全 文 ：第 9 卷第 14 期·总第 118 期
2011 年 07 月·下半月刊

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地耳草 HPLC指纹图谱的研究※
杨 牧 1 吴燕兰 2 罗振杨 3 刘训红 4* 韩 乐 4
摘要：目的 建立地耳草 HPLC 指纹图谱分析方法，评价不同产地、商品地耳草药材的质量。方法 用 HPLC 技术对不同产地、商品地耳
草进行分析，测定其指纹图谱，并作模糊聚类法分析和相似度评价。结果 初步建立了以 10 个共有峰为特征指纹信息的 HPLC 指纹图谱；发
现少数产地、商品地耳草 HPLC 指纹图谱有一定差异。结论 方法准确可靠，重现性好，可作为地耳草内在质量评价的依据。
关键词：地耳草；指纹图谱；HPLC
doi：10.3969/j.issn.1672-2779.2011.14.106 文章编号：1672-2779（2011）-14-0154-03
Studies on HPLC Fingerprint of Hyperici Japonici Herba
Yang Mu1, Wu Yanlan1, Luo Zhenyang1, Liu Xunhong2*, Han Le2
（1. Nanjing mochou vocational school, Nanjing 210013, China; 2. Nanjing University of TCM, Nanjing 210046, China）
Abstract: Objective To establish the analytical method for the fingerprint of Hyperici Japonici Herba by HPLC and estimate the quality of
Hyperici Japonici Herba from different habitats. Methods Hyperici Japonici Herba from different habitats were analyzed and the chromatographic
fingerprint were determined by HPLC. The data were analysed by Fuzzy Cluster and Fingerprint Similarity Evaluation Software to compare the similarity
of samples. Results HPLC fingerprint of 10 main peaks was established preliminarily.It was discoveried that a small number of samples differed from
others. Conclusion The method is reliable,accurate and can be used for quality control of Hyperici Japonici Herba.
Key words: Hyperici Japonici Herba; Fingerprint；HPLC

地耳草为较常用中药，系藤黄科植物地耳草Hypericum
japonicum Thunb 干燥全草，具有清热利湿、解毒消肿之
功效，主治湿热黄疸、泄泻、痢疾、疮痂痈肿、急性肾
炎、血吸虫病等症。其注射液已广泛用于临床，治疗急、
慢性肝炎，效果均显著[1]。现代药理研究表明，地耳草
具有增强免疫和抗肿瘤的作用[2]，其主要活性成分为黄
酮类化合物[3]。目前，有关地耳草药材及其制剂，尚无
完善的质控方法。本研究在地耳草药材品质鉴定、黄酮
类成分含量测定、HPCE 指纹图谱研究的基础上[4-7]，建
立了 HPLC 指纹图谱分析的方法，分析比较不同产地、
商品地耳草指纹图谱特征，为地耳草药材内在质量的综
合评价和全面控制进一步提供资料。
1 仪器与试药
Waters 2965 高效液相色谱仪（包括：四元泵、自动
进样器、在线脱气装置、柱温箱、2996DAD 检测器），
Empower 色谱工作站。山柰酚对照品（中国药品生物制
品检定所提供，批号：110861-200303）；槲皮素对照品
（中国药品生物制品检定所提供，批号：10081-9905）；
芦丁对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号：
0080-9705）；异槲皮苷对照品（上海博蕴生物科技有限

