全 文 ：　第 29卷第 12期 分析试验室 Vol.29.No.12
2010年 12月 ChineseJournalofAnalysisLaboratory 2010-12
液相色谱 -串联质谱法测定虾夷扇贝
和长牡蛎中软骨藻酸的残留
陈燕清 1 , 陈舜胜1 , 于慧娟＊ 2 , 蔡友琼 2 , 惠芸华2
(1.上海海洋大学食品学院 , 上海 201306;2.农业部水产品质量监督检验测试中心 , 上海 200090)
摘　要:建立了液相色谱-串联质谱测定虾夷扇贝和长牡蛎中贝类毒素软骨藻酸
残留的检测方法。样品经 50%甲醇提取 , LC-SAX柱净化 , 3mL0.1mol/L甲酸溶
液洗脱 , 电喷雾离子源(ESI), 在正离子 、 多反应监测方式(MRM)模式下进行定
性与定量 , 定性离子对为 m/z311.98/265.91, m/z311.98/247.9, m/z311.98/
192.91, 以 m/z311.98/265.91为定量离子对 , 外标法定量。结果表明 , 方法的
检测限为 0.01μg/g, 定量限为 0.02μg/g。在 0.02 ～ 10μg/mL范围内线性相关
系数为 0.9999。当添加软骨藻酸质量分数为 20 ～ 1000 ng/g时 , 虾夷扇贝样品中
软骨藻酸的平均回收率为 81.3%～ 105.4%, RSD为 3.9%～ 8.9%(n=6);长牡
蛎样品中软骨藻酸的平均回收率为 83.5%～ 106.6%, RSD为 4.6%～ 6.4%
(n=6)。方法满足对贝类产品中软骨藻酸残留的测定。
关键词:虾夷扇贝;长牡蛎;软骨藻酸;液相色谱串联质谱;多反应监测
中图分类号:O657.63　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-0720(2010)12-021-04
　　记忆缺失性贝类毒素是一种强烈的神经毒
性物质 , 因可导致记忆功能的长久性损害而得
名 , 其主要成分是软骨藻酸 [ 1-2] 。为了防止记忆
缺失性贝类毒素中毒事件发生 , 加拿大首先制
定了软骨藻酸在贝类样品中的最大残留限量 [ 3] ,
随后 , 欧洲 、 日本也相继对该种毒素进行监控 ,
并设定可耐受最高摄入量(MRL)值 。
软骨藻酸的检测方法主要有小鼠生物测定
法 [ 5] 、毛细管电泳法[ 6] 、 高效液相色谱法 [ 7 -8]以
及高效液相色谱-飞行时间质谱法等 [ 9-13] 。其中
小鼠生物法检测限过高(40 μg/g);液相色谱 -荧
光法需采用的柱后衍生荧光检测技术 , 必须严格
控制条件才能获得理想的结果;高效液相色谱 -飞
行时间质谱法的检测低限(LOQ)为 0.1 μg/g。本
实验通过质谱条件的优化和样品前处理的研究 ,
建立了一种准确度好 , 灵敏度高和适用性强的液
相色谱-串联质谱测定记忆缺失性贝类毒素的方
法 , 对提高我国水产品质量安全检测及海洋环境
监测技术具有重要意义。
1　实验部分
1.1　仪器与试剂
ThermoTSQQuantumAccess液相色谱 -串联四
极杆质谱仪 , 配有 ThermoSurveyor型液相色谱
仪 、 自动进样器 、 电喷雾离子源(美国应用生物
系统公司);固相萃取装置 (美国 Supelco公司);
AnkeDL-5-B离心机 (上海湘仪离心机厂 );
500mg/3mLLC-SAX固相萃取柱(北京艾杰尔)。
标准 物质 软 骨藻 酸 (纯 度 90%, Sigma
Chemical, Co.);甲醇 、 乙腈为色谱纯 (美国
Sigma公司);甲酸和甲酸铵为分析纯。
1.2　溶液配制
软骨藻酸标准储备液:将 5 mg的软骨藻酸用
乙腈(1 +9)溶解 , 并定容至 25 mL棕色容量瓶
中 , 此液质量浓度为 180 μg/mL。 4 ℃冷藏保存
—21—
＊ 收稿日期:2010-03-12;修订日期:2010-04-16
基金项目:农业部标准制修订项目(11273)资助
作者简介:陈燕清(1985-), 女 , 硕士研究生;E-mail:cherry850318@yahoo.com.cn
DOI :10.13595/j.cnki.issn1000-0720.2010.0326
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可使用 6个月。
