全 文 ：　
第４６卷　第７期　
２０１６年７月
中 国 海 洋 大 学 学 报
ＰＥＲＩＯＤＩＣＡＬ　ＯＦ　ＯＣＥＡＮ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　ＯＦ　ＣＨＩＮＡ
４６（７）：０２７～０３４
Ｊｕｌｙ，２０１６
一株紫菜腐霉的鉴定及其对条斑紫菜的致病性
李淑芬１，莫照兰２，孔凡娜１，朱　明３，茅云翔１
（１．中国海洋大学海洋生命学院遗传与育种实验室，山东 青岛２６６００３；２．中国水产科学研究院黄海水产研究所，农业部海洋渔业
可持续发展重点实验室，山东 青岛２６６０７１；３．江苏连云港龙源生物科技有限公司，江苏 连云港２２２０００）
摘　要：　ＮＢＲＣ３３２５３为日本 ＮＩＴＥ生物资源中心的保藏菌株，分离自患赤腐病的紫菜。为鉴定其特征及致病性，对
ＮＢＲＣ３３２５３进行形态学观察和分子鉴定，检测温度和盐度对其生长的影响，并在不同温度、盐度、感染浓度下检测
ＮＢＲＣ３３２５３对条斑紫菜的致病性。研究显示：ＮＢＲＣ３３２５３具有腐霉属的典型特征：在半海水玉米粉固体培养基表面和培
养基内生长良好，菌丝发达、有横隔，可形成丝状孢子囊、球形藏卵器、凹形雄器。ＩＴＳ序列分析证实其为紫菜腐霉（Ｐｙｔｈｒｉｕｍ
ｐｏｒｐｈｙｒａｅ）。生长实验发现，该菌在温度１６～３６℃、盐度１０～４０范围内生长良好，其最适生长温度为２８℃、最适生长盐度
为２０。人工感染实验显示，该菌可引起条斑紫菜的赤腐病病征，在较高温度（１８～２３℃）、较低盐度（２４～２９）、较高病原浓
度（０．１～１．０ｍｇ／ｍＬ）下最容易发生赤腐病。研究结果表明，ＮＢＲＣ３３２５３可引起条斑紫菜腐霉病。本研究为进一步了解
紫菜腐霉的致病机理和抗病紫菜品系的筛选提供了材料。
关键词：　紫菜腐霉；鉴定；条斑紫菜；致病性；赤腐病
中图法分类号：　Ｑ９３９．９５　　　文献标志码：　Ａ　　　文章编号：　１６７２－５１７４（２０１６）０７－０２７－０８
ＤＯＩ：　１０．１６４４１／ｊ．ｃｎｋｉ．ｈｄｘｂ．２０１５０１２１
引用格式：　李淑芬，莫照兰，孔凡娜，等．一株紫菜腐霉的鉴定及其对条斑紫菜的致病性［Ｊ］．中国海洋大学学报（自然科
学版），２０１６，４６（７）：２７－３４．
ＬＩ　Ｓｈｕ－Ｆｅｎ，ＭＯ　Ｚｈａｏ－Ｌａｎ，ＫＯＮＧ　Ｆａｎ－Ｎａ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｐｙｔｈｒｉｕｍ　ｐｏｒｐｈｙｒａｅ　ｓｔｒａｉｎ　ｃａｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｒｅｄ　ｒｏｔ　ｄｉｓｅａｓｅ
ｏｆ　Ｐｏｒｐｈｙｒａ　ｙｅｚｏｅｎｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｅｒｉｏｄｉｃａｌ　ｏｆ　Ｏｃｅａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ，２０１６，４６（７）：２７－３４．
　 　基金项目：国家高技术研究发展计划项目（２０１２ＡＡ１０Ａ４０６，２０１２ＡＡ１０Ａ４０１，２０１２ＡＡ１００８１５）；国家自然科学基金项目（３１３７２５１７）；山东省自
主创新项目（２０１３ＣＸＣ８０２０２）资助
Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ　ｂｙ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｈｉｇｈ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｐｒｏｇｒａｍ（２０１２ＡＡ１０Ａ４０６，２０１２ＡＡ１０Ａ４０１，２０１２ＡＡ１００８１５）；
Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ（３１３７２５１７）；Ｓｐｅｃｉａｌ　Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｈａｎｄｏｎｇ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ（２０１３ＣＸＣ８０２０２）
收稿日期：２０１５－０４－０９；修订日期：２０１５－１２－２５
作者简介：李淑芬（１９８７－），女，硕士生。Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｓｈｕｆｅｎ８８８＠１２６．ｃｏｍ
　　通讯作者：Ｅ－ｍａｉｌ：ｍｏｚｌ＠ｙｓｆｒｉ．ａｃ．ｃｎ
　　中国紫菜养殖产量居世界第一位，２０１４年中国渔
业年鉴资料显示，２０１３年条斑紫菜（Ｐｙｒｏｐｉａ　ｙｅｚｏｅｎ－
ｓｉｓ）和坛紫菜（Ｐｏｒｐｈｙｒａ　ｈａｉｔａｎｅｎｓｉｓ）产量１１．２３万ｔ
