全 文 ：第 4 2 卷第 6 期 江 苏 林 业 科 技 Vol ． 4 2 No ． 6
2 0 1 5 年 1 2 月 Journal of Jiangsu Forestry Science ＆ Technology Dec ． 2 0 1 5
文章编号:1001 － 7380(2015)06 － 0019 － 04
紫娇花组织培养中愈伤组织的诱导及植株再生
何月秋1，2，黄 艾1，李 波2
(1．宁波城市职业技术学院，浙江 宁波 315100;2．江苏碧云天科技有限公司，江苏 丹阳 212300)
收稿日期:2015-08-14;修回日期:2015-08-28
基金项目:浙江省宁波科技局双创项目(2012C91027) ;江苏省丹阳市高层次创新人才引进项目
作者简介:何月秋(1975 － ) ，女，四川大邑人，副教授，研究方向:植物组织培养。E-mail:heyueqiu@ nbcc． cn。
摘要:紫娇花种子经灭菌处理后，于试管内培养基中萌发，取幼苗的下胚轴、子叶，进行愈伤组织的诱导、不定芽的
分化及试管苗生根技术的研究。结果显示，紫娇花种子最佳灭菌方式为 0. 1%升汞浸泡 10 min，污染率可控制在
37. 0%，萌芽率达到 86. 3%;愈伤组织最适诱导部位为下胚轴，愈伤组织诱导最佳培养基为 MS + 0. 2 mg /L 6 － BA
+ 2. 0 mg /L 2，4 － D，诱导率达到 83． 7%;紫娇花不定芽分化的最适培养基为 MS + 1. 0 mg /L 6 － BA + 0. 2 mg /L
NAA，不定芽分化率为 48. 0%;最适生根培养基为 1 /4 MS + 0. 1 mg /L NAA + 0. 5% AC，生根率可接近 100%。
关键词:紫娇花;种子;下胚轴;子叶;愈伤组织;诱导;植株再生
中图分类号:Q949. 71 + 8. 25 文献标志码:A doi:10． 3969 / j． issn． 1001 － 7380． 2015． 06． 005
Callus induction and plant regeneration in Tulbaghia violacea in vitro culture
HE Yue-qiu1，2，HUANG Ai1，LI Bo2
(1． Ningbo College of Vocational Technology，Ningbo 315100，China;
2． Jiangsu Biyuntian Science ＆ Technology Limited Company，Danyang 212300，China)
Abstract:Taking the hypocotyl and cotyledon excised from the aseptic plantlets of Tulbaghia violacea as explants，a plant
regeneration protocol was developed about callus induction，adventitious bud differentiation，root formation． The results
showed that the optimal sterilization method was 0. 1% HgCl2 treatment for 10 min，with 37. 0% pollution rate and 86. 3%
germination rate． For hypocotyl as optimal explant，the optimal callus inducing medium was MS with 2. 0 mg /L 2，4 － D +
