全 文 ：第 31 卷 第 3 期
2003年 5月
东　北　林　业　大　学　学　报
JOURNAL OF NORTHEAST FORESTRY UNIVERSITY
Vo l.31 No.3
May 2003
王百合雄性不育突变体无性系花蕾花药的生化分析
　　　　　 张克中　赵祥云　　　黄善武　陆长甸　　 张启翔
(北京农学院 ,北京 , 102206)　　　　　　　　(中国农业科学院)　　　　　　(北京林业大学)
　　摘　要　对王百合及其雄性不育突变体无性系`白天使 `金王二号 花蕾和花药的游离氨基酸 、糖 、蛋白质含
量 , POD及 CAT 酶活性 , POD酶谱进行了比较研究。结果表明:从花粉母细胞初期 、减数分裂中期 I 至四分体—
单核期 , 两不育系花药中游离氨基酸含量 、脯氨酸含量 、还原糖含量 、蛋白质含量都比王百合低 ,花蕾 POD酶活性比
王百合高;花药中总糖含量及 CAT 活性与王百合相近。减数分裂中期 I不育系花药 POD酶谱比王百合多 2～ 3 带 ,
且有些带比王百合深 ,表明 POD酶活性比王百合强。上述物质含量 、酶活性及酶谱的变化可能与花粉的败育有关。
关键词　王百合(L ilium regale Wilson);雄性不育;氨基酸;糖;蛋白质;POD同工酶
分类号　S644.1
Biochemical Analysis of Flower Buds and Anther in Lilium regale s Male Sterility Mutants Lines/Zhang Kezhong ,
Zhao Xiangyun(Depar tment o f Landscape and Gardening , Beijing Agricultural College , Beijing 102206 , P.R.China);
Huang Shanw u , Lu Changdian(Academy of Chinese Agricultural Science);Zhang Qixiang(Beijing Forestry Universi-
ty)// Journal of Northeast Forestry University.-2003 , 31(3).-31～ 33
Contents of free amino acids , sugar s , pro teins , POD and CAT activities , POD bands in flower buds and anther were
compared between L ilium regale and its male sterility mutants lines.Results showed that the contents of free amino
acids , proline , reducing sugar and protein of both two male sterility lines were lower than those o f L.regale from the
early pollen mo ther cell stage and meiosis metaphase I to tetrad-uninucleate stage.Flow er buds POD activities of bo th
tw o male sterility lines w ere higher than those of L .regale , anther to tal sugar contents and flower buds CAT activities
w ere almost similar to those of L.regale.At meiosis metaphase I , male sterility mutant lines exhibited more 2～ 3 POD
bands than that of L.regale , and some bands displayed deeper color than those of L.regale.Changes o f these matter
contents , enzyme activities and enzyme bands might be related to the genera tion of pollen abortion.
Key words　Lilium regale;Male sterility;Amino acids;Sugars;Proteins;POD isozyme
