全 文 ：收稿日期： 2008-09-23； 修回日期： 2009-01-10
基金项目： 非盈利性科研院所基金资助项目（RISF060702）
作者简介： 陈国良， 从事林木抗逆基因工程研究。 E-mail： glc_2008@163.com。 通信作者： 卓仁英， 副研究员， 博
士， 从事林木抗逆功能基因组学等研究。 E-mail： zhuory@gmail.com
浙 江 林 学 院 学 报 2009， 26（5）： 644 - 651
Journal of Zhejiang Forestry College
青杨双向电泳实验体系的建立
陈国良1，2， 蒋 晶1， 乔桂荣1， 金 梁2， 孙月华2， 杨 晔1， 周 婧1， 卓仁英1
（1． 中国林业科学研究院 亚热带林业研究所， 浙江 富阳 311400； 2. 兰州大学 草地农业科技学院， 甘肃 兰州 730020）
摘要： 用改良丙酮沉淀法、 三氯乙酸 （TCA ） -丙酮沉淀法和酚抽法抽提青杨 Populus cathayana 的蛋白质， 分别获得
了 437， 603 和 721 个蛋白斑点， 以酚抽法提取的分离纯化方法效果最佳， 不仅能很好地提取蛋白,而且能有效去除样品
中的盐分。 通过比较， 分析了双向电泳不同条件对电泳结果的影响， 确立了 300 μg·IPG 胶条－1的最佳上样量、 90 000
V·h 的聚焦时间以及 20 min 平衡时间的双向电泳条件。 研究还比较了氯化钠胁迫前后双向电泳图谱差异， 发现有 46 个
蛋白点存在差异， 其中 10 个下调， 36 个上调（4 个新诱导表达）。 图 9 参 24
关键词： 植物学； 氯化钠胁迫； 蛋白质组学； 双向电泳； 青杨
中图分类号： S718.4 文献标志码： A 文章编号： 1000-5692（2009）05-0644-08
Populus leafy proteomics with NaCl stress using two-dimensional
electrophoresis analysis
CHEN Guo-liang1，2， JIANG Jing1， QIAO Gui-rong1， JIN Liang2， SUN Yue-hua2，
YANG Ye1， ZHOU Jing1， ZHUO Ren-ying1
（1. Research Institute of Subtropical Forestry， The Chinese Academy of Forestry， Fuyang 311400， Zhejiang， China；
2. College of Pastoral Agriculture Science and Technology， Lanzhou University， Lanzhou 730020， Gansu， China）
Abstract： Salt stress is one of the major abiotic stressed over the world. Most of the researchs were foucsed
on improve the ability of plant species living in salt soil. Two-dimesional gel electrophoresis （2-DE）is one of
the most useful methods in proteins research. To determine total protein extraction efficiency from Populus
cathayana with two-dimensional electrophoresis （2-DE） analysis， three protein extraction methods （phenol
extraction， improved acetone precipitation method， and TCA-acetone precipitation method） were compared.
Electrophoresis conditions and leafy proteomics of P. cathayana with salt stress were also analyzed. Results
showed that the three protein extraction methods generated 437， 603， and 721 protein spots with the
phenol extraction method more effectively removing salt from the protein sample， generating more protein
spots， and giving clearer background for the 2-DE map. The results showed that condition of 300 μg per
IPG gel， 20 min equilibrium time， 90 000 V·h IEF time was the suitable treatment. Also， the leafy
proteomics analysis revealed that 10 protein spots was down-regulators， 32 protein spots was up-regulators，
and 4 new protein spots was induced by salt stress. These proteins may be important response to salt stress.
