全 文 ：西北农业学报　2011 , 20(1):114-118
Acta A griculturae Boreali-occidentalis Sinica
秋水仙素诱导葡萄风信子多倍体的研究＊
贾美丽 ,王　飞 ,贾爱平 ,郑丽娜
(西北农林科技大学园艺学院 ,陕西杨凌　712100)
摘　要:在离体培养条件下 , 比较了秋水仙素不同质量分数 、不同处理时间诱导亚美尼亚葡萄风信子体细胞
染色体加倍的效果。利用秋水仙素混配和浸泡法对亚美尼亚葡萄风信子的染色体进行加倍诱导 , 采用染色体
常规压片法鉴定染色体数目。结果表明 ,浸泡法以秋水仙素质量分数为 0.05%, 时间为 15 h 的变异率最高 ,
达到45.6%;混培法以秋水仙素质量分数为 0.05%, 时间为 15 d 的变异率最高 , 为 21.1%。经秋水仙素诱导
的变异株与正常二倍体植株比较 ,诱变植株叶片变厚变宽 , 叶色变深 , 鳞茎变大 ,气孔显著增大而单位面积气
孔数减少 ,对诱变植株进行细胞学观察后发现 , 对照二倍体植株 2n=2x=18 ,变异株 2n=4x=36 , 为四倍体 ,
另外还发现嵌合体的存在。
关键词:葡萄风信子;秋水仙素;多倍体;染色体
中图分类号:S682.2 　　　　文献标志码:A　　　　　文章编号:1004-1389(2011)01-0114-05
Colchicines Induced Polyploid Plants of Muscari armeniacum
JIA Meili ,WANG Fei , J IA Aiping and ZHENG Lina
(College of H orticulture , Northw est A&F Universi ty , Yangling S haanxi　712100 , China)
Abstract:The ef fect of colchicine concentration on chromosome reduplicat ion of Muscari armeniacum
was compared and time duration under the condit ion of vit ro cultiv ation.The chromosome reduplica-
tion o f Muscari armeniacum was induced w ith mixed and soaked colchicine , and chromosome number
were identi fied by conventional chromosome pellet.Fo r the t reatment of soaked colchicines , the best
induction ef fect w as obtained under the condit ion of concentrat ion 0.05% and t ime durat ion 15 h , in-
duction rate reached to 45.6%.Fo r the mixed colchicines , the highest induction ra te w as 21.1%un-
der the condi tion o f concentration 0.05% and time durat ion 15 d.Compared w ith the normal diploid
plants and the colchicines-induced plants , the co lchicines-induced plants had thicker and larg er leaves ,
darker leaf co lor , larger bulbs , larger stomata and fewer stomata number per uni t area.Cy tological
observation confi rmed that chromosome number of tet raploids w as 2n =4x =36 , how ever , chromo-
some number of diploids w as 2n=2x =18 , and a few mosaic w ere found.
Key words:Muscari armeniacum ;Colchicine;Polyploid;Chromosome
　　葡萄风信子(Muscari)又名蓝壶花 、葡萄百