1.3　实验方法
1.3.1　制样　实验用的贝类于 2009年 2 ～ 9月采
自山东青岛沿海 。鲜活样品运至实验室后用水冲
洗干净 , 撬开贝壳后取其贝肉 , 沥干水分 , 然后
进行匀浆处理 , 四分法制样后保存于 -20 ℃低温
冰箱中备用 。
1.3.2　样品前处理　提取取 5.00 g均质样品于
50 mL加盖的离心管中 , 加入 12 mL甲醇 (1+
1)溶液 , 旋转混匀 5 min, 超声波提取 10 min,
以 10000 r/min, 5 ℃离心 10min, 使得固液两相
彻底分离 , 移出上清液至 25 mL容量瓶中 , 残
渣再加入 5 mL甲醇(1+1)溶液重复提取 2次 ,
上清液合并至 25 mL容量瓶中 , 以水定容至
刻度 。
取上述粗提取液 5.0 mL移入依次经 6 mL甲
醇 , 3 mL水 , 3mL甲醇(1+1)溶液活化的 SAX
固相萃取柱中 , 待液体以 2 d/s的速度流出后 ,
再依次用 5 mL乙腈 (1 +1)溶液 , 0.5 mL
0.1mol/L甲酸溶液淋洗固相萃取柱 , 弃去流出
液 , 最后用 3mL0.1 mol/L甲酸溶液洗脱吸附在
柱上的软骨藻酸 , 供 LC-MS/MS测定 。
1.3.3　液相色谱 -串联质谱测定　色谱条件　色
谱柱:SHISEIDOMG-C18柱 (2.1 mm×100 mm);
进样量:25 μL;柱温:30℃;流动相:A:甲
醇 , B:0.02%甲酸 +2mmol/L甲酸铵溶液;梯
度洗脱条件:0 ～ 2min, 20%A;2.01 ～ 7 min,
10% A;7.01 ～ 7.51 min, 20% A; 7.51 ～
15.0 min, 20%A;流速为 0.35 mL/min。
质谱条件　离子化模式为 +ESI, 质谱分辨
率为单位分辨率 , 电喷雾电压(IS)为 +4500 V,
辅气压力为 69 kPa, 离子源温度 (TEM)为
300℃,鞘气压力为 207 kPa, 源内碰撞诱解离电
压为 8 V, 其它条件见表 1。
表 1　软骨藻酸(DA)的参考保留时间和优化质谱条件
Tab.1　LCreferenceretentiontimeandoptimizedparametersofMS-M SconditionsforDA
化合物 参考保留时间 t/min 母离子 /(m/z)子离子 /(m/z)
碰撞能量
E/v
相对丰度比 ＊
/%
软骨藻酸 4.67 311.98 192.9 19 16.58
软骨藻酸 4.67 311.98 247.9 17 23.18
软骨藻酸 4.67 311.98 265.9＊＊ 17 100
　　＊:定性离子的峰面积与定量离子的峰面积之比;＊＊:为定量离子。
2　结果与讨论
2.1　样品前处理方法
2.1.1　提取剂的选择 　研究了不同配比甲醇 -水
对贝类中软骨藻酸的提取效率 , 用纯甲醇提取会
导致样品中蛋白质的沉淀 , 使软骨藻酸被沉淀包
裹而不能释放到提取液中 , 降低了回收率;而用
纯水提取则导致大量水溶性杂质 , 一并提取出来 ,
致使提取液混浊 , 过柱困难。参考方晓明[ 11]等的
方法 , 本文选用了甲醇(1 +1)溶液作为提取液 ,
经添加回收实验表明 , 此提取液提取效率高可达
到 90%以上。
2.1.2　LC-SAX固相萃取柱净化效果　取均质后
阴性长牡蛎样品 5 g于 50 mL加盖的离心管中 ,
加入 5 μg软骨藻酸标样 , 放置 15 min, 按
1.3.1节方法进行前处理 。从 25 mL提取液中取
出 5mL, 分别用 Cleanert(100mg/mL)、 Cleanert
(500 mg/3mL)、 Supelclean(500 mg/3 mL)固相
萃取柱处理 , 然后用 3 mL0.1 mol/L甲酸洗脱 。
从表 2可以看出:Cleanert(500 mg/3 mL)固
相萃取柱净化效果好 , 回收率大于 95%;而用
Cleanert(100mg/mL)固相萃取柱净化时 , 由于柱
容量小导致回收率较低 , 不能满足毒素检测的要
求;还有用 Supelclean(500mg/3 mL)固相萃取柱
净化也不是非常理想 , 回收率偏低 。因而选择
Cleanert(500mg/3mL)固相萃取柱 。
