全 文 ：doi:10． 3969 / j． issn． 1006-5709． 2013． 12． 026
基金项目:山东省科技厅科技攻关项目(2006GG2302002) ;青岛市科技
局科技计划资助项目(08-2-1-5nsh)
第一作者简介:张娜，硕士，研究方向:临床营养。E-mail:byzhn @
163． com
通讯作者:梁惠，博士，教授，博士生导师，研究方向:基础营养和海洋活
性物质营养功能评价。E-mail:qdlianghui@ 126． com
凹顶藻萜类化合物对酒精暴露大鼠肝脏 bcl-2 和 bax表达的影响
张 娜1，2，梁 惠1，刘 颖3，马爱国1
1．青岛大学医学院营养研究所，山东 青岛 266021; 2．青岛市第八人民医院营养科; 3．青岛大学医学院细胞与分子生物学实验室
【摘要】 目的 了解凹顶藻萜类化合物(LTE)对酒精暴露大鼠肝脏超微结构及凋亡相关基因 bcl-2 和 bax表达水平的影响。方法
Wistar大鼠随机分组，每日予 50%酒精 4． 8 g·kg －1·d －1灌胃，建立酒精暴露模型;试验组每日分别给予 LTE 25、50、100 mg /kg
灌胃给药;正常对照组给予等体积蒸馏水。应用透射电镜观察大鼠肝细胞超微结构的变化，免疫组化染色法检测 bcl-2 和 bax表达
水平及 bcl-2 /bax值。结果 酒精模型组大鼠肝细胞脂肪变形，电镜下观察到轻度炎性细胞浸润，线粒体肿胀变形，粗面内质网扩
张断裂，试验组的肝细胞破坏程度均有不同程度减轻，bcl-2 表达水平显著升高，bax表达水平显著降低，bcl-2 /bax比值升高，差异有
统计学意义(P ＜ 0． 05)。结论 一定剂量 LTE可明显改善酒精暴露大鼠肝细胞超微结构病理变化，并使 bcl-2 /bax 上调，从而减轻
酒精性肝损伤。
【关键词】 凹顶藻萜类化合物;酒精暴露;超微结构
中图分类号:Ｒ575 文献标识码:A 文章编号:1006 － 5709(2013)12 － 1256 － 03 收稿日期:2013-02-28
The effect of Laurencia terpenoid extract on the hepatic expression of bcl-2 and bax of rats in vi-
vo after alcohol exposure
ZHANG Na1，2，LIANG Hui1，LIU Ying3，MA Aiguo1
1． Department of Nutrition，Medical College of Qingdao University，Qingdao 266021;2． Department of Nutrition，the
Eighth People’s Hospital of Qingdao;3． Laboratory of Cellular and Molecular Biology，Medical College of Qingdao Uni-
versity，China
【Abstract】 Objective To study the effect of Laurencia terpenoid extract (LTE)on the hepatic ultra-structures and
expression of apoptosis genes of rats in vivo after alcohol exposure． Methods Male Wistar rats assigned randomly to
groups were orally given with 50% alcohol of 4． 8 g /kg everyday to build alcohol exposure model;test groups were orally
fed with LTE of 25，50 and 100 mg /kg everyday respectively，normal control group was given with distilled water． The
hepatic ultra-structures of rats were studied by transmission electron microscope． The expression levels of bcl-2 and bax
in hepatic tissue were detected by immunohistochemistry method． Ｒesults The hepatic ultra-structures result showed
that hepatocytes in alcohol model group steatosis，slight inflammatory cell infiltration，mitochondria swollen deformative
and dilated rough endoplasmic fractue． Test groups showed slight destroy degree． Compared with alcohol model group，
the expression level of bcl-2 in protective LTE groups and positive control group was increased significantly (P ＜ 0． 05) ，
and the expression level of bax was decreased significantly (P ＜ 0． 05)． Conclusion LTE at certain dosages can pro-
