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第 35 卷第 12 期
2011 年 12 月
水 产 学 报
JOURNAL OF FISHERIES OF CHINA
Vol． 35，No． 12
Dec．，2011
文章编号:1000－0615(2011)12－1829－08 DOI:10． 3724 /SP． J． 1231． 2011． 17547
收稿日期:2011 05 26 修回日期:2011 10 10
资助项目:国家自然科学基金项目(30771674) ;教育部重点项目(109099)
通讯作者:张朝辉，E-mail:zhangzhh@ ouc． edu． cn
江蓠中类菌孢素氨基酸(MAAs)分离纯化及其成分分析
金宁宁， 张朝辉* ， 李八方， 严芳芳， 孙京沙
(中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003)
摘要:存在于海洋生物中，尤其是藻类中的类菌孢素氨基酸(mycosporine-like amino acids，
MAAs) ，是一种吸收紫外线的物质，可用于紫外线防护品的原料，具有商业开发的前景。对
湛江沿海产江蓠中 MAAs进行了分离和结构鉴定，确定江蓠 MAAs的主要组成及比例。利
用 C-18 Sep-Pak固相萃取柱和半制备型 HPLC 对湛江产江蓠中 MAAs 成分进行分离纯化。
根据化合物的特征、紫外吸收波长和波谱数据鉴定其主要成分的结构，并结合参考文献确
定湛江产江蓠 MAAs的 4 种主要成分是 palythine、shinorine、palythinol和 porphyra-334，其比
例约为 4． 9 ∶1 ∶1． 2 ∶9． 9。同时，比较了 UV 法和 HPLC 法对湛江产江蓠 MAAs 主要成分
porphyra-334 含量检测的准确度，建立了两种检测方法的拟合曲线，并通过试验验证，最终
确立了 HPLC 对 MAAs主要组成成分的检测方法。
关键词:江蓠;类菌孢素氨基酸;ESI-TOF /MS;检测方法
中图分类号:Q 517;S 917． 3 文献标志码:A
江篱(Gracilaria changii)属隶属于红藻门
(Rhodovhyta) ，真红藻纲(Florideophyceae) ，杉藻
目(Gigartinales) ，江篱科(Gracilariaccac)［1］，广泛
分布于热带、亚热带和温带海区，在我国主要分布
于广东、海南沿海地区。类菌孢素氨基酸
(mycosporine-like amino acids，MAAs)是以环己
烯酮为基本骨架，与不同类型氨基酸通过胺缩合
作用形成的一大类水溶性物质［2］。由于共轭双
键和不同侧链上活性基团的存在，在 310 ～ 360
nm 的紫外光区具有强的吸收能力，可以作为紫外
防护用品的原材料，具有广阔的开发价值和应用
空间。
到目前为止，从海洋生物中发现了大约有 21
种 MAAs，而已经检测出含有这一紫外吸收物质
的藻类更多达 152 种［3］，其中红藻和褐藻含量较
高，密度较大。MASAHIRO 等［4］发现条斑紫菜生
长的 5 个阶段中含有不同 MAAs 成分且其含量
在不同生长阶段发生了明显变化。FIGUEROA
等［5］通过进一步研究发现紫菜 MAAs 提取物中
porphyra-334 为抗脂质氧化活性成分。YUAN
等［6］研究发现掌状红皮藻(Palmaria palmata)的
MAAs提取物对小鼠黑色素瘤细胞 B16-F10 的扩
散有明显抑制作用，这一发现与 THOMAS 等［7］
提出的 shinorine和 porphyra-334 与其他MAAs成
分转化过程中可能产生抗氧化因子进而抑制癌细
胞的推测相一致。
本研究以湛江沿海人工养殖新鲜江蓠为原
料，对江蓠中 MAAs 的成分进行了分析，同时利
用紫外扫描、高效液相色谱纯化及质谱技术鉴定
出江蓠 MAAs中 porphyra-334、playthine、shinorine
和 playthinol 4 种成分，然后利用计算机拟合出了
检测主要组分 porphyra-334 含量的曲线方程，并
通过试验进行了验证。
1 材料与方法
1． 1 试验材料与仪器
取 2010 年 6 月份收获于湛江沿海人工养殖
江蓠 10 kg，－20 ℃冷冻保存。试剂:甲醇、乙酸
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等分析用试剂均为色谱纯，其它试剂均为分析纯。
仪器:高速冷冻离心机 GL—20G—Ⅱ，上海飞鸽
科学仪器厂;电子精密天平:AR2140 型，Ohaus
Corp． Pine Brook，NJ，USA;冷 冻 干 燥 机:
ALPHA1—4LD Germany，上海斯高勒生物科技有
限公司;水浴摇床:SHA-B 型，常州国华电器有限
公司;旋转蒸发器:RE-52AA 型，上海亚荣生化仪
器厂;C-18 Sep-Pak 柱:Waters Sep-pak C18 固相
萃取小柱，美国沃特世公司;紫外—可见光谱仪:
