全 文 ：第 卷 第 期 中 国 海 洋 大 学 学 报
年 月 〕 汇 ,
研究简报
龙须菜微卫星 的初步研究 `
逢巧巧, 隋正红” ,张学成 ,孔繁娜
中国海洋大学海洋生命学院 , 山东青岛
摘 要 为从龙须菜中分离含微卫星 的片段采用了 种方法 ,总共筛选了 个克隆。其中应用地高辛标记探
针 ,通过菌落原位杂交方法 ,筛选得到 个克隆 ,测序结果显示仅有 个克隆含有微卫星 方法筛选出 个克
隆 ,测序显示有 个克隆含有微卫星 。在总共测序的 个克隆中共有 个微卫星序列 ,每个克隆中含有的微卫星
〕 在 个不等 。核心序列重复次数在 次 含 次 以上的微卫星有 个 ,重复次数在 不等 ,重复次数在
次之间的微卫星有 个 。在获得的微卫星序列中 重复占 , 重复仅占 。完全型微卫星 个 ,占
不完全型微卫星 个 ,占 复合型微卫星 个 ,仅占 。龙须菜微卫星 的含量较低 。
关健词 龙须菜 微卫星 菌落原位杂交
中图法分类号 文献标志码 文章编号 一 一 一
微卫星 或称简单序列重复
, 是指由 一 个核昔酸
组成的简单串联重复 序列 。迄今研究过的所有
物种中都发现了它的存在并且分布密度很大 。由于
微卫星具有多态性丰富 ,遵循孟德尔遗传规律 ,共显性
遗传等特点 ,已成为种群分化 、家系分析 、基因连锁分
析 、进化研究中使用最为广泛的遗传标记之一 。科学
家们已经应用微卫星标记构建了大豆周 、大麦图 、水
稻 、玉米 〔一口等的遗传连锁图 。同样 ,在一些海洋经济
动物中 ,如罗非鱼 一 、虹缚 、鳃科鱼类 `“〕和长牡
砺 〔` 〕等 ,也已经利用微卫星标记构建了遗传连锁群图
谱 ,并且应用微卫星标记对一些重要的经济性状进行
了 定位 。大型经济海藻的相关研究已经开展 ,早
在 年就有应用微卫星进行 ` 物
种鉴定的报道 口在紫菜中也通过筛选 库开发出
微卫星标记位点 ,并构建了不同地理种群的系统树 〕
最近在海带中应用微卫星标记进行了不同品种间的遗
传多样性分析和比较哪〕。但是与陆地植物和海洋经济
动物相比 ,关于藻类微卫星的研究和应用比较滞后 。
龙须菜 属于红藻 门 中的江篱属
,具有重要的经济价值 习,可以从 中提取
藻红蛋白 、藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白等具有重要医用和
药用价值的成分 ,还可以用做鲍鱼的饵料 ,而龙须菜最
重要 的经 济价值 在于 其能 够生产 高质 量 的琼 胶
。本文报告构建龙须菜含微卫星 片段的
富集文库 ,然后用菌落原位杂交和 方法筛选龙须
菜微卫星序列 ,并进行了序列分析 ,希望能够通过进一
步的研究开发出微卫星标记位点 ,应用到龙须菜的遗
传多样性分析 、遗传连锁图谱的构建以及龙须菜优良
品种的选育中 。
材料与方法
龙须菜基因组 的提取
实验所用的龙须菜采自青岛市湛山湾 ,用海水洗
净后放进装满干净海水的容器里 ,于 一 ℃储存备
用 。基因组 提取采用的是 等的红藻基
因组 的提取方法 口。剪取 的龙须菜 ,用
蒸馏水洗 次 ,吸干表面水分后在液氮中充分研磨 ,加
人 胖 提取缓冲液 的 一 、
的 、 的 和
拜 ,再加入 拌 蛋白酶 。
混匀 , 水浴间断振荡 。 离心
,取上清 。用等体积的酚 、酚 氯仿 异戊醇
八 、氯仿各抽提 次 , 倍体积的无水乙醇沉淀 ,
乙醇洗沉淀 ,干燥后溶于 拜 中 ,加 拌
的 消化 ,酚氯仿抽提 。
富集文库的构建
, 卜片段 的分离和扩增 本实验采用了
基金项目 国家高技术研究发展计划项目 。。 资助
收稿 日期 一 一 修订日期 一 一
作者简介 逢巧巧 一 ,女 ,硕士生 。
通讯作者
78 中 国 海 洋 大 学 学 报 年
种方法对基因组 进行剪切 , 种是用 酶切
公司生产 ,总体系为 拜 酶 ,
拜 , 拜 , 酶切过夜 。另一种