［Ch， 9 fig. 24 ref.］
Key words： botany； NaCl stress； proteomics； two-dimensional electrophoresis （2-DE）； Populus cathayana
杨树 Populus是世界上分布最广， 适应性最强的树种， 主要分布于北半球温带和寒带地区， 在中
国亚热带、 暖温带和中温带均有分布 ［1］。 杨树是第 3 个完成全序列测定的植物 ［2］。 青杨 Populus
第 26 卷第 5 期
cathayana 为中国特有的树种， 广泛分布于东北、 华北、 西北及西南各省区， 耐盐性很差,为典型的甜
土木本植物， 并且与已经测序完成的毛果杨 Populus trichocarpa 亲缘关系很近， 可直接利用毛果杨的
测序结果 ［3］。 因此， 研究氯化钠胁迫下其蛋白质合成成分变化， 对于深入了解木本植物盐碱伤害机
理， 开展木本植物耐盐分子育种具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 试剂
尿素 （电泳级）、 AmpholineTM ph 3.5 ~ 10和殿乙酰胺购自 GE healthcare （Piscataway， NJ， USA）；
丙烯酰胺（Acr）， 甲叉双丙烯酰胺（Bis）， 十二烷基硫酸钠（SDS）， 二硫苏糖醇（DTT）购自上海生工；
苯甲基磺酰氟（PMSF）， 3-［3-（胆酰氨丙基）二甲氨基］丙磺酸内盐（CHAPS）， 考马斯亮蓝 G-250（CBB
G-250）和甘氨酸购自 Sigma（USA）； β-巯基乙醇， 聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）， 三羟甲基氨基甲烷（Tris），
乙二胺四乙酸（EDTA）， 饱和酚， 曲拉通（Triton X-100）， 过硫酸铵和四甲基乙二胺（TEMED）等购自上
海生工； 三氯乙酸、 丙酮、 乙酸铵、 甲醇、 乙醇、 磷酸、 甘油、 硫酸、 硫酸铵均为分析纯， 购自上海
生工。
1.2 植物材料
选择大小、 培养时间一致的青杨组织培养幼苗移栽到 Horgland 培养液 ［4］中， 成活后在 25 ℃条件
下加入 50 mmol·L－1 氯化钠处理 12 h以上。 对照不加氯化钠处理。
1.3 蛋白制备方法的选择
样品处理是双向电泳实验最基础也是最关键的环节之一。 木本植物中大量的次生代谢物质如单宁
及酚类等会干扰蛋白的提取和等电聚焦， 使 2-DE结果产生水平条纹［5－7］。 针对不同的材料和不同的实
验的目， 应该采用不同的样品处理方法。 本研究文对目前常用的 3种植物蛋白质提取方法进行了比较。
方法 1： 改良丙酮沉淀法提取蛋白， 参照 Damerval 等的方法 ［8］。 1 g 青杨叶片按其鲜质量的 10%
加入水不溶性 PVPP 后用液氮研碎， 转移至 50 mL 离心管中； 5 min 后加入终浓度为 10 mmol·L－1的
DTT， 充分混匀， 室温下放置 20 ～ 30 min； 4 ℃ 15 000 r·min－1离心 15 min， 上清转入另一离心管中；
加入 5 倍于上清体积的丙酮， －20 ℃条件下沉淀至少 2 h （最好过夜）； 4 ℃ 15 000 r·min－1 离心 15
min， 弃上清液， 将沉淀转入 1.5 mL Eppendof 管中； 沉淀用 800 g·kg－1和纯冷丙酮各洗 1 次后放入真
空干燥机中干燥 （或超净台上吹干）； 沉淀按 10 mg 干粉末加 200 μL 蛋白抽提液的比例， 加入含有 9
mol·L－1和 20 g·kg－1 CHAPS， 10 g·kg－1 DTT， 10 g·kg－1 Ampholine （pH 3.5 ～ 10）的蛋白裂解液； 4 ℃放
置 4 h， 15 000 r·min－1离心 20 min， 上清液即为待分析的蛋白溶液。
方法 2： 三氯乙酸（TCA）-丙酮沉淀法提取蛋白， 参照 Saravanan & Rose 的方法 ［9］。 1 g 青杨叶片