※基金项目：南京中医药大学“药用生物资源研究与利用”优秀科技
创新团队支持计划[No：2007]
作者单位：1 江苏省南京市莫愁中等职业学校（南京 210013）
2 南京医药股份有限公司（南京 210046）
3 南京林业大学（南京 210037）
4 南京中医药大学（南京 210046）
*通讯作者
公司，批号：21637-25-2）；槲皮苷对照品（中国药品生
物制品检定所提供，批号：111538-200302）；金丝桃苷
对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号：111521-
200303）。乙腈（Merck KgaA 试剂公司，HPLC 级，批
号：11-20/21/22-36）；甲醇（江苏汉邦科技有限公司，
色谱纯，批号：200703102）；甲醇（上海实意化学试剂
有限公司奥佳化工有限公司产品，批号：20071018）；蒸
馏水为自制重蒸水。其余所有试剂均为分析纯。地耳草
各产地样品实地采集或由当地药材公司提供，不同商品
由南京各医院门诊部中药房提供，编号为：S1-河北，S2-
江苏，S3-安徽，S4-广西，S5-福建，S6-湖南，S7-江西，
S8-南京市中医院，S9-南中医大国医堂，S10-南中医大
百草堂，S11-南京市传统中医门诊部。均经南京中医药
大学刘训红教授鉴定为藤黄科植物地耳草 Hypericum
japonicum Thunb.干燥全草。留样凭证存放于南京中医药
大学中药鉴定实验室。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱：Alltima C18（250×4.6 mm id，
5μm）；柱温 50℃；流动相：A—0.4%磷酸，B—乙腈；
梯度洗脱：0～10min，A:B 为 89:11，10～18min，A:B 线
性改变到 84:16，18～30min，A:B 为 84:16，30～35min，
A:B 线性改变到 77:23，35～40min 为 77:23，40～55min，
A:B线性改变到 60:40，55～65min，A:B线性改变到 89:11；
65～70min，A:B 为 89:11；流速：1ml/min；检测器：DAD；
检测波长：254nm；进样量：10µl。
2.2 对照品溶液制备 取芦丁对照品 9.28mg、槲皮素对
照品 8.84mg 和山奈酚对照品 5.86mg，精密称定，分别置
于 50ml 量瓶中，用 80%甲醇溶解并定容。精密称取异槲
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皮苷对照品 7.29mg、槲皮苷对照品 8.70mg、金丝桃苷对
照品 6.48mg，分别置于 10ml 量瓶中，用 80%甲醇溶解并
定容。制得浓度分别为芦丁 0.1855mg•ml-1、金丝桃苷
0.648mg•ml-1、异槲皮苷 0.729mg•ml-1、槲皮苷 0.87mg•
ml-1，槲皮素 0.1767mg•ml-1和山奈酚 0.1137mg•ml-1的对
照品储备液。精密吸取芦丁、槲皮素、山奈酚储备液 6ml，
异槲皮苷储备液 5ml，槲皮苷储备液 8ml，金丝桃苷储备
液 0.6ml，溶于 50ml 量瓶中，则配成混合对照品液。
2.3 供试品溶液制备 取样品粉末（过 3 号筛）1.0g，
精密称定，加入 80%甲醇 50ml，回流 90min，然后补足
重量，继续回流 90min，补足重量，再回流 90min，过滤，
滤液用 80%甲醇定容至 100ml 量瓶中，过 0.45µm 微孔
滤膜，作为供试品溶液。
2.4 方法学考察 精密度试验: 取同一产地供试品（S9）
溶液 20μL，连续进样 6 次，测定指纹图谱，结果表明，
共有峰的相对保留时间的 RSD 均小于 1%，相对峰面积
的 RSD 均小于 2.5%，表明仪器精密度良好。
稳定性试验：取供试品（S9）溶液 20μl，分别在 0、
4、8、12、24、36h 进样 6 次，测定指纹图谱。结果表
明，共有峰的相对保留时间的 RSD 均小于 2%，相对峰
面积的 RSD 均小于 3.5%，表明供试品溶液在 36h 内稳
定。重现性试验：取同一产地样品（S9）粉末 6 份，平
行操作，制备供试品溶液，测定指纹图谱，结果表明共
有峰相对保留时间的 RSD 均小于 2%，相对峰面积的
RSD 均小于 3.5%，表明本法测定的重现性良好。
2.5 指纹图谱的建立 取供试品溶液 10μl，注入液相色
谱仪，按选定的测试条件进行检测。同一上述条件下，
测定所有供试品的 HPLC 色谱图。根据 11 个批次供试
品测定结果所给出的峰数、峰值（积分值）和峰位（相
对保留时间）等相关参数，进行分析、比较，制定优化
的指纹图谱。（图 1，图 2）