mote mitochondria hyperplasy to improve hepatic ultra-structural pathological change，and raise the ratios of bcl-2 and
bax in hepatic tissues after alcohol exposure． So，LTE can effectively reduce the degree of injury of hepatic tissues by al-
cohol．
【Key words】 Laurencia terpenoid extract;Alcohol exposure;Ultrastructure
长期大量饮酒可导致酒精性肝损伤，可使细胞内
线粒体膜功能发生改变，导致某些细胞凋亡调控因子
释放，从而影响细胞凋亡相关基因的表达［1］。凹顶藻
萜类化合物(LTE)是一种从三列凹顶藻中分离得到的
海洋天然活性物质，已有研究表明，LTE 具有抗肿瘤、
抑菌、调节免疫和抗氧化等多方面的生物活性［2］，但
关于 LTE对细胞损伤超微结构修复作用的研究，国内
外尚未见报道。我们前期从采自中国南海的三列凹顶
藻(Laurencia tristicha tseng)中得到含量丰富的萜类化
合物提取物［3］。本研究建立酒精暴露大鼠模型，观察
LTE对大鼠肝脏超微结构及凋亡相关基因表达的影
响，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1． 1 试剂和仪器 LTE 由中国科学院海洋研究所提
供并鉴定，总萜含量为 63． 29%。兔抗鼠 bcl-2、bax 多
克隆抗体、PV-6000 免疫组化试剂盒、3，3-二氨基联苯
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胺(DAB)显色试剂盒均购自北京中山公司;甘利欣
(甘草酸二胺胶囊)购自江苏正大天晴药业股份有限
公司。透射电镜(型号 JEM-1200EX)和图像采集系统
(型号 150ES)为日本 Jeol 公司和 Olympus 公司产品;
显微图像分析系统为美国 Pixera公司产品。
1． 2 实验方法 SPF 级雄性 Wistar 大鼠 60 只，体质
量 180 ～ 200 g，由青岛市实验动物中心提供。适应性
喂养 7 d后，取 10 只为正常对照组，每日蒸馏水灌胃 1
次;其余大鼠每日给予酒精 4． 8 g /kg 灌胃，造酒精暴
露模型，酒精浓度为 50%(V /V) ，计算公式为:酒精剂
量 = 12 ml /kg(灌胃容积)× 50%(酒精浓度)× 0． 8 g /
ml(酒精密度)。造型大鼠分为 5 组，试验组每日分别
给予 LTE 25、50、100 mg /kg，酒精溶解，剂量同酒精模
型组;阳性对照甘利欣药物组，每日给予甘利欣 200
mg /kg，酒精溶解。灌胃量每日 12 ml /kg，实验进行 6
周。末次灌胃后禁食不禁水，12 h 后称重，20%乌拉
坦腹腔注射麻醉，快速取新鲜肝组织 － 80 ℃ 保存
备用。
1． 3 检测指标及方法
1． 3． 1 肝组织超微结构:取各组肝组织样品，体积均
为 1 mm ×1 mm ×1 mm，3%戊二醛固定 4 h，PBS漂洗
3 次;1%锇酸固定 1 h，PBS 漂洗 3 次;丙酮梯度脱水，
环氧树脂(EPON812)包埋，温箱固化，超薄切片，醋酸
双氧铀柠檬酸铅染色，透射电镜观察大鼠肝细胞超微
结构。
1． 3． 2 肝组织 bcl-2 和 bax 表达检测:采用免疫组化
染色法，按照 bcl-2 和 bax检测试剂盒说明书操作。应
用图象分析软件进行图像分析，每张切片随机选择 10
个高倍视野，以组织间质空白处入射光的值为定标，测
定每个视野的光吸收密度值，取平均值作为该切片的
测定值。切片光吸收密度值与肝组织细胞中 bcl-2 及
bax表达水平呈正相关。
1． 4 统计学分析 采用 SPSS 11． 5 及 PPMS 1． 5［4］统
计学软件进行数据处理，组间比较用单因素方差分析，
两两比较采用 q检验，P ＜ 0． 05 为差异有统计学意义。
2 结果
2． 1 各组肝组织透射电镜超微结构观察 正常对照
组肝细胞核呈圆形或椭圆形，核膜完整，核孔清晰可
见，核仁清晰;细胞内细胞器完整，核糖体丰富，内质网
结构正常;线粒体嵴结构清晰;偶见小脂滴。酒精模型
组显示细胞浆内充满多量大小不一的脂滴，细胞器明
显减少;内质网扩张断裂，似花斑状;线粒体肿胀变形，
嵴断裂模糊;核糖体颗粒脱落，部分核膜断裂、结构模
糊，核孔消失;血窦 Kupffer 细胞旁胶原纤维增多。与
酒精模型组比较，各种剂量 LTE 干预组显示核膜较清
晰，核孔改变不明显;线粒体结构大体正常，偶尔可见
肝细胞胞浆内脂滴(见图 1)。100 mg /kg LTE 干预组
大鼠肝细胞内脂滴少见，线粒体数目明显增多。
图 1 各组肝组织透射电镜超微结构观察 A:正常对照组;B:酒精模型组;C:LTE干预组(50 mg·kg －1·d －1)
Fig 1 Ultrastructure tem observation of liver tissue in all groups A:normal control group;B:alcohol model group;C:LTE inter-
vention group (50 mg·kg －1·d －1)
2． 2 各组肝组织 bcl-2 和 bax 表达水平比较 酒精
模型组的 bcl-2 阳性表达水平较正常对照组显著降低