Shimadzu UV-2550 Japan，日本岛津公司;高效液
相色谱仪 HPLC，配有二极管阵列检测器(DAD) ，
四元泵，自动进样器等:Agilent-1100，美国安捷伦
公司;电喷雾飞行时间质谱仪 ESI-TOF /MS:
Agilent-1969A，美国安捷伦公司;分析碾磨机-
A11，德国 IKA。
1． 2 MAAs成分的提取
原料预处理 取适量冻藏的新鲜江蓠，
4 ℃条件下自然融化后，洗净、沥干水分，立即在－
60 ℃条件下冻干 36 h，粉碎至 20 到 60 目。
粗提工艺 在原料预处理完成后，用 25%
甲醇在 45 ℃水浴浸提 2 h。冷却至常温，8 000 r /
min，冷冻离心 3 次。上清液加无水乙醇调乙醇最
终浓度为 80%，－20 ℃条件下醇沉 2 h［8］，蛋白
质、核酸及其他大分子变性沉淀后以 10 000 r /
min，冷冻离心 20 min，上清液 40 ℃减压蒸干。超
纯水复溶后过 C-18 Sep-Pak 柱，除去色素和悬浮
脂质［9］。最后在－60 ℃条件下冷冻干燥 36 h，获
得冻干粗品，备用。
1． 3 MAAs成分分析
高效液相色谱及质谱分析 取冻干粗品
2． 50 g，定容于 25 mL 容量瓶中，0． 22 μm 无机膜
过滤，滤液于液相色谱进行检测。
液相色谱(HPLC)条件［10］:色谱柱为 Zorbax
SB-C18 柱(5 μm packing;250×4 mm I． D) ;流动
相为 0． 2%乙酸溶液(A 相) ，色谱纯甲醇(B 相) ，
梯度洗脱 t 为 0 ～ 30 min，B%为 20% ～ 80%;流
速 1． 0 mL /min;柱温 25 ℃;进样量 100 μL。
质谱(ESI-TOF /MS)条件［11］:正离子电离
模式，喷雾气压 45p si，干燥气(N2)流速 10 ． 0
L /min，干燥气温度 350 ℃，毛细管电压 4 500
V，破 碎 电 压 (Fragmentor)100 V，全 扫 描
(Scan) ，参比离子质荷比:121． 050 9，922． 009 8，
为参比离子对测定结果进行时时校正，以保证结
果的准确性，分辨率 m /z 在 922． 009 8 处为
11 300全扫描(Scan)质荷比(m /z)范围为120 ～
1 000。
紫外光谱扫描分析 收集 MAAs 液相吸
收峰，收集液减压冷冻干燥。冻干样品超纯水复
溶后分别在 310 ～ 360 nm 范围内进行紫外扫描，
确定不同保留时间成分的特征吸收波长。
1． 4 MAAs主要组分检测方法的建立
紫外检测方法的建立 (1)标准曲线的制
备［12］。称取 MAAs 主要成分 porphyra-334 标准
品 5 mg(精确至 0． 000 1 g) ，用超纯水定容到 50
mL，摇匀后，取 0． 5，0． 75，1． 0，1． 25，1． 50，1． 75，
2． 0，2． 25，2． 5 mL 分别置于 10 mL 容量瓶中，稀
释到刻度。以超纯水为参比液，在 334 nm 处测定
各浓度的吸光值 A。以标准品浓度为横坐标，其
吸光度为纵坐标绘图，得回归方程。
(2)回收率的测定。采用加样回收法［13］，取
适量已知含量的样品，精密加入一定量的
Porphyra-334 对照品，在最大吸收波长 334 nm 处
测定 OD 值，同法重复试验 5 次，测得平均回收
率。根据回归方程计算回收率，R =R1 /R2(R 回收
率，R1 实测量，R2 加入量)。
高效液相色谱检测方法的建立 (1)标准
曲线方程。称取 MAAs主要组分 porphyra-334 标
准品 0． 02 g(精确至 0． 000 1 g)于 100． 0 mL 容量
瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，混匀，吸取此
标准使用液，用流动相稀释并在容量瓶中定容的
浓度分别为 2． 0、10． 0、20． 0、40． 0、80． 0 μg /mL
标准系列，以标准品浓度为横坐标，峰高响应值为
纵坐标绘图，得回归方程。(2)回收率试验。采
用加样回收法测定回收率。
1． 5 拟合方程的建立
以不同浓度的 porphyra-334 标准溶液为检
测样品，同时采用 UV 法和 HPLC 法检测，然后
运用 Origin 8． 0 数据处理分析软件，建立 UV 测
定结果与 HPLC 测定结果之间的相关性数学
模型［14］。
2 结果
2． 1 江蓠中MAAs成分分析
检测 MAAs 成分的通常方法是 HPLC 结合
紫外光谱扫描(310 ～ 360 nm) ，而该方法最大的
困难是标准品的制备，所以大多数 MAAs 成分的
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鉴定都是只根据其特定的紫外吸收波长。若在没
有标准品且几种 MAA 成分特征紫外吸收波长又
相近的情况下，用该法鉴定就比较困难［15］。通过
C-18 Sep-Pak固相萃取柱和半制备型 HPLC 进行