7.异槲皮苷 8.槲皮苷 10.槲皮素
图 1 地耳草的 HPLC 指纹图谱

图 2 地耳草的 HPLC 三维指纹图谱
2.6 指纹图谱分析
2.6.1 共有指纹峰标定 经对供试品 HPLC 色谱图的
分析、比较，地耳草样品标定 10 个共有峰作为指纹图
谱的特征峰，7、8、10 号峰与对照品指纹图谱对照分
别鉴定为异槲皮苷、槲皮苷和槲皮素。以 8 号峰槲皮
苷为参照峰，分别求出各共有峰与之相比的α值（调
整保留时间之比）和各共有峰的相对峰面积（峰面积
之比）。（表 1）
表 1 地耳草 HPLC 指纹图谱中共有峰的相对保留时间α值和相对峰面积
峰号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
α 0.0644 0.0732 0.0974 0.1519 0.1690 0.5823 0.7392 1 1.1851 1.3538
S1 0.0379 0.0583 0.0385 0.1085 0.0747 0.1001 0.4031 1 0.0802 0.2499
S2 0.0325 0.0653 0.0315 0.2496 0.0547 0.2147 0.6270 1 0.1111 0.3353
S3 0.0609 0.0688 0.0451 0.0390 0.1813 0.0930 0.4144 1 0.1375 0.5477
S4 0.0450 0.0629 0.0488 0.0628 0.1136 0.1773 0.5840 1 0.1492 0.3015
S5 0.0256 0.0356 0.0230 0.0335 0.0535 0.1023 0.3145 1 0.0922 0.1924
S6 0.0687 0.0702 0.0408 0.0562 0.2228 0.1331 0.3951 1 0.1488 0.4433
S7 0.0853 0.0883 0.0512 0.0489 0.2565 0.1874 0.4312 1 0.1043 0.5251
S8 0.1605 0.1352 0.0822 0.0562 0.3703 0.1476 0.5639 1 0.1042 0.9054
S9 0.1609 0.1429 0.0880 0.0571 0.3961 0.1436 0.5908 1 0.1350 0.9802
S10 0.0542 0.0722 0.0595 0.0713 0.0961 0.1194 0.5038 1 0.1118 0.3060
S11 0.0843 0.1014 0.0827 0.0854 0.4155 0.1936 0.5680 1 0.2134 0.6353
2.6.2 指纹图谱的聚类分析 选择地耳草 HPLC 指纹图
谱中 10 个比较明显的共有峰，根据表 4 中的数据，用
SPSS16.0 软件中的hierarchical cluster analysis对 11个地
耳草样品进行聚类分析，所用聚类方法为 average linkage
（between groups），距离公式为 square euclidean distance，
得不同样品地耳草的聚类分析图（图 3，图 4）。

图 3 地耳草 HPLC 指纹图谱的聚类分析图
0
1
2
3
4
5
6
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
共有峰组分
含
量
（
mg
/g
)
S1
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
S9
S10
S11

图 4 地耳草 HPLC 指纹图谱中的共有峰组分含量图
结果显示，当距离标尺在 1 时，样品 8、9，样品 3、
6、7，样品 1、5，样品 4、10 各归为一类；在 3 时，样
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品 2 与样品 4、10 归为一类；在 5 时，样品 1、5 与样
品 2、4、10 归为一类；在 6 时，样品 3、6、7 与样品
11 归为一类；在 9 时，样品 1、2、4、5、10 与样品 3、
6、7、11 归为一类；在 25 时，样品 8、9 才与其他样品
归为一类。
2.6.3 相似度评价 将测试数据导入国家药典委员会
“中药指纹图谱相似度评价系统（2004A）”软件，经校
正选峰，设定匹配模式，将色谱峰自动匹配，生成共有
模式（图 5），进行色谱峰差异性评价和整体 相似性评
价。各相似度值如下：S1-0. 985，S2-0. 969，S3-0. 980，
S4-0. 985，S5-0. 969，S6-0. 988，S7-0. 982，S8-0. 862，
S9-0.863，S10-0. 981，S11-0. 958。结果表明不同产地的
地耳草样品指纹谱相似度较好（＞0.950），不同商品地
耳草的样品指纹谱相似度，除了 S8、S9 在 0.85 以上外，
其余均在 0.95 以上。