0. 2 mg /L 6 － BA，with 83. 7% induction rate． Adventitious buds were effectively generated on MS with 1. 0 mg /L 6 － BA
+0. 2 mg /L NAA，with 48. 0% differentiation rate． Roots were formed from the shoots on 1 /4 MS supplemented with 0. 1
mg /L NAA after 20 d，with the rooting rate almost reaching 100% ．
Key words:Tulbaghia violacea;Seed;Hypocotyl;Cotyledon;Callus;Induction;Plant regeneration
紫娇花(Tulbaghia violacea)是一种重要的地被
植物，别名野蒜或非洲小百合，原产地为南非，为石蒜
科紫娇花属多年生常绿草本植物。紫娇花花紫色，观
赏价值高，同时紫娇花对土壤要求不高，耐热，耐贫
瘠，易于栽培管理，近年来在园林绿化中应用广泛。
紫娇花以分株繁殖和播种繁殖方式为主，但其增殖系
数低，增殖周期长，难以满足生产需求。植物织培养
技术是大量快速繁殖紫娇花的有效途径，紫娇花的组
织培养研究较少，何月秋等［1］以花蕾为外植体，通过
诱导小鳞球进而获得了紫娇花的试管苗，但实验中发
现，最佳诱导期的花蕾难以采集，且花蕾的诱期需要
3个月，因此，为了拓展外植体来源，建立高效的紫娇
花组织培养体系。本试验研究了种子灭菌、芽诱导与
生根等培养条件，建立了紫娇花完整的植株再生体
系，大大缩短了培养时间，降低了成本，为紫娇花规模
化生产提供了科学依据。
1 材料与方法
1． 1 材料
材料为采自宁波城市职业技术学院溪口校区的
紫娇花当年生自然风干种子，无菌下胚轴、子叶取自
种子萌发出的无菌苗。
1． 2 方法
1． 2． 1 种子灭菌 挑选发育成熟健康的种子，纱布
包裹用洗涤精搓洗干净，自来水清洗，置于超净工作
台上，用 75%乙醇浸泡并振荡 30 s，并用无菌水冲
洗 3 次后，0. 1% HgCl2分别振荡灭菌 5，8，10，12
min，每次灭菌后均用无菌水冲洗 3 ～ 5 遍。将灭菌
处理后的种子接种于不添加植物生长调节剂的 1 /2
MS培养基上，处理 30 粒种子，重复 3 次。30 d后统
计污染率和萌发率。
1． 2． 2 愈伤组织诱导 将种子萌发的无菌胚轴、子
叶剪成 5 mm × 5 mm左右小块，接种于 6 － BA(0. 1，
0. 2，0. 5 mg /L)、2，4 － D(1. 0，1. 5，2. 0 mg /L)的 2 因
素 3水平完全试验培养基中。每处理 20个外植体，重
复 3次。30 d后统计 2种外植体愈伤组织的诱导率。
1． 2． 3 不定芽分化与增殖 诱导出的愈伤组织转
接到添加了 6 － BA(0. 5，1. 0，2. 0 mg /L)、NAA
(0. 1，0. 2，0. 3 mg /L)的 2 因素 3 水平完全试验培
养基中。每处理 20 个外植体，重复 3 次。30 d后观
察生长情况。
1． 2． 4 生根培养及移栽 丛生芽长到高 2 ～ 3 cm
时将其切成单芽转接到添加有 0. 5%AC，基本培养基
为 1 /2 MS，1 /4 MS，1 /8 MS，NAA(0，0. 05，0. 1 mg /
L)的生根培养基上培养，待炼苗后进行驯化移栽。
1． 3 培养条件
以上培养基中除生根阶段蔗糖浓度为 1. 5%
外，其他阶段蔗糖均为 3%，琼脂为 0. 7%，pH 值调
制 5. 8。培养室内控制恒温(25 ± 1)℃，光照为 40
μmol /(m2·s) ，光照时间为每天 14 h。
1． 4 数据采集与分析方法
污染率 =污染种子数 /种子总数 × 100%;萌发
率 =萌发种子数 /种子总数 × 100%;诱导率 =诱导