　　雄性不育在农业生产上具有巨大的经济价值 , 人们设法
通过各种育种措施获得雄性不育种质 , 并从各个方面研究雄
性败育的机理 ,以便反过来指导雄性不育育种。雄性不育基
因表达 ,先在生物化学或生物物理水平发生变化 , 继而产生超
微结构 、亚显微及显微结构的变化 , 最终导致形态学水平的变
化 ,产生雄性不育。可见生化变化是呈上启下的重要一环 ,对
阐明败育机理有重要意义。人们对农作物雄性败育的生化机
理研究得较多。常常从酶系统 、物质及能量代射系统 、激素系
统的变化进行研究。如酶系统研究方面:在结球白菜[ 1] 、萝
卜[ 2] 、榨菜[ 3]等作物雄性不育研究中发现 , 不育与可育系过
氧化物同功酶存在着差异;在水稻[ 4]和小麦[ 5 , 6]的雄性不育
研究中 ,发现不育花药的 CAT 活性降低。 物质代谢研究方
面 ,在辣椒[ 7] 、烟草[ 8] 、小麦[ 9] 、大白菜[ 10]等作物雄性不育研
究中发现 ,不育性花药中氨基酸代谢异常 , 尤其是游离脯氨酸
的亏损 ,使新陈代谢紊乱;在水稻[ 11] 、玉米[ 12]和棉花[ 13]中发
现雄性不育花药碳水化合物或蛋白质合成与代谢降低。另外
在能量代谢系统 、激素系统变化方面都有较多的研究。
百合是一种深受人们喜欢的重要观赏植物。但其花粉量
大 ,花粉色素多 , 粘着力强 ,易产生花粉污染 , 给装饰应用带来
不便。因此 ,培育出雄性不育百合 ,减少花粉污染 , 已成为百
合的一个重要育种目标。 1998 ～ 2002 年间北京农学院和中
国农科院蔬菜花卉所合作 ,辐射王百合种球 , 从辐射鳞片扦插
产生的后代中发现雄性不育单株`白天使 、` 金王二号 , 经
第一作者简介:张克中 ,男 , 1968年 10月生 ,北京农学院园林系 ,
讲师。
收稿日期:2002年 11月 5日。
责任编辑:李金荣。
DNA鉴定为真突变体 , 然后通过鳞片扦插形成无性系。本试
验分析了王百合及其两个雄性不育系花药及花蕾的某些生化
变化。旨在从生理生化角度阐明雄性不育系的败育机理。
1　材料与方法
分别在花粉母细胞初期阶段(a)、减数分裂中期 I 阶段
(b)、四分体—单核期阶段(c), 取王百合及不育系`白天使
`金王二号 花蕾或花药 , 进行如下生理生化测定:3 , 5-二硝
基水杨酸比色法测花药中糖含量[ 14] ;日立-8835 氨基酸自
动分析仪测花药游离氨基酸含量;考马斯亮蓝 G-250 法测
花药蛋白质含量[ 14] ;愈创木酚比色法测花蕾 POD活性[ 15] ;
碘量法测花蕾 CAT 酶活性[ 16] 。聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析
减数分裂中期 I花药 POD酶谱[ 15] 。
2　结果与分析
2.1　王百合及其雄性不育突变体游离氨基酸含量分析
2.1.1　游离氨基酸总量的动态变化　游离氨基酸总量的动态
变化(见图1)表明:从花粉母细胞初期到四分体—单核期王百合
游离氨基酸总量一直呈上升趋势 ,可见随着小孢子的发育, 氨基
酸营养供应也逐渐增多。但是 2个雄性不育系`白天使 、` 金王
二号 游离氨基酸的含量明显低于王百合, 在花粉母细胞初期为
低值;在减数分裂中期 I上升到最高;在四分体—单核期又有所
下降,与同期王百合花药游离氨基酸含量差距加大。
2.1.2　游离氨基酸的种类及其含量的变化　比较各种氨基
酸的含量可以看出:在王百合及其两个雄性不育突变体中 , 脯
氨酸 、精氨酸 、苏氨酸 、丙氨酸 、谷氨酸 、蛋氨酸的含量较高 , 其
中以脯氨酸 、精氨酸含量最高。如在花粉母细胞初期 、减数分
DOI :10.13759/j.cnki.dlxb.2003.03.011
裂中期 I、四分体—单核期 ,王百合花药中脯氨酸含量分别占
游离总氨基酸含量的 24.06%、26.18%、27.31%, 精氨酸分
别占 21.11%、13.79%、13.05%, 其中胱氨酸 、亮氨酸 、酪氨
酸含量最低。
图 1　王百合及其雄性不育突变体无性系各种游离氨基酸含量的变化(DW)
注:□指“王百合” ;○指“白天使” ;△指“金王二号”
　　脯氨酸(Pro)的变化:从花粉母细胞初期到四分体—单核
期王百合脯氨酸含量一直呈上升趋势 , 但两个雄性不育突变
体花药中脯氨酸含量变化 ,则表现出“低—高—低”的变化规律。
特别是在四分体—单核期 ,两不育系花药脯氨酸急剧下降 ,与同
期王百合相比表现出明显亏缺。在花粉母细胞发育初期,王百合
花药脯氨酸含量分别高出` 白天使 、` 金王二号 188.71%和 124.