图 5 地耳草样品 HPLC 指纹图谱共有模式
3 讨论
3.1 色谱条件的优化 色谱柱的选择：选用 Alltima C18
（150×4.6mm id，5μm）和 Alltima C8（250×4.6 mm id，
5μm）两种反相柱做对比试验，结果表明，Alltima C18
柱（250×4.6mm id，5μm）柱效较高，分离效果好，确
定以此柱作为试验用柱。
洗脱条件的选择：流动相的组成，选择试验了乙腈-
甲醇、乙腈-0.4%磷酸，试验结果表明，后者对峰的分离
较好，减少拖尾现象；洗脱梯度条件则是经过多次反复
试验摸索而确定。
柱温与流速的选择：流速与柱温对分离度、峰形也
有一定影响。实验选择 30℃、40℃、50℃的不同柱温和
0.8ml•min-1、1ml•min-1两种流速，试验结果表明，50℃
的柱温、1ml•min-1的流速，可使色谱峰得到最好的分离
效果。
3.2 供试品制备的优化 以异槲皮苷、槲皮苷、槲皮
素峰面积、色谱峰数及分离度为考察指标，对提取方
法（回流法与超声提取法）、提取溶剂（60%、70%、
80%、955%甲醇）分别作比较，选择直接回流法，确
定 80%甲醇为提取溶剂；并对提取条件作优选，选择
溶剂用量、提取时间、提取次数 3 个因素，每个因素
选择 3 个水平，设定因素水平表，进行正交试验，确
定上述提取条件。
指纹谱分析表明，各地样品之间既有相关性，又有
区别。相应共有指纹峰均已在色谱图上体现，但各峰面
积有所不同，说明各地药材其成分含量有一定差异。通
过共有峰标定和峰强分析，异槲皮苷、槲皮苷和槲皮素
可作为地耳草指纹谱的特征指纹峰群（分别为 7、8、10
号峰），其配比关系为（0.3145～0.6270）:1:（0.1924～
0.9802）。结合含量分析结果[5]，保留时间为 24.018min
的芦丁、24.738min 的金丝桃苷，53.815min 的山奈酚，
在部分地耳草样品中含量甚微，没列为共有特征峰，这
也体现不同产地样品间的差异。不同产地、商品地耳草
指纹谱相似度较好，除 S8、S9 在 0.85 以上外，其余均
在 0.95 以上。
本实验初步建立了 HPLC 指纹图谱分析的方法。方
法准确可靠，重现性良好，可用于地耳草药材内在质量
的评价和控制。
参考文献
[1] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草[M].上海:上海科学技
术出版社,1999:2208.
[2] 肖培根.新编中药志(第三卷)[M].化学工业出版社,2002:90.
[3] 高玉红,杨艳红.地耳草的化学成分与药理活性[J].国外医药·植物药分册,
2005,(3):1406.
[4] 宋建平,刘训红,朱育凤,等.地耳草及其混伪品的鉴定研究[J].中药材,
2008,31(5):663-665.
[5] 韩乐,宋建平,刘训红,等.地耳草黄酮类成分分析[J].中国药学杂志,2011,
46(7):542-545.
[6] 韩乐,宋建平,刘训红,等.地耳草 HPCE 指纹图谱的研究[J].中国实验方剂
学杂志,2011,17(10):104-107.
[7] 韩乐,刘训红,吴启南,等.HPCE-DAD同时测定地耳草中 6 种黄酮的含量[J].
中国中药杂志,2011,36(15):25-31.
（本文校对：郑黎 收稿日期：2011-05-01）



桐乡市中医院回扣专项治理三步走

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第三，总结提高阶段。对“医药回扣专项治理年”活动
进行全面认真总结，争取建立治理医药购销领域商业贿赂的
长效机制。 （郭明明 李杨）