合 ,是从欧洲引进的优良观花地被 ,为百合科蓝壶
花属多年生草本植物。其整个花序成串珠状 ,秀
丽高雅 ,花色众多 ,种类丰富 ,花期早 ,开放时间
长 ,是具有较高观赏价值的春花花卉 。但其植株
与花较小 ,无法达到很好的观赏效果。目前 ,关于
葡萄风信子的研究较少[ 1] ,国内外学者对葡萄风
信子的研究主要集中于染色体数目核型与变
异[ 2] 、花期调控[ 3] 、组织培养[ 4-6] 及基因转化受体
系统的建立[ 7] ,对其品质改良及种质资源创新尚
鲜见报道 。二倍体亚美尼亚葡萄风信子(M.ar-
meniacum)为单瓣花 ,花色为少见的碧蓝色 ,花期
＊ 收稿日期:2010-03-13　　修回日期:2010-04-02
基金项目:中国科学院知识创新项目(k zcxz-xb1-06)。
第一作者:贾美丽 ,女 ,在读硕士 ,研究方向为园艺植物种质资源。 E-m ail:ji am eili821101@163.com
通讯作者:王　飞 ,女 ,教授 ,主要从事果树及花卉生理与生物技术育种研究。 E-mail:x nwangfei521@126.com
为 11月初至 2月中旬的少花季节 ,因此 ,本试验
以其作为材料 ,采用组织培养和多倍体育种相结
合的方法使其体细胞染色体加倍 ,试图为培育具
有更高观赏价值的葡萄风信子新品种与新种质奠
定基础。
1　材料与方法
1.1　材 料
试材为二倍体亚美尼亚葡萄风信子(M.ar-
meniacum)的鳞茎。
1.2　方 法
1.2.1　外植体灭菌及愈伤组织诱导　选择生长
健壮的葡萄风信子鳞茎 ,用自来水冲洗 2 h后 ,在
超净工作台上用体积分数70 %的乙醇浸泡 30 s ,
用无菌水冲洗 3 次 ,再用 1 g/ L 的升汞消毒 10
min。无菌水冲洗 5次 ,在无菌条件下 ,将材料切
成 0.5 cm2 的小块 ,接种到培养基 MS + 1.0
mg/L 2-4 , D 上诱导愈伤组织 ,以愈伤组织作为
诱导多倍体的材料。
1.2.2　四倍体诱导　采用混合培养法和浸泡培
养法 。混合培养法是将愈伤组织分别接种于含有
0 、0.02%、0.05%和 0.1%质量分数秋水仙素的
基本培养基中 ,处理时间分别为5 、10 、15 、20 d ,然
后将处理后的愈伤组织转接到不含秋水仙素的基
本培养基上继续培养;浸泡培养法是将愈伤组织
分别浸泡于质量分数为 0 、0.02%、0.05%、0.1%
的秋水仙素溶液中 ,处理时间为5 、10 、15和20 h ,
在转速约 90 r/min的摇床上振荡培养 ,然后用无
菌水冲洗 5遍后接种于基本固体培养基上继续培
养。秋水仙素具有热不稳定性 ,加入时采用过滤
灭菌 。
两种诱导方法每处理均设 3个重复 , 10瓶为
1个重复 ,每瓶接 3块愈伤组织 ,愈伤组织大小为
0.5 cm ×0.5 cm ,基本培养基为 MS ,培养基蔗糖
质量浓度为 30 g/L ,琼脂 7 g/L ,在(25±1)℃下
光照和黑暗各 12 h ,照度 1 500 lx 条件下进行培
养。待长势恢复良好并诱导出不定芽继代培养 2
～ 3代 ,观察其形态变化 ,选择形态变异的不定芽
进行培养形成完整植株 ,对其根尖进行染色体检
测。
1.2.3　四倍体鉴定　气孔鉴定:选取植株成熟叶
片 ,用蒸馏水擦洗叶片下表面后 ,在叶片的下表面
均匀涂上一层无色指甲油 ,待指甲油干燥后 ,将指
甲油膜取下。将膜与叶片接触的一面向下置载玻
片上在显微镜下观察 。
染色体鉴定:对气孔显著增大的变异株 ,取根
尖采用改良苯酚品红染色法制片[ 8] ,具体步骤如
下:切取根尖 0.3 ～ 0.5 cm ,在 10 ～ 20 ℃条件下
用 0.1 mo l/L 的二氯对苯处理 6 ～ 8 h ,取出用蒸
馏水洗净 ,在 4 ℃条件下用新鲜配制的卡诺固定
液(V(95%乙醇)∶V(冰醋酸)=3∶1)固定 18 ～
24 h ,取出洗净 ,并置 60 ℃下 1 mo l/L HC l中酸
解 5 ～ 10 min ,取出水洗后用改良苯酚品红染色
压片观察 。
2　结果与分析
2.1　秋水仙素混合培养法诱导多倍体的效果
秋水仙素掺入培养基的混培法是诱导多倍体
较为常见的方式。试验通过秋水仙素不同质量分
数和时间梯度(表 1)对葡萄风信子的愈伤组织进
行多倍体诱导 ,待长势恢复良好并诱导出不定芽 ,
观察其形态变化 ,选择形态变异的不定芽继续进
行 2 ～ 3次继代培养形成完整植株 ,对形态明显变
异的植株进行根尖染色体检测以鉴定变异系数。
并记录秋水仙素诱导后一个月不能生长并出现褐
化死亡的愈伤块数 ,计算其死亡率 。
