全 文 ：文章编号:1001-4829(2006)04-0627-04
　　收稿日期:2005-10-12
　　基金项目:云南省自然科学基金重点项目“微生物杀植物病原真
菌制剂的应用基础研究”(2004C0002Z)资助
作者简介:刘树芳(1981-),男 ,白族 ,云南大理人 , 研究实习员 ,
主要从事植物病理学研究工作 , ＊为通讯作者。
放线菌次生代谢产物对百合灰霉病菌的抑菌活性筛选
　刘树芳1 ,李艳琼2 ,曾　莉1＊ ,李铭刚2 ,杨佩文1 ,李一青2 ,尚　慧1 ,崔晓龙2 ,
李家瑞1 ,文孟良2
(1.云南省农业科学院农业环境资源研究所 ,云南昆明　650205;2.云南大学教育部微生物资源开放研究重点实验室 ,云南省生
物资源保护与利用重点实验室 ,云南昆明　650091)
摘　要:以 268份放线菌次生代谢产物为筛选对象 ,百合灰霉病为供试菌种 ,通过抑制孢子萌发试验 、黄瓜子叶法两种试验方法 ,进
行抗百合灰霉病活性筛选。结果表明 ,孢子萌发抑制率 80 %以上的有 16份 , 黄瓜子叶离体叶片防治效果 50 %以上的有 10份。
筛选到一批具有开发应用前景的放线菌资源。
关键词:放线菌;次生代谢产物;百合灰霉病;活性测定
中图分类号:S644.1　　　文献标识码:A
Primary study on inhibition activity of actinomycetes seconday
metabolites to Botrytis elliptica (Berk.)Cooke.
LIU Shu-fang1 , LI Yan-qiong2 ,ZENG Li1＊, LI Ming-gang2 , YANG Pei-wen1 , LI Yi-qing2 , SHANG Hui 1 , CUI Xiao-long2 , LI Jia-rui1 ,WEN Meng-
liang2
(1.Institute of Agriculture Environment and Resource , Yunnan Academy of Agricultural Sciences ,Yunnan Kunming 650205 , China;2.The Key Labo-
ratory for Microbial Resources of M inistry of Education , Laboratory for Conservation and Utilization of Bio-resources, Yunnan University , Yunnan Kun-
ming 650091, China)
Abstract:268 actinomycete isolates were gained from soil samples ,which were sampled from different places in Yunnan.On the basis of antagonistic
examination of inhibition effect on conidia germination and in vitro leaves of cucumber control eff iciency , the actionmycete strains inhibit to B .ellip-
t ica were selected.The results showed that of 268 strains , the control efficiency of 10 strains had protective activities above 50 %, the conidia germi-
nation inhibition rate of 16 strains were above 80 %.These st rains may have potential to develop as fungicide to cont rol plant diseases.
Key words:actinomycetes;secondary metabolites;Botrytis elliptica (Berk.)Cooke;inhibition activity
　　灰霉病是由灰葡萄孢属(Botrytis)引起的一种世
界性病害 。其寄主范围广 ,对蔬菜 、花卉等经济作物
危害严重[ 1] 。长期以来 ,灰霉病主要用多菌灵 、乙霉
威等化学药剂来进行防治 ,由于灰霉病菌具有较快
的遗传变异的潜能 ,从而发生抗药性的突变 ,产生耐
药性的菌株而降低防效[ 2～ 3] ,同时 ,大量施用化学药
剂 ,严重污染农产品和环境 ,危害人畜安全。放线菌
资源在自然界中普遍存在 ,其活性产物抗生素是微
生物农药的重要来源之一[ 4] ,筛选出的活性物质具
有产业化生产的优势 。国内韩斯琴等已从放线菌发
酵液 D2-4中发现其对番茄灰霉病等病害有抑制作
用的抗生素[ 5] 。云南具有丰富的放线菌资源 ,但对
放线菌次生代谢产物抑菌活性物质的筛选研究报道
较少 ,本文报道了利用孢子萌发法和黄瓜子叶法筛
选放线菌次生代谢产物抑制百合灰霉病菌的研究结
果 。
1　材料与方法
1.1　供试菌种
百合灰霉病(Botrytis elliptica (Berk.)Cooke.)从
百合病叶上按常规方法分离[ 6] ,20 ℃下培养 ,备用 。
