全 文 ：收稿日期:2012 － 05 － 14 修回日期:2012 － 10 － 09
基金项目:公益性行业(农业部)科研专项(200903030)．
作者简介:刘一萌(1987 －) ，男，硕士研究生．研究方向:海藻增养殖． Email:lym0410@ gmail． com．通讯作者马家海(1940 －) ，男，教授．研究
方向:水产植物种苗工程与增养殖． Email:jhma@ shou． edu． cn．
福建坛紫菜赤腐病的病程及病原鉴定
刘一萌，马家海，文 茜
(上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306)
摘要:于 2011 年 10 月 － 2012 年 2 月，对福建省福鼎市、霞浦县、泉州市和晋江市等海区发生的坛紫菜腐烂病害进行了研
究．通过观察发病特征以及镜检，详细记录了该病害的侵染过程，并在发病组织中观察到双鞭毛游动孢子以及孢子囊、雄器
和藏卵器等重要结构特征，病菌形态与条斑紫菜上的紫菜腐霉相似;利用半海水玉米琼脂培养基分离提纯该病菌，命名为
FM1．经感染试验证实，FM1 引起的发病症状与自然海区患病紫菜的症状一致，说明 FM1 为致病菌．通过扩增该菌核糖体
DNA ITS序列，并构建基于 ITS + 5．8S序列的 N-J 系统发育树，结果显示 FM1 菌株与紫菜腐霉的 ITS 区相似度很高，达到
99% ．综合形态学及 ITS序列分析确定，紫菜腐霉是导致此次病烂的主要病原菌，该病原菌引起的病害称为“赤腐病”．
关键词:坛紫菜;赤腐病;紫菜腐霉;ITS
中图分类号:S946．2 + 1 文献标识码:A 文章编号:1671-5470(2013)01-0018-05
Infection process and pathogen identification of red rot disease
in Porphyra haitanensis from Fujian
LIU Yi-meng，MA Jia-hai，WEN Qian
(College of Fisheries and Life，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China)
Abstract:Different samples of Porphyra haitanensis were collected from Fuding，Xiapu，Quanzhou and Jinjiang areas respectively
in Fujian Province from October，2011 to February，2012． The development and characteristics of disease were recorded，and bi-
flagellate zoospores，sporangium，antheridium and archegonium were found． The results of observation indicated that the symptoms
of rot on Porphyra haitanensis thalli was similar to Pythilum porphyrae on Porphyra yezoensis． The mycelia strain FM1 was isolated
from diseased thalli and maintained on corn-meal seawater agar (CMSA)． The artificial infection experiment displayed that the ex-
perimental thalli was rotten like the thalli collected from the sea field，which meant strain FM1 was pathogen． According to analysis
of the ITS rDNA (contained 5．8S) ，strain FM1 was highly similar to Pythilum porphyrae (99%)． Combining morphology with mo-
lecular methods，this study revealed that Pythilum porphyrae was the pathogen which caused the rot of Porphyra haitanensis，the dis-
