全 文 ：574 Acta Nutrimenta Sinica, Dec., 2009, Vol.31 No.6

凹顶藻萜类化合物对酒精暴露大鼠
氧化损伤保护作用

梁 惠，逄 丹，贺 娟 1，马爱国
（青岛大学医学院医学营养研究所，青岛 266021；
1 青岛大学医学院附属医院，青岛 266071）

【摘 要】目的 观察凹顶藻萜类化合物（Laurencia terpenoids extract, LTE）对酒精暴露大鼠的抗氧化水
平及 HO-1 酶活性的影响，并探讨其可能的作用机制。方法 60 只雄性 Wistar 大鼠随机分为 6 组。酒精模
型组（B 组）给予乙醇 4.8 g/kg bw·d 灌胃；LTE 低、中、高剂量干预组（C、D、E 组）分别给予 LTE 25、
50、100 mg/kg bw·d；甘利欣药物组（F 组）给予甘利欣 200 mg/kg bw·d 灌胃。空白对照组（A 组）给
予等体积蒸馏水。除空白组外，酒精剂量均同模型组。实验进行 6w。分别测定血清及肝匀浆中超氧化物
歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧物酶(GSH-Px)活性，丙二醛（MDA）含量。对肝组织切片进行免疫组化染
色，观察肝内血红素氧化酶-1 (HO-1)免疫阳性细胞的组织分布，并对其灰度值和光吸收密度值进行定量分
析。结果 与 A 组比，B、F 组血清及肝匀浆 SOD 活力下降， C、E 组血清 SOD 活力比 B 组升高，有一定
的量效关系。B 组大鼠血清及肝匀浆 GSH-Px 活力较 A 组下降，而 D 组较 B 组显著升高。与 A 组比，B 组
血清及肝匀浆 MDA 含量较 A 组升高，而 D、E 组血清和肝匀浆 MDA 含量较 B 组显著降低，且有一定的
量效关系。与 A 组比，B 组 HO-1 活力显著降低。D、E、F 组 HO-1 活力比 B 组升高明显。结论 LTE 可
增强酒精暴露大鼠体内抗氧化的活性，减少脂质过氧化产物的生成，诱导 HO-1 活性增强，从而对酒精造
成的机体氧化损伤表现出相应的保护效应。[营养学报，2009，31（6）：574－578]

关键词： 凹顶藻萜类化合物；酒精暴露；抗氧化酶；血红素氧化酶-1
中图分类号：R151.2 文献标识码：A 文章编号：0512-7955（2009）06-0574-05

THE PREVENTIVE EFFECT OF LAURENCIA TERPENOIDS EXTRACT ON
ANTIOXIDANT SYSTEM AFTER ALCOHOL EXPOSURE IN RATS

LIANG Hui，PANG Dan，HE Juan1，MA Ai-guo
(Department of Nutrition, Medical College, Qingdao University, Qingdao 266021
1Affiliated Hospital of Medical College, Qingdao University,Qingdao 266003,China)

【Abstract】Objective To study the preventive effect of Laurencia terpenoids extract（LTE）on antioxidant
system after alcohol exposure in rats. Method Sixty male Wistar rats were randomly assigned to six groups:
Group A (blank group) was ig distilled water. Group B (model group) drink 50% alcohol of 4.8g/kg bw·d. Group
C, D and E was ig supplemented with LTE of 25, 50 and 100 mg/kg bw·d respectively. Group F (positive contro1)
was fed diammonium glycyrrhizinate 200 mg/kg bw·d. All rats were treated for 6w. Six weeks later, the blood and
hepatic tissue were collected. The activities of superoxide dismutase (SOD), glutathione- peroxidase (GSH-Px),
the content of malonaldehyde (MDA) in plasma were measured by biochemical methods. The expression of heme
oxygenase-1 (HO-1) in hepatic tissue was measured by immunohistochemistry assay. Results Compared with
blank group, the activities of SOD and GSH-Px in serum and hepatic tissue decreased; but the