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表 2　三种 DApurifiedonLC-SAX固相萃取柱净化软骨藻酸实验结果
Tab.2　ExperimentalresultsofDApurifiedonthreeLC-SAXsolidphaseextractioncolumn(n=4)
萃取柱 加标量 w/(μg/g) 测定值 w/(μg/g) 回收率 /%
Cleanert(100mg/mL) 1.00 0.452 45.2
Cleanert(500 mg/3 mL) 1.00 0.978 97.8
Supelclean(500 mg/3 mL) 1.00 0.885 88.5
2.1.2　洗脱剂用量　实验分别采用 1, 3, 5 mL
0.1mol/L甲酸对吸附有被测物的固相萃取柱进行
洗脱 , 实验结果表明 3mL0.1mol/L甲酸溶液可以
将软骨藻酸洗脱下来 , 洗脱效率达到 95%以上 ,
因此洗脱剂 0.1mol/L甲酸的最佳用量为 3mL。
2.2　质谱条件的优化及软骨藻酸断裂机理
用蠕动泵进样的方式对 1 μg/mL的软骨藻酸
标准溶液在正离子模式下进行全扫描 , 确定软骨
藻酸的 [ M+1] +峰。以软骨藻酸的分子离子峰为
母离子 , 对离子源参数进行优化 , 使仪器测定的
灵敏度达到最高 。然后对软骨藻酸进行二级质谱
优化 , 通过碰撞能量和碎片离子的优化 , 确定了
软骨藻酸多反应检测的条件。从二级质谱优化实
验得知 , 软骨藻酸主要产生 3个碎片离子 , m/z
分别为 265.9、 247.9和 192.9, 其中 m/z265.9
相对丰度最高 , 本底无干扰 , 因此将其作为定量
离子 , 其它作为定性离子 。
根据软骨藻酸分子结构式特点 , 通过对软骨
藻酸所产生的离子碎片分析 , 推断软骨藻酸分子
的断裂方式为:首先是开环 , 然后再脱去环上的
-COOH、 -H2O和 -CH3COOH的同时发生分子
内重排 , 形成了 3个碎片离子(图 1)。
图 1　软骨藻酸断裂产生的碎片离子
Fig.1　Fragmentionsofdomoicacid
2.3　方法评价
2.3.1　回收率 、精密度和灵敏度　选用阴性扇贝
和牡蛎空白样品各 24份作为方法考察材料 , 按
1.3节的方法进行不同浓度软骨藻酸加标回收实
验 , 测定结果见表 3。
从表 3可以看出 , 本方法在四个添加水平下 ,
虾夷扇贝样品中软骨藻酸的平均回收率为 87.3%～
105.4%, 相对标准偏差(RSD)为 3.9% ～ 8.9%;
长牡蛎样品中软骨藻酸的平均回收率为 83.5%～
106.6%, 相对标准偏差(RSD)为 4.6% ～ 6.4%。
表 3　方法的回收率与相对标准偏差
Tab.3　Recoveriesandrelativestandarddeviations
ofDAinblankshellfishsamples(n=6)
样品 加标量 w/(μg/g) 回收率 /% RSD/%
虾夷扇贝
0.02 81.3 3.9
0.05 95.2 5.7
0.50 96.6 6.4
1.00 105.4 8.9
长牡蛎
0.02 83.5 4.6
0.05 88.8 4.4
0.50 97.7 3.6
1.00 106.6 6.4
从质谱图可以看出 , 在保留时间 4.67min时 ,
空白牡蛎样品没有干扰 , 故而三对离子对都可以作
为定量离子对 , 但是由于考虑到灵敏度的影响 , 故
而选用相对丰度最高的离子对m/z311.98/265.91
作为定量离子对。
2.3.2　方法灵敏度和线性范围　由实验数据算得
方法的检测限为 0.01μg/g, 定量限为 0.02μg/g。
配置一系列软骨藻酸标准溶液 , 按 1.3.3节的
条件进行分析 , 以软骨藻酸浓度为横坐标 , 以其峰
面积为纵坐标 , 进行回归分析 , 由实验结果得知软
骨藻酸在 10 ～ 1000ng/mL范围浓度与峰面积呈良
好的线性关系 , 线性相关系数为 0.9999。回归方程
为 Y=-11219.2+1002.35ρ(μg/L)。
2.4　样品分析
对采自山东沿海的虾夷扇贝 、 紫贻贝 、 长牡