1.2　放线菌培养基
1.2.1　斜面培养基　酵母膏 4 g 、葡萄糖 4 g 、麦芽
膏 5 g 、复合维生素 5 mg 、微量盐 1 mL、琼脂粉 20 g 、
水 1000 mL 、pH 7.2。
1.2.2　种子培养基　酵母膏 4 g 、葡萄糖 4 g 、麦芽
膏 5 g 、复合维生素 5 mg 、微量盐 1 mL 、水 1000 mL、
pH 7.2。
627
2006年 19卷 4期
Vol.19　　No.4 　　　　　　　　　　　　　　
西　南　农　业　学　报
Southwest China Journal of Agricultural Sciences
表 1　孢子萌发抑制率在80 %以上的放线菌次生代谢产物
Table 1　The actinomycete secondary metabolites with spore germination inhibition rate above 80 %
次生代谢产物
Secondary
metabolites
萌发率(%)
Germination
rate
抑制率(%)
Germination
inhibition rate
次生代谢产物
Secondary
metabolites
萌发率(%)
Germination
rate
抑制率(%)
Germination
inhibition rate
YIM 39086 0.00 100.00 YIM 31339 0.00 100.00
YIM 32261 0.00 100.00 YIM 31332 10.00 90.00
YIM 31767 0.00 100.00 YIM 33495 10.00 90.00
YIM 31033 0.00 100.00 YIM 31105 10.00 90.00
YIM 31927 0.00 100.00 YIM 31377 20.00 80.00
YIM 31249 0.00 100.00 YIM 31799 20.00 80.00
YIM 31318 0.00 100.00 YIM 31303 20.00 80.00
YIM 31635 0.00 100.00 YIM 33009 20.00 80.00
　　注:每处理镜检孢子 300个。
1.2.3　发酵培养基　大豆粉 20 g 、蛋白胨 2 g 、葡萄
糖20 g 、淀粉 5 g 、酵母膏 5 g 、NaCl 4 g 、K2HPO4 0.5 g 、
MgSO4·7H2O 0.5 g 、CaCO3 2 g 、水 1000 mL、pH7.8。
1.3　筛选样品前处理
1.3.1　筛选用发酵培养液的制备　接种好的斜面
28 ℃培养 168 h ,然后接种于 100 mL 种子液中 。种
子液 220 r/min振荡培养 48 h 后 ,再按 10 %的接种
量接种于 100 mL发酵液中 ,220 r/min振荡培养 120
h 。
1.3.2　筛选样品的制备方法　上述发酵液加入等
体积乙醇 ,经振荡 8 h后 ,离心(3000 r/min ,10 min),
取上清液 ,并在旋转蒸发仪上蒸去乙醇 ,水相采用冻
干仪冻成干粉后置于提取物保存库提供 。
268份放线菌次生代谢产物均采用上述方法获得。
1.4　放线菌次生代谢产物活性测定
1.4.1　抑制孢子萌发试验[ 6] 　将水琼脂倒入直径 6
cm 的培养皿中制成平板待用。用 1 %磷酸二氢钾
和葡萄糖溶液混合溶液配制浓度为 1×105 个孢子/
mL 的孢子悬浮液与放线菌次生代谢产物以体积比
为 1∶2 的比例混合均匀 ,取 200 μl混合液平铺于上
述已制备好的水琼脂平板上 ,在 20 ℃下培养 , 24 h
后观察结果 。
1.4.2　黄瓜子叶离体防治效果测定[ 7～ 9] 　黄瓜品
种为昆明市华兴种业有限公司生产的“云南翠” 。先
将放线菌次生代谢产物均匀喷洒在播种后 10 d左
右的黄瓜子叶上。待叶片上的放线菌次生代谢产物
晾干后(约 3 ～ 4 h),将叶片取下 ,用经水充分润湿的
棉花包于叶柄上。将培养了 7 d左右的百合灰霉病
病菌 ,用打孔器打成直径 5 mm 的菌饼 ,菌面向下 ,
放置于叶片正面近叶尖及近叶柄处各放置 1块 。每
处理设 3个重复 ,每重复 3片叶 ,并设清水为空白对
照 。在 20 ℃的光照培养箱中保湿培养 72 h(12 h光
照 ,12 h黑暗)后 ,观察发病情况 ,待空白对照充分发
病时 ,采用十字测量法测量每个病斑直径 ,以病斑大
小作为病害分级标准 。病斑分级标准:0 级:无病
斑;1级:病斑直径 0.1 ～ 5 mm;3级:病斑直径 5.1 ～
10.0 mm;5级:病斑直径 10.1 ～ 15.0 mm;7级:病斑
直径15.1 ～ 20.0 mm;9级:病斑直径 20.1 mm以上。
表 2　防治效果在 50 %以上的放线菌次生代谢产物
Table 2　The actinomycete secondary metabolites with control efficiency above 50 %
次生代谢产物
Secondary
metabolites
病情指数
Disease
indexes
防治效果(%)
Control
eff iciency
次生代谢产物
Secondary
metabolites
病情指数
Disease
indexes
防治效果(%)
Control
ef ficiency