收稿日期 2009-09-08
基金项目 山东省科技厅（No. 2006GG2302002）
作者简介 梁惠（1965－），女，博士，教授， E-mail：qdlianghui@126.com
DOI:10.13325/j.cnki.acta.nutr.sin.2009.06.026
营养学报 2009 年第 31 卷第 6期 575
contents of MDA in serum and hepatic tissue of B group increased. Compared with model group, the activities of
SOD in serum of C，D，E groups increased; and the activities of GSH-Px in serum and hepatic tissue of C，D，
F groups increased; but the contents of MDA in serum and hepatic tissue of C，D，E groups decreased. HO-1 was
expressed in liver cells surrounding central veins of hepatic lobules. Compared with blank group, the expression
of HO-1 in B group was decreased. Compared with model group, the expression of HO-1 in D，E，F groups was
increased. Conclusion LTE can protect against oxidant injury after alcohol exposure, which may be associated
with increased activity of antioxidant enzymes, reduced lipid peroxidation, and increased expression of HO-1 in
liver cells. [ACTA NUTRIMENTA SINICA, 2009, 31(6)：574－578]

Key words：Laurencia terpenoids extract (LTE)；alcohol exposure；antioxidant enzyme； heme oxygenase-1(HO-1)

酒精性肝病（alcoholic liver disease, ALD）
是嗜酒人群的高发性疾病[1]。研究表明，从三列凹
顶藻中分离得到的凹顶藻萜类化合物（Laurencia
terpenoids extract, LTE），有抗肿瘤、抑菌、调
节免疫和抗氧化等生物活性，能有效清除O2·和·OH
等自由基，抑制脂质过氧化，避免自由基对机体的
危害[2-6]。由此推测，LTE有可能通过抗氧化途径对
酒精所致的氧化损伤起保护作用。本研究旨在观察
LTE对酒精暴露动物的抗氧化水平及血红素氧
化酶-1(heme oxygenase-2,HO-1)活性的影响及其
可能机制，为开发天然海藻类药物提供依据。

1 材 料
1.1 凹顶藻萜类化合物
三列凹顶藻（Laurencia tristicha Tseng,
Chang, E.Z.et.B.M.Xia）由中国科学院海洋研究
所提供并鉴定。将凹顶藻干品粉碎后，甲醇及乙醇
反复浸泡，经过滤、减压蒸发、蒸馏水溶解、乙酸
乙酯萃取得有机相，有机相减压蒸发得凹顶藻萜类
化合物（LTE）。高效液相色谱（HPLC）法测得其
总萜含量为 63.29%[2]。
1.2 仪器与试剂
图像采集系统（日本 OLYMPUS-150ES）；显微图
像分析系统（美国PIXERA）；低温离心机（德国Sigma
公司 3K30 型）；低温冰箱（HETO 公司 CL-HETOFRIG）；
甘利欣（甘草酸二胺胶囊，江苏正大天晴药业公
司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,
SOD ）、 谷 胱 甘 肽 过 氧 化 物 酶 （ glutathione
peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（malondialdehyde，
MDA）试剂盒（南京建成生物工程研究所）。HO-1 多
克隆一抗(美国 Santa Cruze 公司)。免疫组化染色
试剂盒（SP-9003，由北京中杉金桥生物技术公司）。
2 方 法
2.1 样品采集及处理
末次灌胃后禁食不禁水 12 h，大鼠依次称重后
给予 20%乌拉坦行腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，
分离血清，留取肝组织，制成 10%肝匀浆。取小块
肝组织放入固定液(4%多聚甲醛，0.1 mol/L PBS 配
制)，后固定后石蜡包埋、切片。
2.2 检测指标与方法
2.2.1 血清脂质过氧化指标测定：SOD：羟胺法；
MDA：硫代巴比妥酸法；GSH-Px：DTNB 直接法。
2.2.2 HO-1活力评价：采用免疫组织化学法。将肝
组织石蜡切片常规脱蜡,水化；3% H2O2 去离子水孵
育5～10 min；蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min；经抗
修复和正常兔血清工作液封闭，室温孵育10～
15 min；滴加适当比例的抗HO-1抗体，37℃孵育2～
3 h或4℃过夜；PBS冲洗，3 min×3次；滴加二抗
工作液（生物素标记兔抗山羊IgG）37℃孵育10～
15min；PBS冲洗，3 min×3次；滴加辣根酶标记链
霉卵白素工作液（S-A/HRP）, 37℃孵育10～15 min；
PBS冲洗，3 min×3次；DAB显色，复染，中性树胶
封片。光镜下观察，阳性结果为细胞质呈棕黄或棕
色。免疫组化染色设阴性对照(以PBS代替一抗)。
应用显微图像分析系统，10×40 光镜下每个样本
随机选择10个视野，测其灰度值和光吸收密度值。
2.3 统计学分析
所有数据均使用 SPSS11.5 统计软件进行统计
分析，组间差异用单因素方差分析，两两比较采用
q 检验。检验水准α=0.05。