（干品），产值超过２０亿元人民币。多年来紫菜病害时
常发生，导致紫菜质量下降甚至绝产，造成严重的经济
损失。紫菜的丝状体和叶状体阶段均有多种疾病发
生，常见的紫菜丝状体病害有泥红病、绿变病、鲨皮病
等［１］；叶状体常见的病害有赤腐病、拟油壶病、绿斑病、
缩曲症、癌肿病等［２］。赤腐病是危害条斑紫菜养殖最
严重一种疾病，该病最早于１９４７年在日本发现［３］，在
１９７０年证实病原为紫菜腐霉（Ｐｙｔｈｉｕｍ　ｐｏｒｐｈｙｒａｅ）［４］，
之后在韩国、美国和中国相继发现该病［５］。１９９６年在
中国江苏条斑紫菜养殖海区首次报道赤腐病［６］，最近
在福建坛紫菜也发现了该病［７］。国内学者对相关病原
的侵染过程和发病条件进行了研究［６－８］，但目前尚无有
效的方法预防赤腐病的发生。筛选抗病紫菜品系被认
为是抵抗赤腐病的一种有效的方法。本实验室正开展
紫菜赤腐病流行病学调查，拟对不同地方来源的病原
株开展生理、致病性、遗传等方面的研究。ＮＢＲＣ３３２５３
为日本 ＮＩＴＥ生物资源中心的保藏菌株，分离自患赤
腐病的紫菜，但其鉴定特征和致病性尚不明确。本研
究对ＮＢＲＣ３３２５３进行了形态和分子鉴定、生长特性及
致病性研究，旨在为深入了解紫菜腐霉致病机理、制定
疾病防治措施、培育抗病紫菜品系提供病原真菌研究
材料。
１　材料和方法
１．１藻株和菌株
条斑紫菜ＰＹ４－７株（来源于中国海洋大学海洋生命
学院遗传与育种实验室）培养于ＰＥＳ［９］，培养条件为：温
度１５℃，盐度２８～２９，光照强度６２．５μｍｏｌ／（ｍ
２·ｓ），光
暗周期１２Ｌ∶１２Ｄ，充气培养，每３天换一次培养基，生
长和形态无异常的紫菜用于后续实验。ＮＢＲＣ３３２５３
（购自于日本生物资源库）的固体培养用半海水玉米粉
中　国　海　洋　大　学　学　报 ２　０　１　６年
琼脂培养基（ＣＭＭ）［３］，２２℃；液体培养用谷氨酸钠液
体培养基［８］，２０℃１００ｒ／ｍｉｎ摇床。
１．２ＮＢＲＣ３３２５３的形态观察
ＮＢＲＣ３３２５３在ＣＭＭ 培养１０ｄ后，用打孔器（口
径８ｍｍ）在菌落边缘扣取１块含有菌丝的培养基转接
至新的ＣＭＭ进行培养，每天肉眼观察ＮＢＲＣ３３２５３的
生长情况，并在光学显微镜（Ｏｌｙｍｐｕｓ　ＣＸ３１，日本）下
观察菌丝的形态。
１．３ＩＴＳ序列扩增和系统发育学分析
收集 ＮＢＲＣ３３２５３菌丝用于基因组ＤＮＡ提取［９］，
作为模板用于ＰＣＲ扩增ＩＴＳ序列，按照文献［１１］提供
的引物和方法进行ＰＣＲ扩增。所得ＰＣＲ产物送上海
华大进行测序，测序结果在 ＧｅｎＢａｎｋ中进行ＢＬＡＳＴ
同源性比对，从ＧｅｎＢａｎｋ获取其他相关菌的ＩＴＳ序列。
采用ＣｌｕｓｔａｌＷ软件进行多序列比对，应用 Ｍｅｇａ５．３软
件采用邻接法（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ）构建系统发育树，模
型为Ｋｉｍｕｒａ　２－ｐａｒａｍｅｔｅ，并以自展法（Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ）进行
各分支的置信度检验，共循环１　０００次［７］。
１．４温度和盐度对ＮＢＲＣ３３２５３生长的影响
ＮＢＲＣ３３２５３在ＣＭＭ 固体培养基上生长５ｄ后，
收集菌丝体用灭菌海水冲洗３次，用灭菌吸水纸吸干
后称湿重，将１ｍｇ的菌丝转接到２００ｍＬ谷氨酸钠液
体培养基（ｐＨ＝７．５）。进行温度实验时，设置温度范围
为４～３６℃，盐度为１８；进行盐度实验时，设置盐度范
围为５～５０，培养温度为２０℃。每个实验组设置３个
平行。培养７ｄ后收集菌丝，测量每个实验组的菌丝体
重量。用ＳＰＳＳ１６．０对各温度水平间和各盐度水平间
进行显著性差异分析，两水平间的Ｐ＜０．０５为显著性
差异。
１．５人工感染实验及组织病理观察
ＮＢＲＣ３３２５３在谷氨酸钠液体培养基（ｐＨ＝７．５）培
养７ｄ，收集菌丝称重置于装有２００ｍＬ灭菌海水的锥
形瓶中，制成终浓度为１．０ｍｇ／ｍＬ的菌丝体悬液。在
每个含有菌丝体悬液的锥形瓶中放入５张健康条斑紫
菜成体，每张长度１０～１２ｃｍ、宽度３～４ｃｍ；设置无添
加菌丝的实验组为对照组。每组实验设置３个重复。
所有实验组置于光照培养箱中培养，培养温度１５℃，
每天肉眼观察紫菜发病情况，切取患病部位叶片进行
常规制片，在光学显微镜下进行组织病理观察，同时取
患病叶片进行病原的分离培养、形态观察、ＩＴＳ序列分
析，以验证分离菌株是否为ＮＢＲＣ３３２５３。
１．６环境因子对感染效果的影响
在实验室条件下研究不同温度、盐度、感染浓度
（ＮＢＲＣ３３２５３菌丝重量）对感染程度的影响，实验体系
同１．５，温度设８、１３、１８和２３℃，盐度设２４、２９、３４和
３９，感染浓度为１．０、０．５、０．１和０．０１ｍｇ／Ｌ。进行不同
温度实验时，设置盐度为２８，腐霉浓度为０．５ｍｇ／ｍＬ；
进行不同盐度实验时，设置温度为１５℃，腐霉浓度为