置于预冷的研钵中研磨成粉末 （研磨时按其鲜质量的 10%加入水不溶性 PVPP）， 转移至 50 mL 离心
管中， 加入 5 倍体积预冷的 TCA-丙酮溶液（含 100 g·kg－1TCA 和 0.7 g·kg－1β-巯基乙醇的丙酮液）， －20
℃沉淀至少 2 h （最好过夜）； 4 ℃ 15 000 r·min－1离心 15 min， 弃上清， 将沉淀转入 1.5 mL Eppendof
管中； 沉淀用800 g·kg－1和纯冷丙酮各洗 1次； 按 10 mg干粉末沉淀加 200 μL蛋白抽提液的比例加入
含有 9 mol·L－1尿素、 20 g·kg－1 CHAPS 、 10 g·kg－1 DTT 和 10 g·kg－1 Ampholine （pH 3.5 ～ 10）的蛋白裂
解液； 4 ℃放置 4 h， 15 000 r·min－1离心 20 min， 获得的上清液即为待分析的蛋白溶液。
方法 3： 酚抽法（Phe）， 参照 Carpentier 等的方法［10］。 1 g青杨叶片放入预冷的研钵中研磨成粉末；
加入 10 mL蛋白质提取缓冲液 （0.7 mol·L －1 蔗糖 、 50 mmol·L－1硼酸， 50 mmol·L－1 抗坏血酸、 40
mmol·L－1 DTT、 50 g·kg－1 PVPP， pH 9）， 待其融化后， 继续研磨数分钟， 转至 50 mL 离心管中； 4 ℃
下保持 30 min， 期间震荡以重新混匀数次； 4 ℃ 15 000 r·min－1离心 30 min， 取上清液， 加入与上清
液等体积的 Tris-饱和酚， 充分震荡混合 10 min， 4 ℃下放置 30 min； 4 ℃ 8 000 r·min－1离心 20 min，
回收酚相至一新离心管中； 在剩余的水相中再加入 1/2 体积的 Tris-饱和酚抽提， 混合 2 次所得酚相，
加入 5倍于酚相体积预冷的 0.1 mol·L－1乙酸铵甲醇溶液， －20 ℃沉淀蛋白 2 h 或过夜； 4 ℃ 15 000 r·
min－1离心 20 min， 弃上清液， 沉淀用－20 ℃预冷乙酸铵甲醇洗涤 1次； 沉淀再用预冷丙酮（含 20 g·kg－1β-
陈国良等： 青杨双向电泳实验体系的建立 645
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图 1 同一时期的材料 3种不同蛋白提取方法的 2-DE
Figure 1 Comparison of protein extraction methods by 2-DE
巯基乙醇， －20 ℃预冷）洗涤 2次； 按 10 mg干粉末沉淀加 200 μL蛋白抽提液的比例， 加入含有 9 mol·
L－1尿素、 20 g·kg－1 CHAPS、 10 g·kg－1 DTT、 10 g·kg－1 Ampholine（pH3.5 ～ 10）的蛋白裂解液； 4 ℃放置
4 h ， 15 000 r·min－1 离心 20 min， 获得的上清液即为待分析的蛋白溶液。
用十二烷基硫酸钠-胶体电泳（SDS-PAGE）和双向电泳（2-DE）比较 3 种提取方法得到的蛋白质浓
度、 条带数量差异。 本实验中等电聚焦按照 150 V 2 h， 250 V 1 h， 500 V 2 h， 2 500V 2 h， 8 000 V
4 h， 500 V 6 h 条件， 24 cm， pH 3 ～ 10 的胶条 300 μg·IPG－1上样量进行， 电泳按照 120 g·kg－1的丙
烯酰胺， 5 mA 1 h， 15 mA电泳的条件进行。 其他反应条件根据双向电泳条件实验结果进行改进。
1.4 双向电泳条件的建立
第一向等电聚焦使用 24 cm pH 3 ~ 10 IPG 胶条（GE healthcare）， 在 Ettan IPGphor 电泳仪（Ettan
IPGphor 3， GE healthcare） 上完成。 采用胶内水化方式上样。 水化和聚焦均在标准型胶条槽内进行。
第二向 SDS-PAGE采用 125 g·kg－1分离胶及银染法［11］。
1.4.1 蛋白上样量的比较 蛋白样品上样量对双向电泳过程和结果分析有重要影响 ［12－16］。 本研究使用