3 结 果
3.1 超氧化物歧化酶活力水平测定结果（表 1）
由表 1 可见，B 组血清与肝匀浆 SOD 活力均较
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A 组下降，差异显著（P＜0.05）。C、D、E、F 组血
清 SOD 活力较 B 组有不同程度升高，且 C、E组与 B
组比差异显著（P＜0.05）。C、D、E、F 组肝匀浆
SOD 活力较 B 组有不同程度升高，但无统计学意义。

Table 1 The effect of LTE on the activity of SOD in rats
（n=10, x ± s）
Group
SOD in serum
(U/ml)
SOD in hepatic tissue
(U/mgprot)
A（Blank） 382.808±46.3598 268.988±45.9960
B（Alcoholic model） 195.785±11.0214a 247.306±57.4228a
C（LET Low-dose） 314.689±59.3788b 257.805 ±53.1014
D（LET Mid-dose） 283.127±23.0619b 253.423±52.8373
E（LET High-dose） 272.759±60.1705b 254.835±25.1708
F（positive control） 213.870±56.2204 252.739±41.1001
a：P<0.05 compared with blank group；b：P<0.05 compared with alcoholic
model group；the same in table 2-4

3.2 谷胱甘肽过氧化物酶活力测定结果（表 2）

Table 2 The effect of LTE on the activity of GSH-Px in
rats （n=10, x ± s）
Group
GSH-Px in serum
(U/ml)
GSH-Px in hepatic tissue
(U/mg prot)
A（Blank） 2388.235±243.9581 59.205±8.5671
B（Alcoholic model） 2111.764±313.3330a 46.657±10.9199a
C（LET Low-dose） 2379.831±165.5042b 53.599±16.9124b
D（LET Mid-dose） 2491.176±151.6754b 54.510±19.6573b
E（LET High-dose） 2277.124±86.2745 48.717±20.9567
F（positive control） 2317.647±407.9293b 56.477±8.3738b

由表 2可见，B 组血清及肝匀浆 GSH-Px 活力较
A 组下降，差异显著（P＜0.05），而 C、D、F 组 B
组显著升高，差异显著（P＜0.05）。
3.3 丙二醛含量测定结果（表 3）

Table 3 The effect of LTE on the contents of MDA in rats
（n=10, x ± s）
Group
MDA in
serum(nmol/ml)
MDA in hepatic tissue
(nmol/mgprot)
A（Blank） 7.258±2.7143 9.5091±3.8821
B（Alcoholic model） 26.871±6.0156a 20.2683±5.4094a
C（LET Low-dose） 16.152±4.6934b 10.7576±5.8456b
D（LET Mid-dose） 15.854±3.8716b 8.2759±1.8653b
E（LET High-dose） 11.860±4.3357b 7.1906±2.3968b
F（positive control） 14.596±5.2805 17.685±3.2913