　　从表 1可知 ,葡萄风信子愈伤组织在秋水仙
素为 0.02%时 ,死亡率与变异率随着处理时间的
延长而增大;在秋水仙素为 0.05%时 ,随着处理
时间的延长死亡率增大 ,而变异率在处理 15 d时
最大;在秋水仙素为 0.1%时 ,随着处理时间的延
长死亡率增大 ,变异率降低;从变异植株的外观形
态 、气孔以及根尖染色体结果显示 0.05%的秋水
仙素处理 15 d 的变异最明显 , 且变异率最高为
21.1%。
2.2　秋水仙素浸泡培养法诱导多倍体的效果
化学诱变与组培的结合 ,使得多倍体诱导中
融入了组织培养的优点 ,加快了多倍体的育种进
程。而采用浸泡法与植物的组织器官直接接触 ,
诱导多倍体成功率较高。试验通过浸泡法利用不
同的秋水仙素质量分数和处理时间对葡萄风信子
愈伤组织进行变异诱导筛选 ,以得到最佳时间和
质量分数配比 ,结果见表 2 。
·115·1 期　　　　　　　　　　　　　　贾美丽等:秋水仙素诱导葡萄风信子多倍体的研究
表 1　秋水仙素混培法对葡萄风信子愈伤组织的诱变效应
Table 1　The inducing effect of colchicines on callus of M.armeniacum with mixed culture
秋水仙素/ %
Colchicine
处理时间/ d
T reating t ime
处理数
Num ber of
t reated callu s
死亡数
Death
number
死亡率/ %
Death
rate
变异数
Number
of m utants
变异率/ %
Mutation
rate
0 90 0 0 0 0
5 90 0 0 0 0
0.02 10 90 0 0 10 11.1
15 90 1 1.1 12 13.3
20 90 3 3.3 17 18.9
5 90 0 0 7 7.8
0.05 10 90 5 5.6 14 15.6
15 90 12 13.3 19 21.1
20 90 20 22.2 13 14.4
5 90 19 21.1 15 16.7
0.1 10 90 26 28.9 9 10.0
15 90 47 52.2 4 4.4
20 90 60 66.7 0 0
表 2　秋水仙素浸泡法对葡萄风信子愈伤组织的诱变效应
Table 2　 The inducing effect of colchicines on callus of M.armeniacum with soaked culture
秋水仙素/ %
Colchicine
处理时间/ h
T reating t ime
处理数
Num ber of
t reated callu s
死亡数
Death
number
死亡率/ %
Death rate
变异数
Num ber of
mutants
变异率 / %
Mutation
rate
0 90 0 0 0 0
5 90 0 0 2 2.2
0.02 10 90 3 3.3 15 16.7
15 90 12 13.3 29 32.2
20 90 19 21.1 19 21.1
5 90 7 7.8 10 11.1
0.05 10 90 11 12.2 25 27.8
15 90 16 17.8 41 45.6
20 90 23 25.6 19 21.1
5 90 40 44.4 20 22.2
0.1 10 90 49 54.4 21 23.3
15 90 62 68.9 12 13.3
20 90 89 98.9 0 0
　　由表 2可知 ,葡萄风信子愈伤组织在秋水仙
素为 0.02%时 ,随着处理时间的延长死亡率与变
异率增大 ,但当处理时间达到 20 h 后 ,则变异率
下降;在秋水仙素为 0.05%时 ,随着处理时间的
延长死亡率增大 ,而变异率在处理 15 h 时最大;
在秋水仙素为 0.1%时 ,随着处理时间的延长死
亡率与变异率均降低;从变异植株的外观形态 、气
孔以及根尖染色体结果显示 , 0.05%的秋水仙素
处理 15 h 的变异最明显 ,变异率最高为45.6%。
相对于混配法 ,利用浸泡法诱导多倍体的死亡率
和变异率都有所增加 ,且植株生长较差 。
2.3　多倍体鉴定
2.3.1　外部形态鉴定　试验发现 ,经秋水仙素处
理后的愈伤组织分化不定芽的速度普遍减缓 ,与
对照相比时间要延长一倍以上;与二倍体植株相
比 ,经秋水仙素诱导加倍产生的四倍体植株的叶
片较厚 、较宽 ,颜色也相对较深 ,但不是特别明显 ,
生成的小鳞茎也相对二倍体的要大(图 1)。
·116· 西　北　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　20 卷
