOH (1 mol·L-1)溶液
终止反应, 测定反应液在555 nm处的OD值。每分
钟催化产生1 μmol H2O2为1个酶活性单位(1 U)。
2.8 统计分析
LrGLP2的相对表达水平、病斑面积和酶活
测定结果用均值和标准差进行表示。用SPSS统计
分析软件对所得数据进行分析和处理。野生型和
转基因植株之间的统计差异采用t检验进行分析。
实验结果
1 LrGLP2转基因烟草的产生及筛选
将携带有LrGLP2表达框的农杆菌Agrobacte-
rium tumefaciens LBA4404分8次侵染150多个烟草
叶盘, 经卡那霉素筛选出46棵T0代植株。通过基因
组DNA的PCR扩增筛选出35个LrGLP2阳性转基因
烟草单株, 部分烟草转基因植株的DNA扩增结果如
图2所示。观察LrGLP2转基因烟草阳性株与野生型
烟草的生长过程, 没有发现两者形态上的差异。
图2 LrGLP2转基因烟草的PCR检测
Fig.2 PCR analysis of LrGLP2 transgenic tobacco plantlets
阳性对照: pCAMBIA2300S-LrGLP2质粒; WT: 野生型烟草; Marker: DL2000 DNA Marker。
2 Southern杂交分析
随机选择5个阳性转基因烟草株系G2-1、
G2-2、G2-3、G2-8和G2-12, 以它们为材料进行
Southern杂交分析, 结果如图3所示。5个LrGLP2转
基因烟草株系中均出现特异杂交条带, 而在野生
型烟草植株中未检测到NPTII, 表明LrGLP2已成
功整合到转基因烟草的基因组中。至于LrGLP2
插入的最低拷贝数, G2-3中为1个, G2-1中为2个,
G2-2以及G2-8中为3个, G2-12中为4个。随后通过
共分离分析, 获得了上述5个阳性转基因株系的T2
代植株。
3 转基因烟草中LrGLP2 的表达水平分析
为了确定外源基因是否正常表达, 本文通过
qRT-PCR检测LrGLP2在转基因T2代烟草中的表达
水平。从图4可见, LrGLP2在所选的5个转基因烟
草T2代株系中均有表达, 且在G2-1株系中表达量最
高, 而在野生型烟草植株中没有检测到LrGLP2的
转录产物。表明LrGLP2基因与CaMV 35S启动子
构成的表达框在转基因烟草中稳定表达。
4 LrGLP2转基因烟草体外抑菌活性
提取5个转基因T2代烟草株系及野生型叶片
总蛋白进行体外抑菌实验。结果如图5所示, 与野
生型相比, 5个LrGLP2转基因烟草叶片粗蛋白对葡
萄座腔菌、尖孢镰刀菌和灰葡萄孢有不同程度的
抑制作用, 然而5个转基因株系对同一种病原真菌
的抑制程度不尽相同。选取抑菌效果较好的3个
转基因株系G2-1、G2-2和G2-3进行酶活性测定和
活体抑菌实验。
韩青等: 超表达岷江百合 类萌发素蛋白基因LrGLP2增强烟草对几种病原真菌的抗性 2227
转基因烟草和野生型烟草组培苗根部接种尖孢镰
刀菌。水培10 d后, 野生型烟草与转基因烟草的生
长状态出现明显的差异(图7)。野生型烟草叶片枯
萎, 大部分根组织腐烂变黑并脱落。而LrGLP2转
基因烟草虽然也有部分根变黑, 但整体生长较为
正常。毫无疑问, LrGLP2转基因烟草对尖孢镰刀
菌侵染具有很强的抗性。
6 LrGLP2转基因烟草酶活性分析
植物遭受环境胁迫后, 体内细胞中会积累大
量的ROS。当ROS的积累量超出机体的活性氧清
除能力时, 植物体内蛋白质、膜脂以及其他细胞
组分会受到氧化损伤, 从而使植物产生多种不良
生理反应, 甚至死亡。GST是活性氧清除系统的重
要组成部分, GST能催化有害物质的亲电子基团与
还原型GSH的巯基偶联, 使之极性增强, 水溶性增
加, 易于被机体清除, 从而保护DNA及一些蛋白质
免受损伤。GLPs通常以酶、受体和结构蛋白的形
图3 LrGLP2转基因烟草的Southern blotting分析