由表 3 可见，B 组血清及肝匀浆 MDA 含量较 A
组升高，差异显著（P ＜0.05）。而 C、D、E组较 B
组降低，差异显著（P＜0.05）。
3.4 血红素氧化酶活力测定（表 4）

Table 4 The effect of LTE on the activity of HO-1 in
hepatic tissue of rats （n=10, x ± s）
Group Grey level Absorbance
A（Blank） 179.4993±1.0032 0.1527±0.0025
B（Alcoholic model） 190.4440±0.6224 a 0.1268±0.0014 a
C（LET Low-dose） 185.1454±0.6010 0.1391±0.0014
D（LET Mid-dose） 179.9886±0.6245 b 0.1514±0.0015 b
E（LET High-dose） 177.8636±1.0706 b 0.1567±0.0026 b
F (positive control) 178.5875±0.6365 b 0.1548±0.0015 b

Fig. 1 Expression of HO-1 in hepatic tissue of blank
group(immunohistochemistry dye, 200×)


Fig. 2 Expression of HO-1 in hepatic tissue of alcoholic
model group(immunohistochemistry dye, 200×)


Fig. 3 Expression of HO-1 in hepatic tissue of LET
low-dose group(immunohistochemistry dye, 200×)


Fig. 4 Expression of HO-1 in hepatic tissue of LET
mid-dose group(immunohistochemistry dye, 200×)


Fig. 5 Expression of HO-1 in hepatic tissue of LET
high-dose group(immunohistochemistry dye, 200×)

免疫组化产物染色越深，灰度值越小，光密度
值越大，HO-1 表达越强。表 4 显示，与 A 组比，B
组大鼠 HO-1 活力显著降低，差异有统计学意义（P
＜0.05）。D、E、F组比 B 组升高明显，差异有统计
营养学报 2009 年第 31 卷第 6期 577
学意义（P＜0.05）。
在HO-1免疫组织化学染色切片上，肝细胞呈多
边形，以中央静脉为中心沿肝索呈放射状排列。细
胞内出现的棕黄色颗粒为抗HO-1抗体与HO-1免疫
反应的产物，颜色越深表示阳性信号越强。
A组肝细胞浆内均匀表达(图1)。B组HO-1表达
缺失，几乎未见到阳性细胞(图2)。C组的细胞浆内
阳性信号较B组强，在中央静脉周围出现一些阳性
信号较强的肝细胞(图3)。D组阳性细胞呈散在分布
(图4)。E、F组阳性细胞呈弥漫性分布，且细胞浆
内阳性表达信号均较强(图5，6)。