ease was called red rot disease．
Key words:Porphyra haitanensis;red rot disease;Pythilum porphyrae;ITS
坛紫菜(Porphyra haitanensis)作为我国特有种［1］，是我国产量最高的紫菜栽培种．但是，随着海区环境
的恶化，紫菜病害的暴发越来越频繁，其中，紫菜赤腐病(red rot disease)是危害严重又经常发生的病害之
一．紫菜赤腐病是由紫菜腐霉(Pythilum porphyrae)感染引起的真菌性病害．国外最先在条斑紫菜(Porphyra
yezoensis)上研究该菌，将该菌分类于腐霉菌科的腐霉属(Pythilum)［2］，并定名为 Pythilum porphyrae［3］;而
有关坛紫菜赤腐病的研究较少，且多见于其病害的防治．
紫菜腐霉在分类学上的分类阶元为卵菌门(Oomycota)卵菌纲(Oomycetes)霜霉目(Peronosporates)腐
霉科(Pythiaceae)腐霉属［4］．腐霉属隶属卵菌门，该属菌种分布广泛，我国发现的腐霉种有 56 种［5］．腐霉属
真菌可存在于土壤以及水环境中，多数为致病菌［6］，如瓜果腐霉引起的黄瓜猝倒病［7］等，会给农业生产造
成严重损失，部分可使动物甚至人类产生疾病［8］．
腐霉菌的分类鉴定主要依靠形态学方法［9］，但由于腐霉一些重要的形态结构不稳定，给形态学鉴定
带来了困难．因此，分子生物学方法逐渐成为腐霉菌鉴定的重要手段［10］．本研究以 2011 年 10 月 － 2012 年
福建农林大学学报(自然科学版) 第 42 卷 第 1 期
Journal of Fujian Agriculture and Forestry University (Natural Science Edition) 2013 年 1 月
DOI:10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2013.01.019
2 月在福建省部分坛紫菜栽培海区采集到的患有病烂的坛紫菜为研究对象，以形态学鉴定为基础，结合转
录内间隔区(internal transcribed spacer，ITS)序列，对坛紫菜赤腐病的病原菌进行分离鉴定，为赤腐病的防
治提供理论依据．
1 材料与方法
1．1 材料来源
坛紫菜样品取自福建省福鼎市、霞浦县、泉州市和晋江市等坛紫菜栽培海区，经阴干后低温条件下迅
速带回实验室．
1．2 病症检查方法
将培养的患有病烂的坛紫菜或冰箱中保存的坛紫菜用海水复苏培养后，切取患病部位叶片组织，利用
显微镜 Olympus Bh41、相机 MicroPublisher 5．0 RTV，观察病症部位，并记录病症特征．
1．3 腐霉菌丝的分离、纯化
配制半海水玉米琼脂培养基(corn-meal seawater agar，CMSA)［11］:玉米粒 20 g，琼脂 18 g，蒸馏水 500 mL，
海水 500 mL．取 1 cm2 患病部位的坛紫菜叶片，用消毒毛笔在灭菌海水中反复刷洗 3 次，并置于装有灭菌
海水的三角烧瓶中，120 r·min －1震荡 5 －10 min，如此反复 2 次后，将叶片平铺于 CMSA上． 25 ℃培养 5 d，
可见腐霉菌丝伸展，用打孔器抠取含菌丝的培养基，并置于新鲜培养基上，反复提纯 3 次，将得到的菌丝体
命名为 FM1．
1．4 菌丝体扩大培养
配制半海水玉米液体培养基，刮取一小块经纯化的腐霉菌丝块置于液体培养基中，20 ℃、120 r·min －1
震荡培养 3 d，可见菌团生成．
1．5 人工感染试验
用分离纯化获得的菌丝体对健康坛紫菜叶状体进行感染试验，并置于光照培养箱内充气培养．培养条
件:水温 15 ℃，盐度为 26．9，光照度 48．07 － 64．10 μmol·m －2·s － 1，光周期 10L∶ 14D．每 3 d添加 1 次 PES
培养液，添加量为水体积的 2% ．
1．6 核糖体 DNA(rDNA)ITS序列分析
1．6．1 样品收集与处理 将菌丝体在半海水玉米液体培养基中培养 7 d 后，用 3 层医用无菌纱布滤出菌
丝体，并用无菌半海水清洗 3 次，再用无菌滤纸过滤并收集菌丝体．经干燥处理后，置于离心管中，－ 20 ℃
保存备用．
1．6．2 DNA制备及目标序列获取 DNA 制备方法参照 Park et al［12］，并略做改动．称取 0．01 g 菌体置于