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蛎 、 菲律宾蛤仔 、毛蚶等贝类样品 , 每个品种选了
4个样品 , 按 1.2和 1.3方法进行软骨藻酸残留的
测定 , 测定结果为虾夷扇贝 、紫贻贝 、菲律宾蛤
仔 、 毛蚶这四种贝类样品均未检出有软骨藻酸 , 而
长牡蛎 4个样品中有 1个检出有软骨藻酸 , 残留量
(0.01μg/g)。
参考文献
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Thedeterminationofresidueofdomoicacidbyhighperformanceliquidchromatography-tandemmass
spectrometryinpatinopectenyessoensisandcrassostreagigas
CHENYan-qing1 , CHENShun-sheng1 , YUHui-juan＊2 , CAIYou-qiong2 andHUIYun-hua2(1.ColegeofFood
Science, ShanghaiOceanUniversity, Shanghai201306;2.MinistryofAgricultureSupervisionandTestingCenter
forAquaticProducts, Shanghai200090), FenxiShiyanshi, 2010, 29(12):21 ～ 24
Abstract:Inthisstudy, ahigh-performanceliquidchromatography-tandemmassspectrometricmethodwas
establishedforthedeterminationofresidueofdomoicacidinshelfish.Thesamplewasextractedby50%
methanol, purifiedonaLC-SAXcolumn, elutedwith3mLof0.1 mol/Lformicacid, andqualitativelyand
quantitativelydeterminedbyelectrosprayionization(ESI)ionsource, inthepositiveion, multiplereaction
monitoringmode(MRM), qualitativeionpairsofm/z311.98/265.91, m/z311.98 /247.9, m/z311.98/
192.91, andm/z311.98/265.91 alsoforquantitativeion, withexternalstandardmethod.Theresultshowed
thatthelimitofdetection(LOD)andquantitation(LOQ)were0.01μg/gand0.02μg/g.Thecalibrationcurves
showedgoodlinearityforDAintherangesof20 ～ 10 μg/mL, andthecorelativecoeficientwas0.9999.At
spikedlevelof20 ～ 1000 ng/gforDA, averagerecoveriesofDAinthePatinopectenyessonensissampleswere
81.3%～ 105.4%, andRSDswere3.9%～ 8.9%(n=6);averagerecoveriesofDAintheCrassostreagigas
sampleswere83.5%～ 106.6%, andRSDswere4.6%～ 6.4%(n=6).Themethodwasreliableandsensitive
forthedeterminationofdomoicacidresidueinshelfish.
Keywords:Patinopectenyessoensis;Crasostreagigas;domoicacid;high-performanceliquidchromatography-
tandemmasspectrometry;multiplereactionmonitoring
—24—