69%;减数分裂中期 I,分别高出 88.67%和 77.03%;四分体—单
核期 ,分别高出 507.80%和 298.83%。四分体—单核期正是小
孢子发育和形成的关键时期 ,此期两不育系花药脯氨酸含量却比
可育系低 3～ 5 倍,表现出亏缺。研究认为脯氨酸的亏缺对于` 白
天使 、` 金王二号 雄性不育的产生至关重要。
精氨酸(Arg)、谷氨酸(Glu)的变化:精氨酸是含量第二多
的氨基酸 ,在花药发育的各阶段 , 王百合花药精氨酸含量都高
于不育系。其中花粉母细胞初期 , 王百合精氨酸含量分别高
出` 白天使 、` 金王二号 101.28%、63.54%;减数分裂中期 I ,
分别高出 187.07%、93.60%;四分体—单核期分别高出 119.
08%、58.57%。谷氨酸也是含量较多的一种氨基酸 , 其含量
可育系略低于不育系。精氨酸 、谷氨酸含量的峰值都出现在
花粉母细胞初期 ,随后陡降 , 至减数分裂中期 I 降至最低 , 随
后微升。含量的陡降期恰好是脯氨酸的陡升期。
苏氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、蛋氨酸(Met)的变化:这 3 种
氨基酸含量中等 , 含量在 1.0 ～ 4.0 mg/ g。但都是可育系含
量大于不育系。这 3 种氨基酸与脯氨酸 、精氨酸共同作用 ,对
王百合游离氨基酸总量高于两不育系起主要作用。
赖氨酸(Lys)、丝氨酸(Ser)、缬氨酸(Val)、苯丙氨酸
(Phe)、异亮氨酸(Ile)、组氨酸(His)及苷氨酸(Gly)的变化:这
7 种氨基酸含量较少 , 在 1.5 mg/g 以下(图略), 其中丝氨酸 、
异亮氨酸 、组氨酸在花粉母细胞初期 、减数分裂中期 I可育系
含量高于两不育系 , 在四分体—单核期出现至少有一个不育
系高于可育系含量的现象。其中缬氨酸 、苯丙氨酸 、苷氨酸的
含量都是可育系含量低 , 不育系含量高 ,并且从花粉母细胞初
期至四分体—单核期大致呈升高的趋势 ,这是雄性不育系不
能充分利用这些氨基酸的结果。
光氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、亮氨酸(Leu)及天门冬氨酸
(Asp)的变化:光氨酸 、酪氨酸、亮氨酸的含量极低 ,不育系与可育
系含量差异不明显。天门冬氨酸在王百合中含量也较低, 在 0.
34～ 0.43 mg/g。但两不育系在各阶段都未检测出。说明天门冬
氨酸与王百合及其雄性不育系的不育性的表达有一定关系。
2.2　糖含量及蛋白质含量的变化
从花粉母细胞初期到四分体—单核期 , 花药总糖含量呈
“低—高—低”的变化规律, 但各阶段不育系的总糖含量与王百
合相差不大(见图 2);而还原糖的含量不育系显著低于可育
系 ,其变化趋势是:王百合一直呈上升趋势 ,`白天使 呈`低—
高—低 变化趋势,`金王二号 呈略微下降趋势(见图 2);不育
系的蛋白质含量都明显低于可育系 ,王百合蛋白质含量一直呈
上升趋势 ,两不育系则呈“低—高—低”变化规律(见图 2)。
2.3　POD、CAT 酶活性与 POD 酶谱
花蕾中 POD活性(鲜质量), 两不育系都高于王百合(见
图 2)。在同一材料中 , 花粉母细胞初期 、减数分裂中期 I 至四
分体—单核期的 POD活性变化不大。 CAT 活性表现为减数
分裂中期 I最高 , 花粉母细胞初期及四分体—单核期较低(图
略), 不育系与可育系各阶段花蕾的 CAT 活性无显著差异。
说明两个雄性不育系雄性不育的形成与 POD 酶活性变化密
切相关 , 与 CAT 酶活性关系不大。
图 2　花药糖 、蛋白质含量变化及花蕾 POD 活性变化
注:□指“王百合” ;○指“白天使” ;△指“金王二号”