分离纯化，然后利用 ESI-TOF /MS 得到各成分母
离子［M+H］+的 m /z 和离子碎片图谱，根据高分
辨质谱结果即可推测分子式。根据参考文献
［16］和特征紫外吸收波长可以准确确定江蓠
MAAs主要成分。
江蓠 MAAs 液相色谱图中含有 4 个明显的
主峰，通过半制备 HPLC 柱进一步纯化，得到保留
时间分别为 3． 567、5． 624、6． 373、9． 471 min 的组
分(表 1) ，说明 MAAs 提取物可能含有 4 种紫外
吸收物质，而且通过各组分峰面积的比较可以发
现保留时间为 3． 567 和 9． 471 min 的组分含量较
高。由 4 种组分的一级质谱图(图 1)可以看出主
要质谱峰［M +H］+的 m /z 分别是 245、333、303、
347。利用 ESI-TOF /MS 系统配备的 Analyst QS
软件根据 4 种组分的母离子［M+H］+和碎片离子
谱图(图 2)对其分子式进行推测，得到江蓠中 4
种活性物质的结构式(表 1) ，结合参考文献［16］
对分离所得 4 种化合物进行比较鉴别。最后利用
紫外吸收光谱扫描检测到 4 种组分在310 ～ 360
nm 的特征吸收波长分别为 320、334、330 和 334
nm(表 1) ，与各成分紫外特征吸收波长相符［17］。
贺庆梅［18］研究发现广东产江蓠 MAAs 的主
要成分为 porphyra-334 和 shinorine，本试验中的
湛江产江蓠中在 334 nm 处有特征吸收峰的
porphyra-334 含量最高，而 shinorine 含量较低，
说明不同种江蓠中 MAAs 成分及含量均有差
别。GRONIGER 等［19］从海南沿海自然生长江
蓠中检测出了 7 种 MAAs 成分，本试验从湛江
人工养殖江蓠中只检测到了 4 种成分，但含量较
高，两者差别可能是由于养殖条件及生长环境
的影响。
表 1 MAAs主要成分保留时间、分子结构、荷质比及相对峰面积
Tab． 1 Retention time，molecular structures，ESI /MS values and relative
peak area of mycosprine-like amino acids
编号
no．
保留时间 /min
retention time
MAA 种类
mycosporine-like
amin acid
分子结构式
molecular structure
［M+H］+ mass λmax /nm
相对峰面积 /%
relative peak area
1 3． 567 palythine 245． 0 244． 11 320 28． 6
2 5． 624 shinorine 333． 1 332． 12 334 5． 9
4 6． 373 palythinol 303． 1 302． 15 330 6． 9
5 9． 471 porphyra-334 347． 7 346． 14 334 58． 6
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图 1 MAAs主要成分一级质谱图
Fig． 1 First class scanning mass spectrum showing the［M+H］+
peak of the main MAAs
图 2 MAAs主要成分碎片离子和MH+准分子离子图
Fig． 2 Mass spectra showing the fragmentation pattern and MH+
peak for each of the MAAs component
2． 2 porphyra-334 检测方法的建立
UV 法对 porphyra-334 组分的测定 根据
朗伯比尔定律(Lambert-beer’s Law) ，在一定浓
度范围内吸光度值与样品浓度成正比［20］。由图 3
可知，porphyra-334 浓度在 0． 005 ～ 0． 06 mg /mL
时有良好的线性关系，并求得线性回归方程为Y=
17． 128X+0． 057 1，R2 = 0． 996 4。通过表 2 可知，
UV 法的平均加样回收率为 1． 14%，具有较好的
准确度［21］。 图 3 UV法测 porphyra-334 的标准曲线
Fig． 3 Porphyra-334 standard curve of UV method
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表 2 UV 法 porphyra-334 回收率表
Tab． 2 Porphyra-334 recovery of UV method
编号
no．
实测量 /μg
actual
measurement
porphyra-334
量 /μg
dosage
回收率 /%
recovery
1 6． 5 6 1． 08
2 8． 6 8 1． 075
3 15 11 1． 36
4 26 25 1． 04
5 30 26 1． 154