０．５ｍｇ／ｍＬ；进行不同浓度实验时，设置温度为１５℃，
盐度为２８。每个处理组均设置不加腐霉菌丝的实验组
为对照，各个处理组和对照组设置３个平行。实验期
间，每天观察紫菜发病情况，以肉眼可观察到红色斑点
为疾病发生时间，一周后用叶面积仪（Ｙａｘｉｎ－１２４，北京
雅欣仪科有限公司）计算紫菜页片病斑面积占总紫菜
叶片面积的百分比。
２　结果
２．１ＮＢＲＣ３３２５３的生长及形态特征
ＮＢＲＣ３３２５３在ＣＭＭ 固体培养基上表现为菌丝
衍生到培养基内生长，在整个培养期内呈乳白色。培
养前期的菌落形状平滑，培养至５ｄ左右，有的菌落出
现放射型或兼平滑型和放射型（见图１Ａ，平滑型）；培
养至１０ｄ左右，菌落在培养基内布满整个培养皿，培养
基表面有数量极少的隆起的菌丝。
在显微镜下观察，菌丝在培养基表面无特定形态，
分枝发达。培养前期的菌丝无色、无隔，培养７ｄ左右
菌丝出现横隔有隔并呈淡黄色（见图１Ｂ）。无性生殖期
间，可观察到在菌丝体的顶端或中间产生长筒状的游
动孢子囊（见图１Ｃ），孢子囊伸长形成排孢管，顶端膨大
成近球形的泡囊，孢子囊原生质进入包囊内形成多个
游动孢子，泡囊破裂后释放出游动孢子。有性生殖期
间，有些菌丝中间或顶端出现球形的藏卵器，内有球形
的卵孢子（见图１Ｄ），有些菌丝一端产生凹形的雄器呈，
扣在藏卵器一侧（见图１Ｅ）。
２．２ＮＢＲＣ３３２５３的ＩＴＳ系统发育学分析
ＮＢＲＣ３３２５３的ＩＴＳ序列全长为８７０ｂｐ，ＢＬＡＳＴ结
果显示该序列与紫菜腐霉Ｐ．ｐｏｒｐｈｙｒａｅ的相似度为
９９％～１００％，在系统发育树与紫菜腐霉聚为一支，自
举值为９９％（见图２）。这个结果表明 ＮＢＲＣ３３２５３为
紫菜腐霉。
２．３人工感染实验及组织病理的观察
以浓度为１．０ｍｇ／ｍＬ的紫菜腐霉菌丝体感染紫
菜，２天后可肉眼观察到藻体不定位置出现锈红色斑
点；随时间延长，病斑逐渐增大，由针尖大小增加至直
径２ｃｍ 以上，颜色逐渐变为黄褐色或淡黄色（见图
３Ｂ），边缘稍带红色；随着病程发展，大小不同的病斑连
接成片形成腐烂的孔洞，叶片呈现绿色（见图３Ｃ），最后
导致腐烂组织流失，出现病症到紫菜叶片腐烂流失的
时间为５～７ｄ。实验期间，对照组藻体没有出现上述
病变（见图３Ａ）。
８２
７期 李淑芬，等：一株紫菜腐霉的鉴定及其对条斑紫菜的致病性
（Ａ菌落形态Ｃｏｌｏｎｙ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ；Ｂ菌丝Ｈｙｐｈａｅ；Ｃ游动孢子囊，示泡囊（箭头１）和排孢管（箭头２）Ｚｏｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ，ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ　ｈｙｐｈａｅ　ｓｗｅｌｉｎｇ（ａｒｒｏｗ　１）ａｎｄ
ｓｐｏｒｅ　ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ　ｔｕｂｅ（ａｒｒｏｗ　２）；Ｄ卵孢子（箭头）Ｏｏｓｐｏｒｅｓ（ａｒｒｏｗ）；Ｅ藏卵器（箭头１）和雄器（箭头２）Ａｒｃｈｅｇｏｎｉｕｍ（ａｒｒｏｗ　１）ａｎｄ　ａｎｔｈｅｒｉｄｉｕｍ（ａｒｒｏｗ　２）．）
图１　光学显微镜观察ＮＢＲＣ３３２５３形态
Ｆｉｇ．１　Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ＮＢＲＣ３３２５３ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｕｎｄｅｒ　ｌｉｇｈｔ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ
图２　基于ＩＴＳ基因序列构建的Ｎ－Ｊ系统进化树
Ｆｉｇ．２　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｂｙ　ｎｅｉｇｈｂｏｒ　ｊｏｉｎｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ＩＴＳ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
９２
中　国　海　洋　大　学　学　报 ２　０　１　６年
（Ａ对照组紫菜 Ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｐ．ｙｅｚｏｅｎｓｉｓ　ｔｈａｌｉ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐ．
ｐｏｒｐｈｙｒａｅ；Ｂ感染腐霉后的紫菜，叶片呈黄褐色Ｔｈｅ　Ｐ．ｙｅｚｏｅｎｓｉｓ　ｔｈａｌｉ
ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｐ．ｐｏｒｐｈｙｒａｅ，ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ　ｙｅｌｏｗ　ｃｏｌｏｒ；Ｃ感染腐霉后的紫