24 cm pH 3 ～ 10的胶条， 设计 100， 300， 600 μg·IPG （第一向固相 pH梯度）胶条-1 3种不同蛋白上样
量来进行比较， 以确定最佳的上样量。
1.4.2 等电聚焦参数对等电聚焦电泳的影响 根据制造商提供的等电聚焦电泳参数进行青杨叶片蛋白
质的等电聚焦电泳， 但实验中各步骤在设定时间内未能达到所预先设置的电压。 高电压是等电聚焦过
程中蛋白质能否充分泳动到等电点的重要前提， 直接关系到等电聚焦的效果。 因此， 实验设置了不同
等电聚焦参数， 使电泳分别达到 40 000， 90 000， 150 000 V·h。
1.4.3 平衡时间的优化 平衡目的是使蛋白质分子与 SDS 充分相互作用， 以确保第二向蛋白质分子
的迁移。 为了把握最佳的平衡时间及胶条中蛋白质随时间变化而丢失的情况， 本研究采用两步法， 分
别在含有 DTT和碘乙酰胺的平衡母液中平衡 10， 20和 50 min来确定最佳平衡时间。
1.5 NaCl胁迫后青杨蛋白质成分变化分析
选取生长健壮、 大小一致的青杨无菌苗进行水培， 一部分培养在 50 mmol·L－1的盐水中， 一部
分培养在蒸馏水中， 72 h 后采用酚抽法提取叶片蛋白。 按照上述优化体系进行分析， 重复 3 次。
1.6 图像获取与分析
图像扫描采用 ImageScanner Labscan 扫描仪 （GE healthcare ）， 软件分析采用 ImageMasterTM 2D
Platinum Software（Version 5.0， GE healthcare）。
2 结果与分析
2.1 不同提取方法对蛋白质浓度和成分的影响
通过 SDS-PAGE 实验， 我们发现， 用方法 3（酚抽法）得到的蛋白条数要比其他 2 种方法多， 前 2
种方法提取的蛋白质条带差别不大。
双向电泳结果如图 1。 方法 1 得到的蛋白质斑点比较少， 仅 437 个点， 横纹和纵纹多， 背景色
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图 3 不同聚焦时间 2-DE图谱
Figure 3 2-DE gel of different IEF time
重， 说明样品中蛋白质含干扰物质比较多 （图 1A）。 方法 2 得到的蛋白质斑点分布比较清晰， 共检
测到 603 个点（图 1B）。 方法 3 在双向电泳二维图谱上蛋白质得到了有效的分离， 经 ImageMaster2D
软件分析蛋白质点有 721个， 且比较均匀地分布在凝胶上， 样品中杂质大大减少， 大多数蛋白质斑点
呈圆形或椭圆形， 清晰可见， 分离出的各蛋白质点基本上没有拖尾、 纹理和横向扩散（图 1C）。
2．2 双向电泳条件对双向电泳结果的影响
研究发现上样量对双向电泳结果有显著影响。 在 100 μg·IPG 胶条－1上样量情况下， 2-DE 图谱有
明显的纹理， 蛋白点非常少， 低丰度蛋白点模糊不清甚至无法显示 （图 2A）。 图 3B 中上样量达
300 μg·IPG胶条－1， 横向与纵向拖尾少， 蛋白质点呈圆形， 分离均匀， 检出的蛋白质点增加到 660 个
以上， 低丰度蛋白数量明显增加。 上样量达到 600 μg·IPG-1胶条的蛋白分离效果差， 产生明显的横向
条纹， 蛋白点多带有横向与纵向拖尾及不规则的点， 高丰度蛋白的斑点过大影响甚至遮盖其他蛋白点
的显示（图 2C）， 这是由于上样量过大， 使样品溶液中的杂质及离子含量增大， 聚焦效果较差， 影响
蛋白点的有效分离。 因此， 本实验采用 300 μg·IPG胶条－1的上样量进行后续的实验。
等电聚焦时各蛋白质到达各自的等电点所需要的时间与电泳的伏·小时（V·h）数有关（图 3）。 因
此， 对于特定的胶条都有一个最小的聚焦伏·小时数， 只有达到这一数值时才能保证各蛋白质到达各
自的等电点。 植物绿色组织中含有高丰度的 Rubisco 大亚基， 达到聚焦往往需要更多的伏·小时数。
聚焦 40 000 V·h 的电泳图谱存在严重的横纹， 只能分辨少数蛋白点， 聚焦未完全， 大部分蛋白