Fig.3 Southern blot profi le of LrGLP2 transgenic tobacco lines
WT: 野生型烟草; G2-1、G2-2、G2-3、G2-8和G2-12: Lr-
GLP2转基因T0代株系。
图4 转基因T2代烟草植株中LrGLP2的表达水平
Fig.4 Expression analysis of LrGLP2 in the T2
transgenic tobacco lines
WT: 野生型烟草; G2-1、G2-2、G2-3、G2-8和 G2-12: Lr-
GLP2转基因T2代株系。
5 LrGLP2转基因烟草的活体接种
由于葡萄座腔菌不是烟草的致病菌, 因此选
择尖孢镰刀菌和灰葡萄孢进行烟草叶片活体接种
实验。用尖孢镰刀菌、灰葡萄孢孢子悬液接种转
基因和野生型烟草叶片7 d后, 野生型叶片形成较
大的病斑, 叶片出现黄化及腐烂现象, 而LrGLP2转
基因植株G2-1、G2-2和G2-3形成的病斑较小, 黄
化及腐烂发生的程度较野生型明显减轻。从图6
可以看出, 转基因株系的病斑面积约是野生型的
1/3, 这表明转基因烟草具有很强的抗尖孢镰刀菌
和灰葡 萄孢侵染的能力。
为验证叶片接种结果, 将生长一致的LrGLP2
图5 LrGLP2转基因烟草株系蛋白提取液的体外抗真菌活性
Fig.5 Antifungal activity of the crude protein extract of LrGLP2 transgenic tobacco lines
A: 葡萄座腔菌; B: 尖孢镰刀菌; C: 灰葡萄孢。CK: 蛋白提取缓冲液; G2-1、G2-2、G2-3、G2-8和G2-12: LrGLP2转基因T2代株系。
植物生理学报2228
式发挥功能。一些GLPs具有OXO活性, 一些GLPs
则具有SOD活性, 它们在植物体内均能催化ROS产
生H2O2。为了研究这些抗病反应相关酶活在转基
因株系中是否受到LrGLP2超表达的影响, 测定了尖
孢镰刀菌接种前后转基因株系G2-1、G2-2、G2-3
和野生型烟草中的SOD、GST和OXO酶活性。
正常生长条件下, 与野生型相比, LrGLP2转基
因株系的SOD、GST和OXO活性分别提高了
35.07%~46.62%、24.15%~29.85%和31.59%~
39.77%。尖孢镰刀菌侵染后, 野生型烟草和Lr-
GLP2转基因烟草的SOD、GST和OXO活性均有增
强, 但LrGLP2转基因烟草的3种酶活均显著高于野
生型烟草(图8)。上述结果表明, 转基因烟草株系
中SOD、GST和OXO活性的提高与LrGLP2的超表
达以及对几种病原真菌的抗性密不可分。
讨　　论
GLPs是普遍存在于植物中的一类与Germin
序列高度同源的、位于细胞外基质的可溶性糖蛋
白, 在植物生长发育和逆境胁迫应答中起重要作
用。岷江百合是具有极强抗病性的一种珍稀野生
百合, 在前期的研究中, 基于岷江百合受尖孢镰刀
菌侵染过程的SSH cDNA文库, 克隆获得了一个
GLP基因LrGLP2, 并发现LrGLP2参与岷江百合对
尖孢镰刀菌的防卫反应(刘亚龙等2013)。为了证
实LrGLP2是否具有抗真菌胁迫的功能, 本研究构
建了LrGLP2超表达载体并转化烟草。Southern
blotting及qRT-PCR分析结果显示, LrGLP2成功整
合至转基因烟草基因组中, 并在T2代转基因烟草中
稳定表达(图3和图4)。
图7 LrGLP2转基因烟草对尖孢镰刀菌的抗性增强
Fig.7 Enhanced resistance of LrGLP2 transgenic tobacco seedlings against F. oxysporum by
immersing the roots in the spores suspension.