液氮中研磨成粉末，并转移到离心管中．加入 1 mL CTAB 提取缓冲液(2% CTAB，0．1 mol·L －1 Tris-HCl
pH 8．0，0．05 mol·L －1 EDTA pH 8．0，1．4 mol·L －1 NaCl，0．2% β-巯基乙醇) ，65 ℃温浴 30 min 后，加入
1 /2 体积氯仿 /异戊醇(24∶ 1) ，65 ℃温浴 30 min，15 ℃、12000 r·min －1离心 15 min．将上清液转移至新管
中，加入 1 /10 CTAB和等体积异丙醇，4 ℃、12000 r·min －1离心 15 min，待 DNA沉降后，用 70%乙醇洗涤
1 － 2 次，在无菌风下吹干或室温干燥，溶于 1 × TE溶液中，－ 20 ℃保存备用．
PCR扩增采用真核生物核糖体基因 ITS 序列，包含 5．8S 序列，引物序列为 ITS1(5-TCCTCCGCTTAT-
TATATGC-3)、ITS2(5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAA GG-3)．反应条件:95 ℃变性 1 min，55 ℃退火 0．5 min，
72 ℃延伸 1 min，共 30 个循环，反应前 95 ℃预变性 1 min，循环结束后 72 ℃延伸 5 min．将 PCR产物经 1%
琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色后，用紫外光检测．引物合成、扩增产物纯化及测序由生工生物工程(上
海)有限公司完成．
1．6．3 数据分析 采用 Bioedit和 ClustalX (Ver 1．83) ，分别对样品 ITS + 5．8S序列进行编辑和对齐．通过
NCBI软件进行 BLAST同源性比对，其他序列均来自 GenBank．应用软件 MEGA 4．1 以邻接法构建系统发
育树，自举检验值 1000 次检验节点置信度．
·91·第 1 期 刘一萌等:福建坛紫菜赤腐病的病程及病原鉴定
2 结果与分析
2．1 病烂症状
坛紫菜叶片上有不同大小的病斑，直径为 1 mm － 3 cm，呈圆形或椭圆形．随着病情的发展，斑点逐渐
扩大，相互连接，形成大的斑块．病斑初期为紫红色或铁锈红色，与周围健康紫菜区别较明显，之后病斑由
中心至周围逐渐变成绿色或黄绿色，有时可见绿色病斑部位带有红色水泡(图 1A) ，水泡多呈圆形，大小
在 1 － 8 mm．紫菜离水后不久，水泡便会破碎，流出红色液体，露出绿色或浅绿色病斑，这些病斑随即溃烂
成孔洞，此过程仅需 5 － 7 d．溃烂后，孔洞边缘的叶片依然呈紫红色(图 1B) ，其周围的正常紫菜叶片在随
后几天也转为紫红色．
A．患有赤腐病的坛紫菜(箭头示红色水泡) ;B．赤腐病病斑及呈紫红色的病斑边缘;C．正常坛紫菜细胞;D．被感染的紫菜细胞伸出菌丝
侵染临近细胞;E．腐霉菌丝生长侵染更多的细胞;F．腐霉菌丝侵染形成的病斑;G．被多根菌丝穿透的细胞(箭头所示) ，菌丝无隔膜;
H．老旧菌丝存在隔膜(箭头所示) ;I．菌丝体内有颗粒物;J．藻红素呈桃红色针状或块状结晶析出;K．被菌丝体穿透的紫菜细胞
呈绿色;L．紫菜细胞破裂，菌丝体外露;M．紫菜细胞内形成的孢子囊(箭头所示) ;N．游动孢子(箭头示游动孢子鞭毛) ;
O．游动孢子附着在紫菜叶片表面;P．游动孢子侵染坛紫菜(箭头示菌体伸出的萌发管) ;Q．藏卵器与雄器(箭头示雄器)．
图 1 紫菜腐霉侵染过程
Fig． 1 The life cycle of Pythium porphyrae
·02· 福建农林大学学报(自然科学版) 第 42 卷
2．2 镜检结果
镜检发现，在正常紫菜被感染过程中，起初仅有 1 个细胞被菌体感染，与正常紫菜细胞(图 1C)相比，
被感染的细胞萎缩，颜色加深，并伸出菌丝侵染临近的细胞(图 1D) ，菌丝体逐渐伸长，侵染下一个细胞，
且菌丝体上会形成分枝，加速了侵染速度(图 1E) ，逐渐在该部位形成病斑(图 1F)．被穿透的紫菜细胞死
亡并萎缩为原来体积的 1 /3，甚至更小，颜色呈深红色．随着病情发展，菌丝体穿透的紫菜细胞发生腐烂，
有时可看到腐烂的紫菜细胞周围伴有桃红色针状或块状的藻红素结晶析出，色泽由深红色逐渐变为绿色
或黄绿色(图 1G － K)．最后，细胞内容物消失，只残留细胞壁，并逐渐溃烂形成孔洞．在绿色病斑处，部分
被菌丝体穿透的紫菜细胞破裂，菌丝体外露(图 1L)．
菌丝体无色透明或半透明，一般无隔膜，部分老旧的菌丝体内有隔膜(图 1G － H) ，一般无颗粒，少数
有颗粒存在(图 1I) ，直径为 1．2 － 3．5 μm．同一条菌丝体上，伸出的端菌丝较细．最初，紫菜细胞可被 1 条