质还没有运动到自身的等电点， 结果在图谱上表现为一些水平的线状， 而不是成斑点状 （图 3A）。 聚
焦 90 000 V·h 的电泳图谱基本没有纹理， 蛋白点清晰可辨， 且比较均匀的分布于整个图谱上， 为聚
焦完全状态， 说明蛋白质已电泳至等电点位置（图 3B）。 聚焦 150 000 V·h 的电泳图谱也存在一些纹
理， 且斑点整体向碱性端移动了一定的距离， 这应该是由于聚焦时间过长引起的（图 3C）。
平衡时间对电泳结果也有明显的影响。 平衡 10 min 时蛋白质斑点的分离效果较差， 蛋白点多有
拖尾现象， 形成 “雨点” 状， 这可能是平衡时间过短， SDS 与蛋白质结合不够（图 4A）。 平衡 20 min
图 2 不同上样量 2-DE图谱
Figure 2 2-DE gel of different loading quantity
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时电泳图谱基本没有纹理、 点拖尾， 蛋白点清晰可辨， 比较均匀地分布于整个图谱上， 说明平衡时间
合适（图 4B）。 平衡 50 min 时图谱存在严重的纹理， 蛋白点明显减少， 且一些含量高的蛋白质相对变
淡， 说明平衡时间过长， 在平衡时使一些蛋白质扩散而损失［12］（图 4C）。
2.3 盐碱胁迫对青杨蛋白质成分的影响
为了减少实验结果分析时引起的误差， 双向电泳时蛋白质样品的上样量应该尽量一致， 因此， 蛋
白质样品的准确定量非常关键。 本实验在 Bradford法的基础上做了一定的改进 ［17］， 使样品能够在酸性
的条件下进行检测， 显著提高蛋白质定量检测的精确度。
2-DE 结果的重复性在蛋白质组研究中很重要。 本实验采用 IPG 胶条对从蛋白质提取到 2-DE 的
整个过程进行了多次重复,所得的 2-DE 图谱如见图 5A 和图 5B， 利用 ImageMaster 2D Platinum 6.0 软
件分析凝胶上蛋白点数量和丰度基本一致， 具有较好的重复性。
在盐胁迫 72 h后， 提取青杨叶片蛋白质， 采用 24 cm， pH 3～10的线性 IPG 干胶条上样， 经过双
向电泳， 银染， 获得蛋白质图谱（图 6）。 从图中可以看出碱性端蛋白点较少， 大部分蛋白集中在酸性
端， 说明青杨叶片蛋白质大部分属于酸性蛋白。 采用 ImageMaster 2D Platinum 6.0 软件结合肉眼对图
谱进行分析可以看出， 盐胁迫条件下蛋白图谱与对照条件下蛋白图谱具有一定相似性， 但也存在差异
性。 在盐胁迫后， 所表达的蛋白点数有所增加， 且存在一些表达量上的差异。
凝胶上的蛋白点被鉴定之后， 通过 ImageMaster 2D Platinum 6.0 软件自动匹配， 显示 78 个差异
点， 通过肉眼观察和手动调整， 结果显著差异的点有 46个， 其中 10个下调， 36个上调（图 7）。 大部
分差异的蛋白点区别仅在于表达的蛋白量发生了变化， 但有 4个蛋白是新诱导表达的， 它们只出现在
盐处理的样品中， 可能是盐处理后新合成的或者在对照样品中丰度很低以至检测不到。 图 8显示氯化
图 4 不同平衡时间 2-DE图谱
Figure 4 2-DE gel of different equilidring time
图 5 同一样品的 2次双向电泳图谱比较
Figure 5 Reproducibility of 2-DE for the same sample
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第 26 卷第 5 期
图 8 氯化钠胁迫后蛋白质表达下调
Figure 8 Protein expression down-regulate
图 6 对照及盐处理 72 h后双向电泳图
Figure 6 Maps of 2-DE of the control and salt after 72 h
钠胁迫后蛋白质表达下调的蛋白点； 图 9显示氯化钠胁迫后蛋白质表达上调的蛋白点。
3 讨论