WT: 野生型烟草; G2-1、G2-2和G2-3: LrGLP2转基因T2代株系。
图6 LrGLP2转基因株系及野生型烟草叶片接种尖孢镰刀菌和灰葡萄孢后病斑面积测定
Fig.6 Measurement of lesion in the leaves of LrGLP2 transgenic tobacco lines and wild type caused
by the inoculation of F. oxysporum and B. cinerea
**表示与野生型差异显著(P<0.01)。
韩青等: 超表达岷江百合 类萌发素蛋白基因LrGLP2增强烟草对几种病原真菌的抗性 2229
作为病程相关蛋白家族的一员, GLPs与植物
抵御外源物质(如病原菌等)伤害密切相关。GLP
基因的超表达增强植株对病原菌及盐胁迫的抗性
(Knecht等2010; Lu等2010; Wang等2013), 另外,
Rietz等提出GLPs参与欧洲油菜(Brassica napus)对
核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)侵染后氧爆发过程
中的防御反应(Rietz等2012)。Jøhnk等发现受Rhi-
zoctonia sp.侵染后, 欧洲云杉(Picea abies)根部的2
个GLP基因上调表达(Jøhnk等2005)。为了进一步
研究LrGLP2抗真菌胁迫的能力, 本文选择了5个
LrGLP2转基因株系对葡萄座腔菌、尖孢镰刀菌和
灰葡萄孢3种病原真菌进行体外平板抑菌实验, 虽
然5个转基因株系抑制3种真菌菌丝生长的程度不
尽相同, 但明显高于野生型植株(图5)。随后选择
抗性较强的3个株系进行活体接种实验, 分别接种
尖孢镰刀菌和灰葡萄孢孢子 悬液后, 野生型叶片
形成较大的病斑, 而LrGLP2转基因株系G2-1、
G2-2和G2-3形成的病斑很小(图6)。此外, LrGLP2
转基因烟草与野生型烟草组培苗根部接种尖孢镰
刀菌后LrGLP2转基因烟草组培苗正常生长, 而野
生型烟草根部腐烂脱落, 叶片枯萎(图7)。显然, Lr-
GLP2的过表达显著增强了转基因烟草对尖孢镰刀
菌和灰葡萄孢的抗性。
GLPs普遍存在于植物各发育阶段的多个组织
器官中, 在植物生长发育及防御系统中起重要作
用。研究者指出, GLPs通过三种形式起多种生物
学功能: 一些GLPs具有酶活性, 如OXO和SOD等
(Lane等1993; Nakata等2002); 一些GLPs作为受体
参与信号传导, 如Rhicadhesins受体、ABP19/20激
素受体(Swart等1994; Ohmiya等1998); 还有一些
图8 尖孢镰刀菌侵染对LrGLP2转基因烟草及野生型烟草中SOD、GST和OXO酶活性的影响
Fig.8 Effects of infection of F. oxysporum on enzymatic assay for SOD, GST, and OXO in the LrGLP2 transgenic lines and wild type
WT: 野生型烟草; G2-1、G2-2和G2-3: LrGLP2转基因T2代株系; *表示P<0.05, **表示P<0.01。
GLPs作为结构蛋白参与多种生理生化反应(Chris-
tensen等2004; Banerjee和Maiti 2010)。值得一提的
是, OXO和SOD都能产生H2O2: OXO酶能将草酸分
解为H2O2和CO2 (Breen和Bellgard 2010), 降解草酸,
进而消除其毒性; SOD可以将有害的ROS转变成
H2O2和O2 (Knecht等2010)。适量浓度的H2O2既能
在植 物防御氧化胁迫反应中起重要作用, 又能在
许多生物和非生物胁迫应答过程中作为第二信使
调控相关抗氧化酶(如GSTs等)的表达(Manosalva
等2009; Sakamoto等2015)。Banerjee等人用真菌和
氧化剂处理超表达水稻(O. sativa) GLP基因的转基
因烟草, 发现烟草中H2O2大量积累(Banerjee等
2010)。本研究中, 尖孢镰刀菌侵染后, 野生型烟草
和LrGLP2转基因烟草的SOD、GST和OXO活性都
明显上升, 但LrGLP2转基因烟草的3种酶活均显著
高于野生型烟草(图8), 这表明LrGLP2转基因烟草
株系中, LrGLP2基因的超表达提高了SOD、GST
和OXO这3种酶的酶活性, 且LrGLP2转基因株系
可能通过提高相关防卫酶的活性增强对不良外界
条件的防御能力。
GLPs与小麦萌发素蛋白一样, 是单cupin结构
域的糖蛋白。GLPs普遍存在于植物体内, 参与植
物的多种生理过程, 包括植物早期发育和抵御外
界不良环境等(Sassaki等2014)。本研究发现岷江
百合类萌发素蛋白基因LrGLP2在烟草中超表达可
以增强T2代转基因烟草对几种病原真菌的抗性。
但是LrGLP2基因提高转基因烟草抗病 性的具体作
用机理并不十分清楚。为此, 拟在下一步研究中
利用酵母双杂交技术, 分离LrGLP2蛋白的互作蛋
白。此外, LrGLP2是岷江百合GLPs基因家族的成
植物生理学报2230
员之一, 在抗病防卫反应过程中, L rGLP2是否独立
行使其功能或是协同其他家族成员还需要进一步