出愈伤组织的外植体数 /外植体总数 × 100%;不定
芽分化系数 = 诱导出的丛生芽数 /外植体总数 ×
100%;有效芽长 ＞ 1. 0 cm。数据采用平均值 ±标准
差(SD)表示，采用 SPSS17． 0统计软件对数据进行统计
和单因子方差分析，配方之间培养结果采用 Duncans
新复极差方法(SSR，P ＜0. 05)测验差异显著性。
2 结果与分析
2． 1 不同灭菌方式对紫娇花种子萌发率与污染率
的影响
灭菌后的种子接种于 1 /2 MS 培养基上，3 d 后
开始出现污染，15 d 后不再有污染出现。种子接种
20 d开始萌发，萌发时间主要集中在接种后的
20 ～ 30 d。培养 30 d统计的污染率和萌发率见表 l。
可以看出，不同处理之间差异显著，污染率随着处理
时间的增长而下降，而种子萌发率则呈下降趋势。
HgCl2处理 5 min 萌发率最高，达到 93. 3%，但污染
率也最高，达到 66. 0%;处理 12 min污染率最低，为
19. 0%，萌发率仅有 76. 7%。进一步分析表明，
HgCl2处理 5 ～ 10 min，紫娇花种子萌发率差异不显
著，但污染率差异显著。综合考虑污染率和萌发率，
HgCl2处理 10 min是最佳的灭菌时间。
表 1 不同灭菌方法对外植体的影响
消毒时间 /min 接种粒数 /颗 污染率 /% 萌发率 /%
5 30 66． 0 ± 3． 6 a 93． 3 ± 3． 8 a
8 30 48． 3 ± 5． 0 b 89． 7 ± 2． 5 ab
10 30 37． 0 ± 4． 0 c 86． 3 ± 1． 5 b
12 30 19． 0 ± 2． 6 d 76． 7 ± 1． 5 c
同列不同字母代表处理间存在显著性差异(P ＜ 0． 05)。
2． 2 不同植物生长调节剂配比对愈伤组织诱导的
影响
待紫娇花种子萌发后，截取下胚轴和子叶接种
到愈伤组织诱导培养基中。接种 20 d 后大部分胚
轴开始褪绿，切口处膨大增厚，30 d 开始脱分化形
成乳白色的愈伤组织。少部分子叶在接种 20 d 左
右开始膨大，少量子叶产生绿色颗粒状组织，但无进
一步分化。由表 2 可知，紫娇花子叶愈伤组织诱导
率很低，最高只有 9. 6%，且 9 个配方中差异不明
显，这说明紫娇花子叶非常难脱分化;以下胚轴为外
植体材料较易诱导愈伤组织的形成，在试验组合 9
种配方中最低诱导率为 38. 0%，最高可达到
85. 0%，诱导率随着植物生长调节剂的用量逐渐升
高。其中，配方 MS + 2 mg /L 2，4 － D + 0. 2 mg /L
6 － BA，MS +2 mg /L 2，4 － D + 0. 5 mg /L 6 － BA 诱
导率最高，分别为 83. 7%和 85. 0%，进一步数据分
析表明，2 者无显著性差异，考虑植物生长调节剂用
量的控制，MS +2 mg /L 2，4 － D +0. 2 mg /L 6 － BA
是紫娇花下胚轴愈伤组织诱导较佳的配方。
2． 3 不同植物生长调节剂配比对不定芽分化的
影响
紫娇花愈伤组织在原来培养基中只能继续增
殖，不能进一步分化，需改变培养条件。将诱导形成
的愈伤组织转移至添加有 NAA 和 6 － BA 的 MS 培
养基中进行不定芽的分化培养。10 d 后愈伤组织
逐渐变绿，并形成圆球状，20 d后先长出 1 片子叶再
逐渐形成不定芽。试验用 9 种培养基中，不定芽的
02 江 苏 林 业 科 技 第 42 卷
分化率最高为 48. 0%，最低也可达到 13. 0%。由表
3 可知，不定芽的分化率随着 6 － BA 用量的增加而
有所升高，进一步分析表明 MS + 0. 1 mg /L NAA +
2. 0 mg /L 6 － BA不定芽分化率最高，与其他配方有
显著差异(P ＜ 0. 05)。该配方诱导形成的不定芽叶