HPLC 法对 porphyra-334 组分的测定 通
过计算得 HPLC 法测定江蓠中 MAAs 主要组分
porphyra-334 线性回归方程为 Y = 5065． 9X +
7． 044 0，R2 =0． 999 4，方程显著性水平是 0． 000 1。
porphyra-334 在 0． 008 ～ 0． 056 mg /mL 的浓度范
围内是线性相关的，并且具有良好的线性关系
(图 4)。通过表 3 可知 HPLC 法的平均加样回收
率为 95． 87%，说明 HPLC 法是准确和可信的［21］。
图 4 HPLC 法测 porphyra-334 标准曲线
Fig． 4 Porphyra-334 standard curve of HPLC method
表 3 HPLC 法 porphyra-334 回收率表
Tab． 3 Porphyra-334 recovery of HPLC method
编号
no．
实测量 /μg
actual
measurement
porphyra-334
量 /μg
dosage
回收率 /%
recovery
1 5． 732 6 95． 53
2 9． 643 10 96． 43
3 22． 867 24 95． 28
4 27． 109 29 93． 48
5 38． 473 39 98． 65
拟合曲线的建立 为了分析 HPLC 法和
UV 法测定结果之间的关系，采用了线形拟合和多
项式拟合的方法［22］，拟合方程为 Y = 0． 934 8X－
2． 591 8，R2 = 0． 987 8。其中，X 轴为 UV 测定结
果，Y轴为 HPLC 测定结果(图 5)。多项式拟合
见图 6，其方程为 Y = A + BX + CX2 + DX3，A =
－6． 209 1，B = 1． 278 6，C = －0． 007 3，D = 2． 4 ×
10－5，R2 = 0． 991 8。从上述拟合结果可以看出，在
一定的范围内，UV 所测得结果要大于 HPLC 所
测得的结果，其主要原因是在 UV 测量的过程中，
除了 porphyra-334 以外其他的酚类物质在 334 nm
处也有吸收，从而为 UV 测定带来了误差［23］。多
项式拟合的相关系数(R2 = 0． 991 8)略高于线性
拟合(R2 = 0． 987 8) ，由此选定 Y = －6． 209 1 +1．
278 6X－0． 007 3X2 +(2． 4 ×10－5)X3 为最佳拟合
方程。
图 5 线性拟合图
Fig． 5 Linear fitting
图 6 多项式拟合图
Fig． 6 Cubic polynomial fitting
拟合方程的验证 利用 UV 法对样品溶液
中的 porphyra-334 进行测定，经拟合方程校正
porphyra-334 的含量，并通过 HPLC 对计算结果
进行验证，结果表明在一定的浓度范围内(8 ～ 50
μg /mL) ，样品经拟合方程校正的浓度值与 HPLC
法所测得的结果相近，t 检验的结果表明，在 0． 05
水平下，两组数据之间没有显著差异 (P =
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0． 672 2) (表 4)。UV 法是一般常规试验室常采
用的检测方法，若样品溶液中成分比较复杂，则
UV 法误差较大。虽然利用 HPLC 检测需要时间
较长，成本高，但高效液相色谱法灵敏度高。国内
对紫外可见分光光度法和高效液相色谱法对
MAAs含量的测定比较研究较少，而且没有对
UV 测定进行校正，本研究建议在实际操作中，使
用 HPLC 法测 MAAs 主要组分含量，若使用 UV
法则要保证样品纯度及适宜浓度，以确保试验结
果的准确性。
表 4 多项式拟合实验结果
Tab． 4 Verification of cubic polynomial fitting results
编号
no．
UV 法测定结果 /
(μg /mL)
results by UV
拟合结果 /
(μg /mL)
fitting results
HPLC 测定结果 /
(μg /mL)
results by HPLC
标准偏差
SD
对照相对
标准偏差
RSD
1 8． 0 3． 565 2． 459 0． 7821 0． 318
2 12． 0 8． 124 7． 087 0． 7331 0． 103
3 15． 5 11． 945 10． 897 0． 7410 0． 068
4 21． 9 18． 543 15． 653 2． 0435 0． 131
5 25． 0 21． 568 20． 747 0． 5805 0． 028
6 38． 8 33． 813 32． 998 0． 5763 0． 017
7 44． 9 38． 656 36． 845 1． 2805 0． 035
8 48 41． 000 38． 238 1． 9530 0． 051
3 讨论
通过紫外光谱扫描、高效液相色谱及级质谱
技术对江蓠中 MAAs 提前物进行了成分鉴定和
含量检测，发现主要有 4 种紫外吸收成分，根据