YIM 32462 5.98 92.31 YIM 31913 22.22 63.27
YIM 31332 27.16 65.08 YIM 32087 23.46 61.22
YIM 31704 30.86 60.32 YIM 32445 24.69 59.18
YIM 35309 32.10 58.73 YIM 31378 27.16 55.10
YIM 39086 32.10 58.73 CK2 60.49 -
YIM 32261 35.80 53.97
CK1 77.78 -
　　注:试验分两次进行 ,CK1 为第一批次试验的空白对照 , CK2 为第二批次试验的空白对照。
628 西　南　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　19卷
图 1　放线菌次生代谢产物对百合灰霉菌孢子萌发的影响
Fig.1　Effect of Act inomycete secondary metabolites on spore germination of B.elliptica(Berk.)Cooke
2　结果与分析
2.1　抑制孢子萌发试验结果
　　孢子萌发试验结果如表 1 所示。YIM 39086 、
YIM 32261 、YIM 31767 、YIM 31033 、YIM 31927 、YIM
31249 、YIM 31318 、YIM 31635 、YIM 31339等 9份放线
菌次生代谢产物对孢子萌发有较好的抑制作用 ,抑
制率为 100 %,YIM 31332 、YIM 33495 、YIM 31105等
3份次生代谢产物抑制率为 90 %, YIM31377 、YIM
31779 、YIM 31303 、YIM 33009等 4份次生代谢产物抑
制率为80 %。试验中观察到 ,部分放线菌次生代谢
产物如YIM 32462 、YIM 31913等虽然抑制率较低 ,但
在观察中可以看到百合灰霉病菌分生孢子萌发的芽
管膨大 、畸形 ,对这部分次生代谢产物进行了黄瓜子
叶离体防治效果测定 。
2.2　黄瓜子叶离体防治效果测定结果
黄瓜子叶测定法试验结果如表 2所示 。YIM
32642防治效果为 92.31 %;YIM31332 、YIM 31704 、
YIM 31913 、YIM 32087等 4份次生代谢产物防治效
果为 60 %以上 ,YIM32445 、YIM 31378 、YIM 32261 、
图 2　放线菌次生代谢产物对百合灰霉病的防效
Fig.2　Control eff iciency of Actinomycete secondary metabolites on
B.elliptica(Berk.)Cooke
YIM 39086 、YIM 35309 等 5 份次生代谢产物防治效
果为 50 %以上。从表 2中可以看出 ,在抑制孢子萌
发试验中 ,对分生孢子萌发的芽管有膨大 、畸形作用
的放线菌次生代谢产物如 YIM 32462 、YIM 31913等
在离体防治效果测定中也表现出较好的防治效果。
3　讨　论
　　目前 ,国内李树正等利用黄瓜子叶法进行灰霉
病筛选成品药剂的试验[ 8] ,刘微等也利用黄瓜子叶
法进行灰葡萄孢抑菌活性筛选[ 10] ,本试验结果也表
明了此方法的可行性。因此 ,可以利用黄瓜子叶法
进行防治百合灰霉病药剂的筛选 。此方法还具有周
期短 、成本低等优点。
本试验通过抑制孢子萌发法和黄瓜子叶离体叶
片防治效果测定结果表明 ,从 268份放线菌次生代
谢产物中筛选出 21份对百合灰霉病具有抑菌活性
的代谢产物。其中 , YIM 31332 、YIM 39086 、YIM
32261等三份次生代谢产物孢子萌发抑制率为90 %
以上 ,黄瓜子叶防治效果均在 50 %以上 ,表现出较
为稳定的抑制作用。YIM 31767 、YIM 31033 、YIM
31927 、YIM 31249 、YIM 31635 、YIM 31339 、YIM 33495 、
YIM 31105 、YIM 31377 、YIM 31799 、YIM 31303 等 11
份次生代谢产物孢子萌发抑制率为 80 %以上 ,黄瓜
子叶离体叶片防治效果均在 50 %以下 ,而 YIM
32462 、YIM 31704 、YIM 35309 、YIM 32087 、YIM31913 、
YIM 32445 、YIM 31378 等 7 份次生代谢产物孢子萌
发抑制率为 80 %以下 ,但黄瓜子叶防治效果均在
50 %以上 。这些现象说明次生代谢产物抑菌活性
与活性物质的含量 、作用机制以及环境条件等因素
有关。
试验结果表明 ,放线菌次生代谢产物中存在对
百合灰霉病具有较高活性的抑菌物质 。对抑制孢子
萌发率和黄瓜子叶离体防治效果较好的放线菌次生
代谢产物 ,如 YIM 31332 、YIM 39086 、YIM 32261等将
6294期 刘树芳等:放线菌次生代谢产物对百合灰霉病菌的抑菌活性筛选
是下一步研究的重点 ,我们将对这些放线菌次生代
谢产物进行活性成分分离 ,确定结构和含量 ,进行活
性跟踪等试验研究。
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(责任编辑　谢晓慧)
630 西　南　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　19卷