色嫩绿，生长旺盛，结合不定芽的生长情况，MS +
0. 1 mg /L NAA + 2. 0 mg /L 6 － BA 是较为适宜的
不定芽分化培养基。
表 2 不同外源激素配比对愈伤组织诱导的影响
组合
2，4 － D /
(mg /L)
6 － BA /
(mg /L) 子叶诱导率 /% 胚轴诱导率 /%
1 1． 0 0． 1 1． 3 ± 0． 25 e 38． 0 ± 2． 6 e
2 1． 0 0． 2 2． 4 ± 0． 32 ef 39． 7 ± 2． 5 e
3 1． 0 0． 5 3． 2 ± 0． 25 d 52． 7 ± 2． 5 d
4 1． 5 0． 1 2． 1 ± 0． 20 ef 62． 7 ± 3． 1 c
5 1． 5 0． 2 5． 0 ± 0． 45 c 64． 7 ± 4． 2 c
6 1． 5 0． 5 6． 3 ± 0． 45 b 66． 0 ± 3． 6 c
7 2． 0 0． 1 5． 1 ± 0． 36 c 74． 3 ± 3． 8 b
8 2． 0 0． 2 9． 2 ± 1． 45 a 83． 7 ± 3． 2 a
9 2． 0 0． 5 9． 6 ± 1． 04 a 85． 0 ± 5． 0 a
同列不同字母代表处理间存在显著性差异(P ＜ 0． 05)。
表 3 不同外源激素配比对不定芽分化的影响
组合 NAA /(mg /L) 6 － BA /(mg /L) 分化率 /%
1 0. 1 0. 5 13. 0 ± 2. 0 g
2 0. 1 1. 0 16. 7 ± 1. 2 f
3 0. 1 2. 0 48. 0 ± 4. 4 a
4 0. 2 0. 5 30. 0 ± 2. 0 c
5 0. 2 1. 0 43. 04 ± 2. 6 b
6 0. 2 2. 0 33. 0 ± 1. 0 c
7 0. 3 0. 5 26. 0 ± 1. 0 d
8 0. 3 1. 0 21. 0 ± 1. 0 e
9 0. 3 2. 0 21. 7 ± 1. 5 e
同列不同字母代表处理间存在显著性差异(P ＜ 0． 05)。
2． 4 紫娇花组培苗的生根培养
选取生长健壮，株高 2. 5 ～ 3 cm 的紫娇花组
培进行生根培养。由表 4 可知，紫娇花组培苗在
无外源植物生长调节剂的培养基中生根率即可
达到 50%，单独添加 NAA 后其生根率明显上升，
生根率均超过 90%，且当 NAA 质量浓度为 0. 1
mg /L时紫娇花组培苗的生根率可达 100%。统
计分析表明，当 NAA 为 0. 1 mg /L 时，尽管基本
培养 基 不 相 同 但 其 生 根 率 无 显 著 差 异
(P ＜ 0. 05)。观察表明，紫娇花组培苗在 1 /2
MS，1 /4 MS 基本培养基中可形成健壮的再生植
株，而 1 /8 MS 基本培养基中再生植株则比较细
弱。综合考虑，1 /4 MS + 0. 1 mg /L NAA 时生根
诱导率可达 99. 2%，为最佳的生根诱导培养基。
表 4 基本培养基和 NAA对紫娇花不定芽生根的影响
组合 基本培养基 NAA /(mg /L) 生根率 /% 根生长情况
1 1 /2 MS 0. 0 50. 2 ± 0. 8 d 苗壮，根粗
2 1 /2 MS 0. 05 91. 0 ± 2. 0 c 苗壮，根粗
3 1 /2 MS 0. 1 99. 5 ± 0. 5 a 苗壮，根粗
4 1 /4 MS 0. 0 51. 2 ± 0. 8 d 苗壮，根粗
5 1 /4 MS 0. 05 95. 2 ± 3. 9 b 苗壮，根粗
6 1 /4 MS 0. 1 99. 2 ± 0. 7 a 苗壮，根粗
7 1 /8 MS 0. 0 51. 8 ± 1. 4 d 苗细弱，根细长
8 1 /8 MS 0. 05 94. 5 ± 1. 0 b 苗细弱，根细长