2.3.2　气孔鉴定　取外部形态变化明显的试管
苗下表皮 ,显微镜下观察气孔 ,与二倍体葡萄风信
子相比 ,四倍体植株气孔面积增大且单位面积的
气孔数减少。见图 2(10×10倍镜下气孔照片)。
2.3.3　染色体鉴定　经外部形态及气孔鉴定出
的变异苗 ,利用根尖压片法对其进行染色体数鉴
定。图 3显示 ,二倍体亚美尼亚葡萄风信子的染
色体 2n=2x=18(图 3-A),对变异植株根尖进行
染色体检测 ,大约 30%以上的材料染色体超过 18
条 ,部分制片能完全看清楚染色体 2n =4x =36
(图 3-B),同时也观察到染色体 2n=30的嵌合体
现象(图 3-C)。
图 1　葡萄风信子二倍体(A)与四倍体(B)的外部形态比较
Fig.1　Comparion of modality of diploid(A)and tetraploid(B)Muscari armeniacum
图 2　葡萄风信子二倍体(A)与四倍体(B)的气孔比较
Fig.2　Comparion of stoma size of diploid(A)and tetraploid(B)Muscari armeniacum
图 3　葡萄风信子二倍体(A)、四倍体(B)和非整倍体(C)染色体
Fig.3　Chromosomes of diploid(A), tetraploid(B)and aneuploidMuscari armeniacum(C)
·117·1 期　　　　　　　　　　　　　　贾美丽等:秋水仙素诱导葡萄风信子多倍体的研究
3　讨论
由于秋水仙素对不同的植物细胞会产生不同
程度的影响 ,处理时应根据不同的植物 、组织 、器
官来灵活掌握处理的质量分数和时间。从本试验
数据可知 ,无论利用秋水仙素的混合培养法还是
浸泡培养法 ,多倍体的诱导率都会随着质量分数
的变化和处理时间的不同而有所变化。一定范围
内 ,质量分数越大时间越长诱导率也会随之增大 ,
但也会伴随着死亡率的提高 ,而且超过一定质量
分数范围和时间诱导率则下降;而质量分数越大
时间越长秋水仙素对植物的伤害也会增大。这与
前人报道的结果一致 。郑思乡等[ 9]利用秋水仙素
离体诱导百合不定芽的研究表明 , 质量分数为
0.05%时间为 24 h 诱导变异率最高;张志胜
等[ 10]利用秋水仙素离体诱导红掌愈伤组织表明 ,
在秋水仙素质量分数为 0.05%～ 0.1%时 ,低质
量分数长时间处理 ,四倍体诱导率高 ,高质量分数
短时间处理其诱导率低。因此 ,要获得较高的加
倍率 ,处理时间和秋水仙素质量分数非常重要。
对于葡萄风信子 ,笔者认为秋水仙素质量分数为
0.02%～ 0.05%时 ,四倍体诱导率较高 。
利用秋水仙素进行染色体加倍具有经济 、方
便 、诱变作用专一性强等特点 。近年来 ,特别是在
离体状态下 ,离体组织水平上利用秋水仙素诱导
染色体加倍的研究越来越多 ,而诱导材料的类型
对多倍体诱导率存在明显的影响 。李涵等[ 11] 通
过对非洲菊不定芽的诱导成功诱导出四倍体 ,最
高诱导率达到 16%;李林光等[ 12]通过对金冠苹果
成熟胚离体诱导成功诱导出四倍体 ,最高诱导率
达到 10.6%;张数鑫等[ 13] 通过对大葱愈伤组织诱
导成功诱导出大葱的四倍体 ,最高诱导率达到
25%;吴红芝等[ 14] 通过对彩色马蹄莲愈伤组织和
不定芽的诱导变异率达到 52%;郑宝强等[ 15] 通过
对春石斛的丛生芽苗的诱导变异率达到 69.1%。
而本试验通过对葡萄风信子愈伤组织的诱导最高
变异率也达到了 45.6%。可见 ,利用愈伤组织进
行多倍体诱导 ,可以获得更高的变异率 。
本试验通过秋水仙素的浸泡和混培两种方
法 ,分别设计 4个质量分数梯度和 4 个时间梯度
共 26个处理 ,以期得到诱导葡萄风信子的最佳质
量分数和时间配比 。结果可以看出 ,利用秋水仙
素浸泡法诱导葡萄风信子多倍体的变异率较混培
法要高 ,但是死亡率也高 。浸泡法中质量分数为
0.05%,时间为 15 h的诱导率高达 45.6%,而混
培法中最高诱导率是质量分数为 0.05%,时间是
15 d的配比。这与前人的研究略有差异 ,是由于
不同试验材料和诱导部位不同所致 。另外 ,本试
验诱导过程中的死亡率相对略高于其他植物 ,说
明葡萄风信子对秋水仙素的抗药性比较弱 ,在今
后的研究中应缩小秋水仙素的质量分数范围和处
理时间间隔 ,以得到更加精确的结果。
参考文献:
[ 1] 　王　远 ,罗凤霞 ,沈　健 ,等.葡萄风信子的研究进展[ J] .金
陵科技学院学报 , 2008 , 24(4):69-72.