深入研究。
参考文献
刘亚龙, 李红丽, 刘迪 秋, 张南南, 何华, 葛锋, 陈朝银(2013). 岷江百
合类萌发素蛋白基因LrGLP2的克隆及表达特性分析. 植物生
理学报, 49 (10): 1063~1070
Banerjee J, Das N, Dey P, Maiti MK (2010). Transgenically expressed
rice germin-like protein1 in tobacco causes hyper-accumulation
of H2O2 and reinforcement of the cell wall components. Biochem
Bioph Res Co, 402: 637~ 643
Banerjee J, Maiti MK (2010). Functional role of rice germin-like
protein1 in regulation of plant height and disease resistance. Bio-
chem Bioph Res Co, 394: 178~183
Breen J, Bellgard M (2010). Germin-like proteins (GLPs) in cereal
genomes: gene clustering and dynamic roles in plant defence.
Funct Integr Genomic, 10: 463~476
Christensen AB, Thordal-Christensen H, Zimmermann G, Gjetting T,
Lyngkjær MF, Dudler R, Schweizer P (2004). The germinlike
protein GLP4 exhibits superoxide dismutase activity and is an
imp ortant component of quantitative resistance in wheat and bar-
ley. Mol Plant Microbe In, 17: 109~117
Druka A, Kudrna D, Kannangara CG, Wettstein D, Kleinhofs A (2002).
Physical and genetic mapping of barley (Hordeum vulgare) ger-
min-like cDNAs. Proc Natl Acad Sci USA, 99: 850~855
Dunwell JM, Gibbings JG, Mahmood T, Saqlan Naqvi SM (2008).
Germin and germin-like proteins: evolution, structure, and func-
tion. Crit Rev Plant Sci, 27: 342~375
Gay PA, Tuzun S (2000). Temporal and spatial assessment of defense
responses in resistant and susceptible cabbage varieties during
infection with Xanthomonas campestris pv. campestris. Physiol
Mol Plant P, 57: 201~210
Jayaraj J, Punja ZK (2007). Combined expression of chitinase and lipid
transfer protein genes in transgenic carrot plants enhances resistance
to foliar fungal pathogens. Plant Cell Rep, 26: 1539~1546
Jøhnk N, Hietala AM, Fossdal CG, Collinge DB, Newman M (2005).
Defense-related genes expressed in Norway spruce roots after
infection with the root rot pathogen Ceratobasidium bicorne
(anamorph: Rhizoctonia sp.). Tree Physiol, 25: 1533~1543
Knecht K, Seyffarth M, Desel C, Thurau T, Sherameti I, Lou B,
Oelmüller R, Cai D (2010). Expression of BvGLP-1 encoding
a germin-like protein from sugar beet in Arabidopsis thaliana
leads to resistance against p hytopathogenic fungi. Mol Plant Mi-
crobe In, 23: 446~457
Lane BG, Dunwell JM, Ray JA, Schmitt MR, Cuming AC (1993).