菌丝体贯穿，随着病情的蔓延，有时可见被 3 － 5 条菌丝贯穿的现象(图 1G)．菌丝体穿入紫菜细胞后，其末
端在紫菜细胞间膨大形成球囊，并将紫菜细胞排挤到一侧(图 1M) ，该球囊直径为 12．5 － 18．0 μm，为孢子
囊，该球囊内起初可见絮状填充物，之后发育成淡青色颗粒，为游动孢子．游动孢子呈肾脏状，大小为(2．0
－ 3．5)μm ×(6．0 － 9．0)μm，在其腹部有一纵沟，从该纵沟分别向前、后各伸出 1 条鞭毛，2 条鞭毛长度相
同(图 1N)．游动孢子释放后，遇到紫菜便会附着在其表面，呈圆形，鞭毛随之消失(图 1O)．孢子附着后很快
萌发出萌发管，侵染紫菜细胞(图 1P)．部分菌丝体穿入紫菜细胞后，可在细胞内膨大成一球状囊体(图 1Q) ，
呈淡青色，直径为 15 － 20 μm．此为菌丝体的有性繁殖器，即藏卵器(oogonium) ，其外侧有一无色弯曲的半
球体，即雄器(antheridium) ，大小为(2．0 － 3．5)μm ×(5．5 － 7．0)μm，菌丝体受精后便发育成一个不动的
厚壁卵孢子(oospores)．
2．3 感染结果
分离纯化得到的 FM1 菌株感染健康坛紫菜后，坛紫菜叶片有菌丝体出现，被菌丝体穿透的坛紫菜细
胞死亡并萎缩，表现出典型的赤腐病症状，与自然海区的病菜症状一致．
2．4 ITS系统发育分析
经 PCR扩增，FM1 菌株的序列全长为 870 bp，用 Blast 软件将该序列与 NCBI 中登记的 ITS + 5．8S 序
列进行同源性比对，结果表明其与腐霉属同源性较高，达到 98% － 99% ．以疫霉属(Phytophthora)为外群，
将该菌与腐霉属其他种以 ITS + 5．8S序列构建 N-J系统发育树(图 2)．结果显示，FM1 菌株与 Pythium por-
phyrae(紫菜腐霉)聚为一类．
图 2 基于 ITS构建的 N-J系统发育树
Fig． 2 N-J phylogenetic tree based on rDNA-ITS sequence analysis
3 讨论
本研究采集到的患有病烂的坛紫菜中，由菌丝穿透紫菜细胞，致使紫菜细胞死亡并萎缩的发病症状、
发病进程，与条斑紫菜赤腐病［7］相符，引起该病害的病菌菌丝有无性生殖和有性生殖 2 种方式．无性生殖
·12·第 1 期 刘一萌等:福建坛紫菜赤腐病的病程及病原鉴定
通过菌丝形成孢子囊，孢子囊内产生双鞭毛游动孢子进行;有性生殖通过雄器和藏卵器之间的配合进行，
并产生不动的厚壁有性孢子，即卵孢子，卵孢子在藏卵器内发育成熟，一个藏卵器内仅含有一个卵球，发育
后形成一个卵孢子．卵孢子厚壁的抗逆性结构可保护卵孢子抵抗不良环境条件．本研究中，分离菌的孢子
囊、游动孢子、雄器和藏卵器等结构，与日本水产学会［13］描述的引起条斑紫菜赤腐病的紫菜腐霉结构相同．
因 rDNA在进化过程中保守性强，被应用于大部分生物的分类和鉴别中，其中，rDNA ITS 是目前腐霉
属菌种分类研究最常用的区域．本研究中，ITS 序列分析显示，样品 FM1 与 Pythium porphyrae(GenBank 登
录号分别为 HQ643753．1、AB043506．1、AB185111．1)聚为一类． 因此，根据菌株孢子囊、游动孢子、雄器和
藏卵器等结构的特点，以及序列分析结果，将该菌株鉴定为紫菜腐霉，由腐霉菌丝穿透紫菜细胞引起的病
害确定为赤腐病．
坛紫菜赤腐病在各个沿海地方曾有不同的名称．黄海水产研究所紫菜组［14］提到的红泡烂和洞烂、福
建省水产局［15］描述的红泡病，以及王忠民［16］提及的红泡病(俗称铁钉锈斑)的病状与本文描述的赤腐病
相同．中国科学院海洋研究所［1］曾提到，我国紫菜栽培过程中，俗称的红泡病，从病状和发病条件，以及显
微镜观察到的菌丝等与日本描述的赤腐病一致．浙江省水产局［17］也指出，从病症和菌丝贯穿细胞情况比
较分析，福建的红泡烂、浙江的洞烂、江苏的烂菜与赤腐病相似，此病在我国坛紫菜和条斑紫菜栽培中都有
局部或大面积发生．紫菜发生赤腐病时，病斑处的紫菜细胞被腐霉菌丝体穿透而死亡、萎缩，藻红素等随即
溶出，并滞留在紫菜细胞间．随着菌丝体贯穿细胞数量的增多，越来越多的藻红素等物质溶出并在细胞间
累积，致使紫菜表面病斑处叶片隆起，形成红色的水泡．因此，“红泡病”或“红泡烂”即为“赤腐病”．
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(责任编辑:杨郁霞)
·22· 福建农林大学学报(自然科学版) 第 42 卷