[ 2] 　Roberto de la H errán Robles , Nieves Cunado , Juan L S an-
t os , et al.A.Garrido-Ram os , Carm elo Ruiz Rejó n A hetero-
chromatic satellit e DNA is highly amplif ied in a single ch ro-
m osome of Muscar i (Hyacin thaceae)[ J] .Ch romosoma ,
2001 , 110(3):197-202.
[ 3] 　于忠美 ,金为民 , 史益敏.葡萄风信子种球繁殖与花期调控
[ J] .上海交通大学学报:农业科学版 , 2006 , 24(1):34-37.
[ 4] 　Sakae Su zuki , Masaru Nakano.Organogenesis and somatic
emb ryogenesis from callu s cultures in Muscar i armeniacum
Leich tl.ex Bak[ J] .In Vi tro Cellular&Developmen tal Biolo-
gy Plan t , 2001 , 37(3):382-387.
[ 5] 　王　飞 ,许　胜 ,牛秀玲.葡萄风信子叶片 、鳞茎不定芽再生
体系的建立[ J] .西北农业学报 , 2006 , 15(3):149-152.
[ 6] 　孙冬青 ,王　飞 ,李新凤.组培微环境对葡萄风信子组培苗
生长及移栽后生理特性的影响[ J] .西北农业学报 , 2008 , 17
(4):244-248 , 262.
[ 7] 　许　胜 ,王　飞 ,刘雅莉.葡萄风信子基因转化受体系统的
建立[ J] .西北农林科技大学学报:自然科学版 , 2007 , 35
(10):71-76.
[ 8] 　李懋学 ,张敩方.植物染色体研究技术[ M ] .哈尔滨:东北林
业大学出版社 , 1991.
[ 9] 　郑思乡 ,章海龙 ,董志渊 ,等.东方百合多倍体诱导及种球繁
育的研究[ J] .西南农业大学学报:自然科学版 , 2004 , 26
(3):260-263.
[ 10] 　张志胜 ,黎扬辉 , 姜　蕾 ,等.红掌四倍体的离体诱导及其
鉴定[ J] .园艺学报 , 2007 , 34(3):729-734.
[ 11] 　李　涵 ,鄢　波 , 张　婷 ,等.切花非洲菊多倍体诱变初报
[ J] .园艺学报, 2009 , 36(4):605-610.
[ 12] 　李林光 ,何　平 , 欧春青 ,等.金冠苹果成熟胚离体诱导四
倍体的研究[ J] .园艺学报 , 2007 , 34(5):1129-1134.
[ 13] 　张数鑫 ,谢芝馨 , 于元杰 ,等.秋水仙素结合组织培养技术
诱导大葱多倍体的研究[ J] .生物技术 , 2005 , 15(4):67-
70.
[ 14] 　吴红芝 , 张锡庆 , 郑思乡 , 等.彩色马蹄莲多倍体的诱导
[ J] .园艺学报, 2008 , 35(3):443-446.
[ 15] 　郑宝强 ,张　莹 , 王　雁 ,等.春石斛的多倍体诱导[ J] .园
艺学报 , 2009 , 36(9):1381-1384.
·118· 西　北　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　20 卷