Germin, a protein marker of early plant development, is an oxa-
late oxidase. J Biol Chem, 268: 12239~12242
Lim JH, Rhee HK, Kim YJ , Lim KB, van Tuyl JM (2003). Resistance to
Fusarium oxysporum f. sp. lilii in Lilium. Acta Hort, 620: 311~318
Liu D, He X, Li W, Chen C, Ge F (2013a). A β-1, 3-glucanase gene
expressed in fruit of Pyrus pyrifolia enhances resistance to sev-
eral pathogenic fungi in transgenic tobacco. Eur J Plant Pathol,
135: 265~277
Liu D, Liu Y, Rao J, Wang G, Li H, Ge F, Chen C (2013b). Overex-
pression of the glutathione S-transferase gene from Pyrus pyrifo-
lia fruit improves tolerance to abiotic stress in transgenic tobacco
plants. Mol Biol, 47 (4): 515~523
Liu D, Zhang X, Tu L, Zhu L, Guo X (2006). Isolation by suppres-
sionsubtractive hybridization of genes preferentially expressed
during early and late fiber development stages in cotton. Mol
Biol, 40 (5): 741~749
Lu M, Han YP, Gao JG, Wang XJ, Li WB (2010). Identifi cation and
analysis of the germin-like gene family in soybean. BMC ge-
nomics, 11: 620
Manosalva PM, Davidson RM, Liu B, Zhu X, Hulbert SH, Leung H,
Leach JE (2009). A germin-like protein gene family functions
as a complex quantitative trait locus conferring broad-spectrum
di sease resistance in rice. Plant Physiol, 149 (1): 286~296
Nakata M, Shiono T, Watanabe Y, Satoh T (2002). Salt stress-induced
dissociation from cells of a germin-like protein with Mn-SOD
activity and an increase in its mRNA in a moss, Barbula unguic-
ulata. Plant Cell Physiol, 43 (12): 1568~1574
Ohmiya A, Tanaka Y, Kadowaki K, Hayashi T (1998). Cloning of
genes encoding auxin- binding proteins (ABP19/20) from peach:
signifi cant peptide sequence similarity with germin-like proteins.
Plant Cell Physiol, 39 (5): 492~499
Rietz S, Bernsdorff FEM, Cai D (2012). Members of the germin-like
protein family in Brassica napus are candidates for the initiation
of an oxidative burst that impedes pathogenesis of Sclerotinia
sclerotiorum. J Exp Bot
Sakamoto A, Nishimura T, Miyaki Y, Watanabe S, Takagi H, Izumi
S, Shimada H (2015). In vitro and in vivo evidence for oxalate
oxidase activity of a germin-like protein from azalea. Biochem
Bioph Res Co, 458: 536~542
Sassaki FT, Bravo JP, González ER, Maia IG (2014). Expression Pat-
tern and Promoter Analysis of a Eucalyptus grandis Germin-like
Gene. Plant Mol Biol Rep, 33 (1): 12~21
Swart S, Logman TJ, Smit G, Lugtenberg BJ, Kijne JW (1994). Puri-
fi cation and partial characterization of a glycoprotein from pea
(Pisum sativum) with receptor activity for rhicadhesin, an attach-
ment protein of Rhizobiaceae. Plant Mol Biol, 24 (1): 171~183
Wang T, Chen X, Zhu F, Li H, Li L, Yang Q, Chi X, Yu S, Liang X
(2013). Characterization of peanut germin-like proteins, AhGLPs
in plant development and defense. PLoS ONE, 8: e617 22
Zhang Z, Yang J, Collinge DB, Christensen HT (1996) . Ethanol in-
creases sensitivity of oxalate oxidase assays and facilitates direct
activity staining in SDS gels. Plant Mol Biol Rep, 14: 266~272