菜，叶片呈黄绿色Ｔｈｅ　Ｐ．ｙｅｚｏｅｎｓｉｓ　ｔｈａｌｉ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｐ．ｐｏｒｐｈｙｒａｅ，
ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ　ｇｒｅｅｎ　ｃｏｌｏｒ．）
图３　感染紫菜腐霉后发生赤腐病的条斑紫菜
Ｆｉｇ．３　Ｒｅｄ　ｒｏｔ　ｓｙｍｐｔｏｍ　ｏｆ　Ｐ．ｙｏｅｎｚｏｓｉｓ
ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｐ．ｐｏｒｐｈｙｒａｅ
　　在低倍镜下，发现紫菜病斑区细胞收缩、颜色变
淡，与周围正常细胞有明显的区别（见图４Ｃ）。高倍镜
下，病斑处的紫菜细胞被菌丝体贯穿，萎缩均质化（见
图４Ｄ），在一些被菌丝体穿透的细胞发现有桃红色藻红
素流出（见图４Ｅ）；在病灶处还发现了孢子囊和藏卵器
（见图４Ｆ）。对照组紫菜细胞没有发现病理变化（见图
４Ａ、４Ｂ）。从患病叶片分离到形态一致的纯菌落，随机
挑取部分菌落进行显微观察和ＩＴＳ序列分析，显示它
们的显微特征和ＩＴＳ序列与 ＮＢＲＣ３３２５３一致。上述
结果表明ＮＢＲＣ３３２５３可以感染条斑紫菜引起赤腐病。
２．４温度和盐度对紫菜腐霉生长的影响
表１数据显示，紫菜腐霉菌丝体在１６～３６℃的温
度范围内生长良好，较高温度适合菌丝体生长，温度为
２８℃时，菌丝体的生长量最重。各温度组间的菌丝体
重量均呈现显著性差异（Ｐ＜０．０５），表明温度对
ＮＢＲＣ３３２５３菌丝体的生长有着重要的作用。
紫菜腐霉在１０～４０的盐度内生长良好，较低盐度
适合菌丝的生长，盐度为２０时，菌丝体重量最大。各
盐度间的菌丝体重量均呈现显著性差异（Ｐ＜０．０５），表
明盐度对紫菜腐霉菌丝体的生长有着重要的作用（见
表２）。
（Ａ对照紫菜（放大１０倍）Ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｐ．ｙｅｚｏｅｎｓｉｓ　ｔｈａｌｉ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐ．ｐｏｒｐｈｙｒａｅ（１０ｔｉｍｅｓ　ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ）；Ｂ对照紫菜（放大１００倍）Ｔｈｅ　ｃｏｎ－
ｔｒｏｌ　Ｐ．ｙｅｚｏｅｎｓｉｓｔｈａｌｉ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐ．ｐｏｒｐｈｙｒａｅ（１００ｔｉｍｅｓ　ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ）；Ｃ紫菜病斑区颜色变淡（放大１０倍）Ｔｈｅ　ｄｉｓｅａｓｅｄ　ｓｐｏｔ　ｏｆ　Ｐ．ｙｅｚｏｅｎ－
ｓｉｓ　ｂｅｃａｍｅ　ｌｉｇｈｔｅｒ　ｉｎ　ｃｏｌｏｒ（１０ｔｉｍｅｓ　ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ）；Ｄ紫菜细胞收缩，被菌丝体贯穿（箭头处）（放大１００倍）Ｔｈｅ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ａｌｇａｅ　ｃｅｌｓ　ｂｅｃａｍｅ　ｓｈｒａｎｋ　ａｎｄ
ｐｅｎｅｔｒａｔｅｄ　ｂｙ　ｆｕｇａｌ　ｈｙｐｈａｅ（１００ｔｉｍｅｓ　ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ）；Ｅ藻红色素流出（箭头处）（放大１００倍）Ｔｈｅ　ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｏｂｉｌｉｎ（ａｒｒｏｗ）ｄｉｓｃｈａｒｇｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｉｎｆｅｃ－
ｔｅｄ　ａｌｇａｅ　ｃｅｌｓ（１００ｔｉｍｅｓ　ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ）；Ｆ紫菜病斑区发现紫菜腐霉的藏卵器（箭头１）和雄器（箭头２）（放大１００倍）Ｔｈｅ　ａｒｃｈｅｇｏｎｉｕｍ（ａｒｒｏｗ　１）ａｎｄ
ｔｈｅ　ａｎｔｈｅｒｉｄｉｕｍ（ａｒｒｏｗ　２）ｏｆ　Ｐ．ｐｏｒｐｈｙｒａｅ　ｗｅｒｅ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ａｔ　ｔｈｅ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　Ｐ．ｙｅｚｏｅｎｓｉｓ（１００ｔｉｍｅｓ　ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ）．）