9 1 /8 MS 0. 1 99. 5 ± 0. 6 a 苗细弱，根细长
同列不同字母代表处理间存在显著性差异(P ＜ 0． 05)。
3 结论与讨论
3． 1 紫娇花种子灭菌
无菌体系的建立是植物组织培养成功的关键。
其中，外植体种类、取材部位和灭菌方法是影响无菌
体系建立的重要因素。自然条件下，植物外植体带有
较多的细菌和真菌，进行组织培养时需对其进行灭
菌，但要求尽量保持组织材料完好无损保持生活力，
使其在适宜的条件下迅速生长和增殖［2 － 3］。一般而
言，不同的植物材料或同一植物材料的不同部位灭菌
的方法差异很大。要想获得满意的无菌材料，需要根
据实际的情况采用相应的药剂和处理时间。对于种
子的灭菌方式，戴萍等［4］用 0. 1%的 HgCl2浸泡中国
石蒜的种子 15 min污染率只有 5%，且可达到 85%的
存活率;赵健等［5］用 75%乙醇浸泡华北落叶松种子
3 min后，转入 0. 1%的 HgCl2浸泡 10 min 为最佳方
式;宁梦雅等［6］用 5%次氯酸钠珍珠菜种子 10 min时
其污染率只有 7. 5%，但萌发率只有 15%。本试实验
采用 75%乙醇浸泡30 s和 0. 1%HgCl2浸泡 10 min的
方法，既可以较好的控制紫娇花种子的污染也可以保
证较高的萌发率。
3． 2 紫娇花愈伤组织诱导
愈伤组织是指人工培养基上由外植体脱分化形
成的一团无序生长的薄壁细胞，在适当培养条件下可
分化形成不定芽，也可形成体胚。大量研究表明，植
物组织培养中愈伤组织的诱导与植物生长调节剂的
种类、浓度、相关配比和处理时间关系密切。下胚轴
将来发育成根茎的部位，分化程度低［7］，通常难以形
成愈伤组织。2，4 － D 或 NAA 常常用来诱导外植体
的愈伤组织，应用广泛［8］，同时多数需要与 6 － BA配
合。百脉根［9］、萝卜［10］、甜瓜“黄醉仙”［11］、西洋
参［12］、北柴胡［13］等植物的下胚轴在一定质量浓度的
2，4 － D或 NAA 与一定质量浓度的 6 － BA 或 KT 的
12第 6 期 何月秋等:紫娇花组织培养中愈伤组织的诱导及植株再生
配合下诱导出高频率的愈伤组织。本试验采用 MS +
0. 2 mg /L 6 － BA +2. 0 mg /L 2，4 － D，可以获得下胚
轴 83. 7%，而子叶能获得的愈伤组织更低，最高只有
9. 4%，且很难分化成不定芽，这说明搞清紫娇花子叶
脱分化条件还需要更深入的研究。
3． 3 紫娇花不定芽的分化
组织培养中生长素配合细胞分裂素能诱导不定
芽的分化。愈伤组织不定芽分化培养中，不同植物生
长调节剂质量浓度组合作用不同，其比例尤为重要。
牡丹愈伤组织分化在 6 － BA/NAA 质量浓度比例为
2∶ 1时分化比例达到最大值(4. 7%) ，而比例为10∶ 1则
不能分化，换为 0. 25 mg /L 2，4 － D +0. 5 mg /L TDZ，
其最高诱导率可达到 30. 5%［14］;而单独添加 8 mg /L
6 － BA则可使红掌叶片愈伤组织则分化出不定芽［15］。
本试验中，紫娇花下胚轴愈伤组织在 1. 0 mg /L 6 －
BA和 0. 2 mg /L NAA作用下可分化出不定芽。
3． 4 紫娇花组培苗生根
生根是组织培养的重要环节，高质量的根系是高
移栽成活率的保证。一般在生根阶段需要调整基本
培养基并添加生长素 NAA或 IBA。不同植物组织培
养苗生根的难易不一，蓝靛果组织培养苗在单独添加
1. 0 mg /L IBA 的改良 MS 培养基中生根率可达到
100%［16］;在红掌组织培养苗生根培养中，IBA是重要
的影响因子［17］，本试验中1 /4 MS +0. 1 mg /L NAA +
0. 5%AC可以获得近 100%的生根率。
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