样品制备是 2-DE 成功与否的关键步骤［18］， 样品质量的好坏直接决定双向电泳的分辨率、 重复性
和蛋白质谱的结果［19］。 为了获得更多的蛋白质信息， 要求尽量提高样品蛋白质的溶解性并减少蛋白质
的损失和降解。 丙酮沉淀法步骤少， 操作简单， 但得到的蛋白质样品颜色发黄， 蛋白浓度低， 2-DE
图谱纹理多， 背景色重， 说明不能有效地去除酚等可溶性杂质。 TCA 法步骤较少， 能有效抑制蛋白
酶的活性， 对去除脂类杂质效果较好， 但得到的蛋白质较难溶解， 使 2-DE 图可检测到的蛋白点减
图 7 对照及盐处理 72 h后双向电泳图分析
Figure 7 Comparison maps of 2-DE of the cortrol and salt stress after 72 h
图 9 氯化钠胁迫后蛋白质表达上调
Figure 9 Protein expression up-regulate
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少， 且对多糖的去除效果不好。 酚抽法虽然步骤较多， 但得到的蛋白呈乳白色， 易溶解， 2-DE 图背
景色干净， 可检测到的蛋白点多， 能有效去除盐离子、 多酚和多糖等对电泳不利的可溶性物质。
干燥后的蛋白质干粉在进行电泳前应尽可能充分溶解， 在样品溶解液中常加入的试剂有变性剂、
去污剂、 还原剂和载体两性电解质等， 这些物质都可促进蛋白质溶解［20］。 本研究采用含 9 mol·L－1尿素、
20 g·kg－1CHAPS， 10 g·kg－1DTT， 10 g·kg－1两性电解质的样品溶解液来溶解蛋白， 得到了比较理想的
2-DE 图谱， 其中尿素作为中性促进剂， 能破坏氢键， 很好地展开蛋白质分子， 暴露疏水集团， 降低
疏水氨基酸残基与溶液结合的障碍， 从而增加样品的溶解度。 但尿素遇热后会分解产生氰酸盐， 可能
引起蛋白质氨基的甲酞化， 因此， 溶解后的蛋白质样品溶解液均不能加热超过 37 ℃。
在木本植物蛋白质提取方面前人提出了许多排除色素、 酚、 醌等干扰植物蛋白质样品制备的方
法［21－22］。 本研究利用 Tris-饱和酚的特性， 即酚是蛋白质的良好溶剂， 在样品制备过程中， 蛋白质和脂
类溶于酚相， 盐、 核酸、 多酚和多糖等可溶性物质进入水相； 其次， 通过增加离心力和离心时间， 尽
可能地把密度大的糖离至上清液的上层； 然后， 在吸取中间相时细心操作， 枪头避开上层含有多糖的
水相小心吸取； 最后， 酚相中的蛋白质通过乙酸铵的甲醇溶液沉淀， 再用冷丙酮多次清洗蛋白， 去除
色素和铵离子等杂质。 在实验过程中发现， 加入 PVPP可以有效地去除多酚。
从电泳图中可以看出， 用酚抽法提取的蛋白质稳定， 包含了叶片中大部分可溶性蛋白， 几乎没有
横条纹和拖尾等纹理现象， 得到了清晰的电泳图谱。 说明此方法适于青杨叶片蛋白质的提取。
上样量大小主要取决于胶条的长度、 pH范围以及染色方法等。 一般来说， 胶条越长， pH 范围越
广， 上样量就越大， 考马斯亮蓝染色比银染需要的上样量大［21］。 提高蛋白质的上样量有利于低丰度蛋
白的检测， 但上样量过高可导致高丰度蛋白斑点掩盖低丰度蛋白斑点， 且样品中含有盐离子， 上样量
越大盐离子浓度也越大， 引起聚焦时电压的上升， 影响等电聚焦效果， 易产生横向条纹， 银染时易产
生饱和现象。 因此， 在双向电泳中样品上样量的大小对电泳过程和结果分析有重要影响 ［23－24］。
本研究发现， 延长低电压的电泳时间， 可使盐离子有效地移动到胶条的两极， 有助于样品中盐离
子泳出和后续聚焦所需的高电压。
本研究以优化的双向电泳对盐胁迫处理的青杨叶片蛋白进行了分离， 获得分辨率较高的 2-DE 图
谱， 并获得了 46个差异点， 拟继续进行质谱分析， 在蛋白水平上研究盐逆境胁迫下复杂的基因表达。
致谢： 在蛋白质双向电泳中得到 GE公司的李娜工程师、 中国科学院植物研究所李肖芳硕士的大力帮
助， 特此致谢！ 陈国良、 蒋晶、 乔桂荣对实验工作贡献相同。
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