4 讨 论
ALD 的发生发展受饮酒量、酒龄、遗传学特征、
营养、免疫等多种因素的影响，涉及多种机制，其
中最重要的是自由基与氧化损伤学说[7]。乙醇作为
一种强烈的氧化应激源和高渗透性的小分子有机
物，在代谢过程中诱生出大量的自由基，从而诱发
氧化应激反应，启动细胞膜脂质过氧化作用[8,9]。其
中以肝脏的氧化损伤尤为严重[10,11]。
SOD 是生物体内最为重要的抗氧化酶之一，是
清除活性氧 (reactive oxygen species, ROS)的
第一道防线，其活力反映了机体清除氧自由基的
能力。本实验观察到，给 Wistar 大鼠灌服 50%乙醇
6 w 后，B组血清及肝匀浆 SOD 活性明显低于 A组。
而 CDEF 各实验组血清及肝匀浆 SOD 与 B 组相比有
升高的趋势，与 Sinet 等的研究结果相符，即在啮
齿类动物慢性乙醇服入后发现过氧化氢酶和 Cu-Zn
SOD 活性降低[12]。
GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要的过氧
化物分解酶，能催化两分子还原型谷胱甘肽（GSH）
变为一分子氧化型谷胱甘肽（GSSG），使有毒的过
氧化物还原成无毒的羟基化合物，同时促进H2O2的
分解。本实验酒精模型组大鼠血清及肝匀浆中
GSH-Px活力均较正常对照组下降，分析其原因为乙
醇在体内代谢时，产生自由基增多，细胞脂质过氧
化反应增强，过氧化产物增多，从而GSH-Px消耗增
加，活力下降。对大鼠补充不同剂量的LTE后观察
到，GSH-Px活力有不同程度升高，其中低、中剂量
LTE组大鼠血清GSH-Px活力较酒精模型组升高明显
（P＜0.05）。说明一定剂量的LTE能够提高血清
GSH-Px活力，增强机体清除自由基的能力，减轻酒
精暴露引起的氧化损伤程度。
MDA是脂质过氧化反应链终止阶段产生的小分
子产物，因此检测MDA含量可以间接反映自由基的
产生情况和机体组织细胞的脂质过氧化程度。本实
验观察到酒精模型组血清及肝匀浆中MDA含量较正
常组显著升高，说明酒精使大鼠体内的抗氧化能力
明显降低，自由基对脂质的氧化作用增强，导致体
内脂质过氧化产物MDA产生增多。而补充LTE和甘利
欣的各实验组，血清及肝匀浆中MDA含量均较酒精
模型组有所下降，呈现一定的剂量依赖性。说明高
剂量LTE能够显著降低酒精暴露引起的氧化反应水
平，减少脂质过氧化产物的生成。
HO-1作为抗氧化应激因子，能催化血红素最终
代谢为为胆红素，是起始酶和限速酶。在此过程中
产生的CO、Fe2+及胆绿素这些中间代谢产物及胆红
素都有一定保护肝细胞，对抗氧化应激的作用[13]。
CO是一种很强的扩血管物质，作为信号介质发挥生
物学作用，可降低内脏血管阻力、增加血流灌注，
因此在氧化应激下，CO有助于舒张肝脏血管、维持
肝窦张力、保护肝细胞的微循环，减少肝组织损伤[14]。
Fe2+可以加速运铁蛋白的合成，增加细胞内铁的流
出使其免受氧化应激损伤。因此HO-1的生成对肝脏
具有保护效应。HO-1主要定位于肝实质细胞的胞浆
内，且以中央静脉周围表达最明显。本实验通过免
疫组织化学法观察了HO-1在肝组织中定位表达情
况，并定量分析了HO-1表达水平。结果显示，酒精
模型组大鼠肝脏中的HO-1表达较正常对照组明显
下降，HO-1表达受到抑制。补充LTE、甘利欣各组
大鼠肝脏中的HO-1呈弥漫性表达上调。这提示LTE
诱导肝脏HO-1表达上调使血红素降解加速，进而减
少了血红素破坏组织细胞的程度。而增多的胆绿
素、胆红素、Fe2+及CO等均有利于维护肝脏细胞的
功能，对酒精所致的肝细胞氧化损伤有保护作用。
本研究证实，LTE可增强酒精暴露大鼠体内抗
氧化酶的活性，减少脂质过氧化产物，诱导HO-1酶
活性增强，从而对酒精造成的机体氧化损伤表现出
相应的保护效应。
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法”的研究者：徐海滨研究员、王竹副研究员（中国 CDC 营养与食品安全所）、王舒然教授（哈尔
滨医科大学）、张召锋博士（北京大学）分别结合科研工作，就食品功能体内外评价方法和技术进
行了阐述，这些内容将为今后我国保健食品评价程序的改进提供借鉴。
在讨论中，与会者除了和报告者进行面对面的交流外，还就我国未来保健食品的发展、科学
评估及可能面临的主要问题展开了热烈讨论。论坛在严谨的科学氛围中展开，在开放的学术交流
中进行，在愉悦欢快的状态中结束。大会取得了圆满成功。
（中国营养学会营养与保健食品分会）