图４　紫菜腐霉感染条斑紫菜叶状体的组织病理变化
Ｆｉｇ．４　Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｐ．ｙｏｅｎｚｏｓｉｓ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｐ．ｐｏｒｐｈｙｒａｅ
０３
７期 李淑芬，等：一株紫菜腐霉的鉴定及其对条斑紫菜的致病性
表１　温度对紫菜腐霉菌生长的影响
Ｔａｂｌｅ　１　Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｏｎ　ｔｈｅ
ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　Ｐｙｔｈｒｉｕｍ　ｐｏｒｐｈｙｒａｅ
温度①／℃
菌丝重量②
／μｇ·ｍＬ
－１
日增长量③
／μｇ·ｍＬ
－１·ｄ－１
４　 １４．５±０．１　 ２．１
８　 ３４．５±０．７　 ４．９
１２　 ７１．５±１．６　 １０．２
１６　 １５８．５±１．１　 ２２．６
２０　 ６３５．５±１．０　 ９０．８
２４　 １　２８４．５±１．３　 １８３．５
２８　 １　７３３．０±５．５　 ２４７．５
３２　 １　２１０．０±７．９　 １７２．９
３６　 ６２６．０±７．６　 ８９．４
　Ｎｏｔｅ：①Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ；②Ｈｙｐｈａｅ　ｗｅｉｇｈｔ；③Ｄａｉｌｙ　ｇｒｏｗｔｈ　ｗｅｉｇｈｔ
表２　盐度对紫菜腐霉菌生长的影响
Ｔａｂｌｅ　２　Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｓａｌｉｎｉｔｙ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ
ｏｆ　Ｐｙｔｈｒｉｕｍ　ｐｏｒｐｈｙｒａｅ
盐度①
菌丝重量②
／μｇ·ｍＬ
－１
日增长量③
／μｇ·ｍＬ
－１·ｄ－１
５　 １７７．５±４．８　 ５．４
１０　 ２５５．５±９．２　 ３６．５
１５　 ４０２．２±７．４　 ５７．４
２０　 ６４５．６±５．９　 ９２．１
２５　 ４６２．３±９．５　 ６６．０
３０　 ３７６．５±１３．４　 ５３．８
３５　 ３５９．０±７．０　 ５１．３
４０　 ２８６．０±１０．０　 ４０．９
４５　 １５８．５±７．２　 ２２．７
５０　 １０６．０±５．７　 １５．１
　Ｎｏｔｅ：①Ｓａｌｉｎｉｔｙ；②Ｈｙｐｈａｅ　ｗｅｉｇｈｔ；③Ｄａｉｌｙ　ｇｒｏｗｔｈ　ｗｅｉｇｈｔ
２．５环境因子对紫菜腐霉感染效果的影响
在不同的养殖温度下，１８℃组最早（１天）出现针
尖大小的红色斑点，其次分别为２３℃组（２天）和１３℃
组（４天），而８℃组在实验期间（７天）没有观察到病症
出现（见表３）。随着病程发展，温度愈高，病斑出现面
积愈大，在第７天时，病斑面积分别为９８．７％（２３℃）、
８７．７％（１８℃）、１２．０％（１３℃），各实验组之间均有显
著性的差异（Ｐ＜０．０１）（见图５Ａ）。因此，较高温度
（１８～２３℃）容易发生赤腐病。
如表３所示，盐度愈低，出现病症的时间愈早，各
盐度条件下出现病症的时间分别：２４盐度组１天、２９
盐度组２天、３４盐度组４天、３９盐度组５天。随着病程
发展，盐度愈低，病斑出现面积愈大，在第７天时，病斑
面积分别为１００％（２４盐度组）、８０．３％（２９盐度组）、
２５．２％（３４盐度组）、１１．６％（３９盐度组），各实验组之
间均有显著性差异（Ｐ＜０．０１）（见图５Ｂ）。因此，低盐
度（２４～２９）条件容易发生赤腐病。
如表３所示，腐霉感染浓度愈高，出现病症时间愈早，
各感染浓度条件下出现病症的时间分别为１．０ｍｇ／ｍＬ组
（２天）、０．５ｍｇ／ｍＬ组（３天）、０．１ｍｇ／ｍＬ组（３天）、
０．０１ｍｇ／ｍＬ组（４天）。随着病程发展，感染浓度愈
高，病斑出现面积愈大，在第７天时，病斑面积分别为
１００％（１．０ ｍｇ／ｍＬ 组）、９４．３％ （０．５ ｍｇ／ｍＬ 组）、
８７．３％（０．１ｍｇ／ｍＬ组）、１２．９％（０．０１ｍｇ／ｍＬ组），各
实验组之间均有显著性差异（Ｐ＜０．０１）（见图５Ｃ）。因
此，水体中存在较高浓度的腐霉（０．１～１．０ｍｇ／ｍＬ）容
易发生赤腐病。
表３　腐霉感染条斑紫菜后出现病症时间
Ｔａｂｌｅ　３　Ｔｈｅ　ｔｉｍｅ　ｏｆ　ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ　ｏｆ　ｒｅｄ　ｒｏｔ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ｉｎ
Ｐ．ｙｏｅｎｚｏｓｉｓ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｐ．ｐｏｒｐｈｙｒａｅ