(P ＜ 0． 05) ;与酒精模型组比较，各剂量 LTE干预组和
甘利欣药物组的 bcl-2 阳性表达水平均升高，差异有统
计学意义(P ＜ 0． 05)。酒精模型组的 bax 阳性表达水
平较正常对照组升高，中、高剂量 LTE 干预组和甘利
欣药物组的 bax阳性表达水平均较酒精模型组显著降
低，差异有统计学意义(P ＜ 0． 05)。低、中、高剂量
LTE干预组的 bcl-2 /bax比值依次增大，明显大于酒精
模型组;中剂量 LTE 干预组与甘利欣药物组的 bcl-2 /
bax比值基本一致(见表 1、图 2 ～ 3)。
表 1 各组大鼠 bcl-2 和 bax表达水平的比较(x ± s)
Tab 1 The comparison of the expresson levels of bcl-2 and bax in the rats of all groups (x ± s)
组别 例数 bcl-2 bax bcl-2 /bax
正常对照组 10 0． 1740 ± 0． 0024 0． 1907 ± 0． 0012 0． 9124
酒精模型组 10 0． 1357 ± 0． 0014a 0． 2189 ± 0． 0032a 0． 6199
LTE 25 mg /kg组 10 0． 1615 ± 0． 0017b 0． 2132 ± 0． 0016 0． 7575
LTE 50 mg /kg组 10 0． 1727 ± 0． 0019b 0． 2018 ± 0． 0017b 0． 8558
LTE 100 mg /kg组 10 0． 1786 ± 0． 0013b 0． 1998 ± 0． 0018b 0． 8939
甘利欣药物组 10 0． 1714 ± 0． 0012b 0． 1982 ± 0． 0015b 0． 8579
注:与正常对照组比较，a P ＜ 0． 05;与酒精模型组比较，b P ＜ 0． 05。
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图 2 各组大鼠肝细胞 bcl-2 表达水平(DAB 染色，200 ×) A:正常对照组;B:酒精模型组;C:LTE 25 mg /kg 组;D:LTE 50 mg /kg
组;E:LTE 100 mg /kg组;F:甘利欣组;图 3 各组大鼠肝细胞 bax表达水平(DAB染色，200 ×) A:正常对照组;B:酒精模型组;C:
LTE 25 mg /kg组;D:LTE 50 mg /kg组;E:LTE 100 mg /kg组;F:甘利欣组
Fig 2 The expression levels of the liver of bcl-2 in the rats of all groups (DAB vital staining，200 ×) A:normal control group;B:
alcohol model group;C:LTE intervention group (25 mg /kg) ;D:LTE intervention group (50 mg /kg) ;E． LTE intervention group (100
mg /kg) ;F:diammonium glycyrrhizinate group (200 mg /kg) ;Fig 3 The expression of bax in the liver cell of the rats of all groups
(DAB vital staining，200 ×) A:normal control group;B:alcohol model group;C:LTE intervention group (25 mg /kg) ;D:LTE inter-
vention group (50 mg /kg) ;E:LTE intervention group (100 mg /kg) ;F:diammouium glycyrrhizinate group (200 mg /kg)
3 讨论
长期大量饮酒对机体多种器官具有毒害作用，其
中尤以对肝脏的损伤最为严重。超微病理表现为肝细
胞内有脂滴沉积，线粒体肿胀［5］，本文结果显示成功
建立了酒精暴露的肝损伤大鼠模型。100 mg /kg LTE
干预组肝细胞内线粒体数目显著多于酒精模型组，细
胞内脂滴减少。说明 LTE 能够促进肝细胞内线粒体
增生，加快酒精的代谢，减轻酒精对肝细胞的损伤。
bcl-2、bax 基因是 bcl-2 家族的一组凋亡调节基
因，调节细胞凋亡不仅取决于自身表达的高低，而且还
与 bcl-2 /bax 值有关，bcl-2 /bax 值越低，细胞越易凋
亡［9］。本文结果显示，酒精模型组 bcl-2 /bax比值明显
降低，提示乙醇对大鼠肝组织的损伤可能是通过启动
bcl-2 /bax凋亡途径促进肝细胞凋亡而实现的。随着
LTE的剂量增高，bcl-2 /bax 比值逐渐升高，表明 LTE
可增强乙醇损伤的大鼠细胞 bcl-2 的表达水平，降低
bax的表达水平，从而抑制肝细胞凋亡。提示 LTE 对
酒精性肝损伤的保护作用，可能是通过抑制 bcl-2 /bax
凋亡途径的启动来实现的。
综上所述，一定剂量的 LTE 能够促进酒精性肝损
伤动物肝细胞线粒体增生，使肝脏 bcl-2 表达增高、bax
表达降低，提高 bcl-2 /bax 值，从而改善酒精暴露大鼠
肝细胞超微结构的病理变化，抑制细胞凋亡，减少酒精
对肝细胞的损伤程度，起到对酒精性肝损伤的保护
作用。
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