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　　减数分裂中期 I 花药中过氧化物同功酶酶谱(见图 3)分
析表明:`白天使 比王百合多 A1 、A2、A5、B3 四条酶带 ,少 A3
一条酶带 ,且`白天使 酶带 B1 、B2 比王百合深;`金王二号
比王百合多A2、A5、B3 三条酶带 ,少 A4 一条酶带 , 且` 金王二
号 酶带 B1、B2 比王百合深。
图 3　减数分裂中期 I 王百合及其雄性不育突变体花药过氧化物酶酶
谱
注:A区迁移率(R f)A1:0.68, A2:0.65 , A3:0.58 , A4:0.48 , A5:0.45;B
区迁移率(R f)B1:0.37, B2:0.27 , B3:0.18
3　讨论
植物雄性不育基因在表达中包括一系列的物质和能量代
谢 ,涉及各种复杂的生化反应 , 对雄性不育的生化指标进行研
究 ,对深入了解雄性不育的调控机制具有重要意义。
游离氨基酸在小孢子发育过程中具有重要的生理功能。
其中 , 研究得最多的是脯氨酸 , 脯氨酸是花器官中含量最多 ,
也是花粉形成与发育最需要的氨基酸 , 不育花药中游离脯氨
酸含量的降低 ,可能会使花粉的正常发育受阻 。研究发现 ,百
合雄性不育脯氨酸含量降低的结果与其它作物雄性不育的研
究结果类似[ 7 ～ 10] 。
脯氨酸 、精氨酸 、谷氨酸的碳主键皆为 5 个碳 , 3 种氨基
酸都为α-酮戊二酸衍生类型氨基酸 , 能相互转换。其中精
氨酸可裂解成多胺或经鸟氨酸和 P-C-5 或 P-2-C 转化
成脯氨酸 ,这一途径已在植物中得到证实[ 17] 。谷氨酸也可能
转化成脯氨酸[ 9] 。在花药发育的过程中 , 王百合及雄性不育
突变体花药中脯氨酸的陡升期 ,正好出现在精氨酸 、谷氨酸的
陡降期。这暗示着花药中脯氨酸的富集可能部分来源于精氨
酸和谷氨酸。王百合及其雄性不育突变体的雄性发育不仅和
花药脯氨酸的变化有关 , 而且与花药内氨基酸代谢的全过程
有关 ,其机制有待进一步研究。
还原糖是糖的转化和运输形式 , 其含量的高低是呼吸作
用强弱的反应。雄性不育花药中还原糖含量较低 , 说明呼吸
作用低 , ATP 生成少 ,花药代谢的能量供应少。
一般认为植物生殖生长过程需要有旺盛的蛋白质代谢 ,
否则生殖器官的发育将走向异常 , 而雄性器官对此反应更敏
感。本试验中也发现王百合的两个雄性不育系的蛋白质含量
低于可育系 ,此与前人研究农作物雄性不育发现的蛋白质含
量降低的情况类似[ 11 ～ 13] 。
在研究中发现 ,王百合与其 2 个雄性不育系的过氧化物
酶谱有差异 ,而且后两者的过氧化物酶活性高于前者。在个
体发育过程中 , 同功酶谱带具有高度的特异性 , 该特异性可能
会反映出不育基因与可育基因表达形式的差异。 POD酶活
性的强化与提高 ,将导致花药内源 IAA 的氧化分解 , 从而影
响小孢子正常发育所必需的营养物质的合成与运输 , 导致小
孢子败育。
CAT(过氧化氢酶)被认为是一种保护性酶 ,协助 SOD清
除体内活性氧 ,许多学者[ 4 ～ 6]发现雄性不育花药中 CAT 酶活
性显著低于可育花药 ,从而不能有效地清除超氧离子集团, 使
H2O2大量积累 ,致使膜脂过氧化作用加剧而产生败育。本文
的试验却发现雄性不育系与可育系 CAT 活性没有显著差异 ,
说明在清除活性氧作用方面 , 王百合与其不育系没有差别。
总之 ,由于雄性不育基因的作用 ,致使两雄性不育系物质
代谢系统失调 , 表现在 POD 活性比可育系强 , 游离氨基酸总
量 、游离脯氨酸 、还原糖、蛋白质含量比可育系显著降低 , 从而
引起小孢子正常发育所必需的营养物质的缺乏 ,导致小孢子败
育。
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