温度①
／℃
病症出现
时间②／ｄ
盐度③
病症出现
时间②／ｄ
感染浓度④
／μｇ·ｍＬ
－１
病症出现
时间②／ｄ
８ 无 ２４　 １　 １．０　 ２
１３　 ４　 ２９　 ２　 ０．５　 ３
１８　 １　 ３４　 ４　 ０．１　 ３
２３　 ２　 ３９　 ５　 ０．０１　 ４
Ｎｏｔｅ：①Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ；②Ｔｉｍｅ　ｏｆ　ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ　ｏｆ　ｄｉｓｅａｓｅ；③Ｓａｌｉｎｉｔｙ；
④Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｄｏｓｅ
图５　不同养殖条件下条斑紫菜发生赤腐病病斑的面积
Ｆｉｇ．５　Ｒａｔｅｓ　ｏｆ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｅｘｐａｎｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｐ．ｙｏｅｎｚｏｓｉｓ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ
ｗｉｔｈ　Ｐ．ｐｏｒｐｈｙｒａｅ　ａｔ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
３　讨论
腐霉菌在全世界分布，多数在土壤和水生环境中
营腐生生活，有超过８０种为陆地植物病原，引起各种
植物根腐和幼苗猝倒，一些还可引起人和动物疾
１３
中　国　海　洋　大　学　学　报 ２　０　１　６年
病［１１－１３］。日本、韩国、美国和中国的学者相继报道紫菜
腐霉可引起养殖和野生紫菜赤腐病［３－４，６－８，１４－１７］。Ｐａｒｋ等
发现从日本和韩国不同地区患病紫菜分离的紫菜腐霉
存在形态和生理特征的差别［１８］，这些差别说明不同地
理腐霉菌株可能存在遗传和致病性的差异。中国学者
分别从坛紫菜和条斑紫菜中分离到紫菜腐霉株［６，７］，它
们与其他地区分离得到的菌株是否存在遗传和致病性
的差异，目前尚未有这方面的研究报道。本实验室在
开展紫菜赤腐病病原分离、鉴定等流行病学调查的同
时，对日本患赤腐病紫菜的一株分离菌株进行鉴定和
致病性的检测，旨在进一步比较研究不同来源紫菜腐
霉菌株的遗传、表型特征和鉴别特征，为研究腐霉致病
机理、建立外来病风险评估以及疾病防控措施提供依
据。本实验室研究人员严格遵守国家进境动物源性生
物材料及制品检验检疫管理规定、《病原微生物实验室
生物安全管理条例》和《兽医实验室生物安全管理规
范》，保证实验过程安全使用和存放该菌株，严禁进行
海上实验。
多数腐霉菌的形态特征不稳定，难于用来区分形
态特征和生物学特征相近但亲缘关系较远的种。基于
核糖体ＤＮＡ转录内间隔区ＩＴＳ序列的分子特征成为
腐霉菌分类和鉴别的重要手段。本研究首先观察了
ＮＢＲＣ３３２５３的形态特征。结果显示该菌具有腐霉属
的基本特征，产生丝状孢子囊、球形藏卵器、凹形雄器，
这些结果与文茜等从条斑紫菜分离得到紫菜腐霉的特
征一致［１４］。该菌的ＩＴＳ序列分析结果显示它与其他紫
菜腐霉菌的亲缘关系最近。感染实验结果表明紫菜腐
霉可以引起条斑紫菜赤腐病，病斑处细胞被菌丝穿透，
导致细胞色素等内容物流出而导致紫菜细胞的死亡，
最终引起紫菜组织溃烂，这些症状与丁怀宇等的描述
一致［８］。
根据文献报道，每年的１１月中旬到１２月下旬，以
及２—３月期间，当海水温度连续几天超过１８℃，是赤
腐病易发期。紫菜养殖海区的盐度一般在２５～３３，如
果连续降雨引起海水盐度下降，也会增加赤腐病发生
的机会［６］。本研究观测了温度、盐度、腐霉浓度对赤腐
病发生效果的影响，结果显示较低盐度（２４～２９）、较高
水温（１８～２３℃）、较高腐霉浓度（０．５～１．０ｍｇ／ｍＬ）有
利于赤腐病发生。条斑紫菜可在０．５～２０℃生长，最
适合生长温度为１６～１８℃［２０］。有研究发现，在２３℃
培养的条斑紫菜叶状体生长缓慢，培养８天时叶片皱
缩、加厚、表面不平整，培养３０天时叶片死亡变白腐
烂［２１］。本研究观测到在２３℃进行感染，感染浓度较高
的紫菜藻体在７天内发生９０％以上的病烂，其原因可
能是高温和病原感染两者综合作用的结果。同时，本
研究还发现，腐霉在较高温度（１６～３６℃）、较低盐度
（１０～４０）条件下生长良好。因此，当紫菜养殖海区温
度在１６～２０℃、盐度低于２５时，适合紫菜腐霉生长，养
殖区腐霉数量增加，是发生赤腐病的根本原因。在此
期间，减少紫菜栽培筏架设置密度以增加水体交换，可
以稀释病原数量和提高水体盐度，对降低病原感染有
帮助。
目前主要通过加强养殖过程中管理和调控环境因
子来减轻紫菜病害的发生，筛选和培育抗病紫菜品系