ESI-TOF /MS 结果分析推测 4 种成分分子量及分
子结构，结合参考文献［16］判断 4 种成分分别是
playthine，shinorine，playthinol 和 porphyra-334，其
中 porphyra-334 和 playthine 的含量较高，相对峰
面积分别是 58． 6%和 28． 6%。
选择 江 蓠 MAAs 中 含 量 较 高 的 成 分
porphyra-334 建立 MAA 的检测方法。通过试验
得到 UV 法和 HPLC 法检测 porphyra-334 含量的
标准曲线及回收率，并建立了两种方法的线性拟
合和多项式拟合曲线。然后试验验证拟合方程，
t检验的结果表明，HPLC 法较 UV 法检测结果准
确性更高。
该类物质在海藻生长发育及渗透调节［24］、抗
氧化功能、紫外屏障［25］及对无脊椎动物胚胎和幼
虫发育的保护上均具有重要作用。本试验虽然分
离鉴定出 4 种纯度较高的 MAAs 成分，但所使用
的纯化方法仅仅适用于实验室获得少量产物，若
要获得大量纯度较高的 MAAs 成分，纯化方法有
待进一步改进。贺庆梅［18］对 MAAs 在防晒产品
中的应用进行了初步研究，但要实现 MAAs 防晒
产品的真正开发和应用，还需要进行产品工艺改
进、细胞毒理及动物模型等方面的深入研究。
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http:∥www． scxuebao． cn
水 产 学 报 35 卷
Study on the isolation，purification and composition analysis of
mycosporine-like amino acids(MAAs)in Gracilaria changii
JIN Ning-ning，ZHANG Zhao-hui* ，LI Ba-fang，YAN Fang-fang，SUN Jing-sha
(Laboratory of Marine Bioactive Substances，Institute of Food Science and Technology，
Ocean University of China，Qingdao 266003，China)
Abstract:Mycosporine-like amino acids(MAAs)found in marine organisms，especially in the algae were a
class of ultraviolet absorption substances． To study the constituents and proportion of MAAs from Gracilaria
changii of Zhanjiang，MAAs were separated and purified by C-18 Sep-Pak SPE and semi-preparative HPLC．
Four mycosporine-like amino acids were found and were identified as palythine，shinorine，palythinol and
porphyra-334，with an approximate ratio of 4． 9 ∶1 ∶1． 2 ∶9． 9，based on the characteristics UV absorption and
spectral data． This paper compared the accuracy of UV and HPLC determination for the content of porphyra-
334 which was the main component of G ． changii，and established fitting curves of two methods． Verified by
experiment，the HPLC detection for the main components of MAAs was ultimately determined． This research
laid the foundation for the development and use of the UV radiation and anti-oxidative substances in the
economic algae produced in our country．
Key words:Gracilaria changii;mycosporine-like amino acids;ESI-TOF /MS;detection
Corresponding author:ZHANG Zhao-hui． E-mail:zhangzhh@ ouc． edu． cn
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