也是一种应对病害的有效途径，是本实验室着力发展
的方向。本研究结果为进一步研究紫菜腐霉与宿主的
相互作用提供了基础，有利于抗病紫菜品系的筛选和
培育。
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（１．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｏｃｅａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ，Ｑｉｎｇｄａｏ
２６６００３，Ｃｈｉｎａ；２．Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｙｅｌｏｗ　Ｓｅａ　Ｆｉｓｈ－
ｅｒｉｅｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｆｉｓｈｅｒｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｑｉｎｇｄａｏ　２６６０７１，Ｃｈｉｎａ；３．Ｌｏｎｇｙｕａｎ　Ｂｉｏｔｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｃｏｐｍａｎｙ
Ｌｔｄ．，Ｌｉａｎｙｕｎｇａｎｇ　２２２０００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：　Ｐｙｒｏｐｉａｉｓ　ａｎ　ｅｃｏｎｏｍｉｃａｌｙ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｉｎ　Ｅａｓｔ　Ａｓｉａ．Ｆａｒｍｅｄ　Ｐｙｒｏｐｉａｉｓ　ｅａｓｙ　ｔｏ
ｂｅ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．Ｉｔ　ｉｓ　ｎｅｃｅｓｓａｒｙ　ｔｏ　ｇｅｔ　ａ　ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎｅｃｉ－
ｔｙ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｐａｔｈｏｇｅｎｓ　ｆｏｒ　ｄｉｓｅａｓｅｓ　ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ．Ｐｙｔｈｒｉｕｍ　ｐｏｒｐｈｙｒａｅ　ｉｓ　ａ　ｆｕｎｇｕｓ　ｔｈａｔ　ｉｓ　ａｂｌｅ　ｔｏ　ｃａｕｓｅ
ｔｈｅ　ｒｅｄ　ｒｏｔ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｏｆ　Ｐｏｒｐｈｙｒａ．Ａ　ｓｔｒａｉｎ　ＮＢＲＣ３３２５３ｗａｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｆａｒｍｅｄ　Ｐｏｒｐｈｙｒａａｎｄ　ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ
ｉｎ　ＮＩＴＥ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｉｎ　Ｊａｐａｎ，ｂｕｔ　ｉｔｓ　ｔａｘｏｎｏｍｉｃ　ｓｔａｔｕｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎｅｃｉｔｙ　ａｒｅ　ｎｏｔ　ａｖａｉ－
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ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｔｏ　ｉｄｅｎｔｉｆｙ　ｔｈｅ　ｆｕｎｇａｌ　ｓｔｒａｉｎ　ｗｉｔｈ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ，ｔｏ
ｅｘａｍ　ｉｔｓ　ｇｒｏｗｔｈ　ｕｎｄｅｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｓａｌｉｎｉｔｙ），ａｎｄ　ｆｉｎａｌｙ　ｔｏ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｉｔｓ
ｐａｔｈｏｇｅｎｅｃｉｔｙ　ｏｎ　Ｐ．ｙｅｚｏｅｎｓｉｓ　ｂｙ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ
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ｔｅｄ　ｉｎ　ＧｅｎＢａｎｋ．Ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｔｌｙ，ＮＢＲＣ３３２５３ｗａｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ａｓ　Ｐｙｔｈｒｉｕｍ　ｐｏｒｐｈｙｒａｅ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ｇｒｏｗｔｈ
ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ＮＢＲＣ３３２５３ｇｒｅｗ　ｗｅｌ　ａｔ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ　ｒａｎｇｉｎｇ　ｆｒｏｍ　１６ｔｏ　３６℃ａｎｄ　ｓａｌｉｎｉｔｉｅｓ
ｒａｎｇｉｎｇ　ｆｒｏｍ　１０ｔｏ　４０ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｇｒｏｗｔｈ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｏｆ　２８℃ａｎｄ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｇｒｏｗｔｈ　ｓａｌｉｎｉｔｙ　ｏｆ
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ｉｎ　ｄｉａｍｅｔｅｒ），ｒｏｕｎｄ，ｒｅｄ　ｌｅｓｉｏｎ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｔｈａｌｉ　ａｔ　４８ｈｐｏｓｔ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈ　ｇｒａｄｕａｌｙ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　ｉｎｔｏ　ｉｒｒｅｇｕ－
ｌａｒ　ｌｉｇｈｔ　ｙｅｌｏｗ　ｌｅｓｉｏｎｓ（＞２０ｍｍ）ｓｕｒｒｏｕｎｄｅｄ　ｂｙ　ａｐｉｎｋ　ｍａｒｇｉｎ　ａｎｄ　ｆｉｎａｌｙ　ｃａｕｓｅｄ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｏｆ　ｅｎｔｉｒｅ　ｔｈａｌ－
ｌｕｓ　ｉｎ　５～７ｄａｙｓ　ｐｏｓｔ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｌａｖｅｒ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ
ＮＢＲＣ３３２５３ｍｙｃｅｌｉａ　ｗｅｒｅ　ａｂｌｅ　ｔｏ　ｉｎｖａｄｅｄ　ｔｈｅ　ｔｈａｌｉ　ｔｉｓｓｕｅ，ｃａｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｌａｖｅｒ　ｃｅｌｓ　ｃｏｌａｐｓｅｄ　ａｎｄ　ｄｉｅｄ．Ｆｕｒ－
ｔｈｅｒ　ｓｔｕｄｉｅｓ　ｆｏｕｎｄ　ｔｈａｔ　Ｐ．ｙｅｚｏｅｎｓｉｓ　ｗａｓ　ｐｒｏｎｅ　ｔｏ　ｒｅｔ　ｒｏｔ　ｄｉｓｅａｓｅ　ａｆｔｅｒ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ＮＢＲＣ３３２５３ａｔ　ｈｉｇｈｅｒ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（１８～２３℃），ｌｏｗｅｒ　ｓａｌｉｎｉｔｉｅｓ（２４～２９）ａｎｄ　ｈｉｇｈｅｒ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｕｎｇｉ（０．１～１．０ｍｇ／ｍＬ）．
Ｔｈｅｓｅ　ｆｉｎｄｉｎｇｓ　ｗｉｌ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ａ　ｆｕｎｇａｌ　ｍａｔｅｒｉａｌ　ｆｏｒ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎｄ　ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ
ｏｆ　Ｐ．ｐｙｔｈｒｉｍｆｒｏｍ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｏｒｉｇｉｎｓ，ｗｈｉｃｈ　ｗｉｌ　ｈｅｌｐ　ｔｏ　ｐｒｅｖｅｎｔ　ｔｈｅ　ｒｅｄ　ｒｏｔ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｏｆ　Ｐ．ｙｅｚｏｅｎｓｉｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：　Ｐｙｔｈｒｉｕｍ　ｐｏｒｐｈｙｒａｅ；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；Ｐｙｒｏｐｉａ　ｙｅｚｏｅｎｓｉｓ；ｐａｔｈｏｇｅｎｅｃｉｔｙ；ｒｅｄ　ｒｏｔ　ｄｉｓｅａｓｅ
责任编辑　朱宝象
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