是用超声破碎将基因组 剪切 ,将 拼 溶于
拌 的 中 ,破碎功率为 ,超声处理
,间隔 ,超声处理 为 组 ,共处理 组 ,每组间
有 的间隔 。应用 公司的
将 片段的末端补平 , 种方法处理的 都
用 胶回收试剂盒回收所需片段 。将接头连接
于回收的 片段两端 ,接头由上海生工合成 ,序列
为 条 一 单链短核昔酸 乞
一 以下称 和 条 端磷酸
化的 一 的单链短核昔酸 乞
了以下称 退火形成 ,称
为 。接头连接体系如下 片段 、
连接酶 拌 、 、 拜 、
补至 拜 , ℃接头连接过夜 。然后用 为引物 ,
对小片段 扩增 。 反应体系 连接产物 “ 、
拌 、 拌 、 的
拌 、 的 拼 、 、
聚合酶酶 、 补至 拼 。 反应程
序如下 预变性 、 、 、
, 个循环 ,最后 延伸
含微卫星 片段的富集 微卫星 探
针 。和 。各取 拌 拌 ,点在
的 杂交膜上 ,自然晾干后于
烘 ,将探针固定在膜上 。
将固定好探针的 膜放在杂交液
体积分数 的甲酞胺 、 质量浓度 的 、 、
的磷酸钠 中 预杂交 ,
然后将膜在 的 中沸浴 ,去除没有与膜
结合牢固的探针 。
将富集好的小片段 在沸水浴中煮沸 ,
然后迅速置于冰面上 ,使其变性 。然后将其加到
拜 的杂交液中 ,加人预杂交好的 膜 , ℃
杂交 ,然后洗膜 。洗膜采用如下步骤 用 拜
的 , 质量浓度 洗涤液在 ℃下洗涤
次 ,每次 ,每 晃动 次 用 拌 的
, 质量浓度 洗涤液在 ℃下水浴
最后用 拌 洗脱液在 下煮
洗脱与探针结合的微卫星序列 。将洗脱的含有微卫星
序列的 溶液浓缩为 拌 ,取 拌 以接头为引
物进行 扩增 ,反应体 系跟反应程序 同小片段
的富集 。
连接 ,转化 将富集后的含有微卫星的
片段连接到 一 载体 ,并转化到 。菌株制作
的感受态细胞中 ,涂布含有 。氨节青霉素的固体
培养基上 , ℃培养 。
菌落原位杂交和 方法筛选含微卫星 的
克隆
菌落原位杂交筛选含微卫星 的克隆
微卫星探针 。和 。用地高辛标记和检测试剂
盒
卜 进行标记 ,标记体系为
拌 , 拌 ,用水补至 拼 , 温浴
。将富集文库转化平板长出的菌落保存到母板
上 ,然后将母板上的菌落影印到 膜上 ,同
时与标记的微卫星探针 。和 。杂交 ,显色后
选取阳性菌落测序 。根据杂交膜的大小加杂交液 ,
℃预杂交 后 ,加人新杂交液和探针 ℃杂
交过夜 ,洗膜后用 显色 。杂交 、洗膜 以及
显色的具体方法均按照试剂盒说明进行 。
方法筛选微卫星 通过菌落
筛选微卫星富集文库中含有微卫星 的克隆 。所
用的引物为单向通用引物和 。或者 。,这样
可以筛选出含有微卫星 的克隆 筛选 。将
筛选出来的克隆用双向通用引物做检测 ,检测插
人的微卫星 是否有侧翼序列 检测 ,选取
筛选 和检测 二 的条带之间有明显差异的克隆
测序 。
筛选 和检测 均为 拌 反应体系
拜 、 拌 、
乏拜 、引物各 拌 、 、 聚合
酶 、菌液 。 拌 。 反应程序均为 ℃预变性
、 、 、 , 个循环 ,最
后 延伸 `
实验结果
小片段 的分离和扩增
提取的基因组 如图 所示 基因组 超
声破碎后 ,多分布在 一 的范围内 ,主带消
失 ,如图 所示 基因组 完全酶切后主带消失 ,
呈弥散分布如图 所示 。取 拌 的基因组 分
别使用酶切和超声破碎的方法剪切 ,并 回收 一
的片段 ,并进行末端补平 。 种处理回收的
片段均浓缩为 拌 体系 ,加接头连接后取 拌
进行 预扩增 ,出现明显的 亮带 ,片段集中在
一 范围内 见图 。
逢巧巧 等 龙须菜微卫星 的初步研究
次 以上的有 个 ,重复次数在 一 不等 ,均为
个碱基重复 。 重复有 个 , 重复仅有
个 。重复次数在 一 次之间的微卫星有 个均为
重复 。各种重复的种类及数量如表 所示 。
表 龙须菜微卫星序列的种类及数
《 表示核心序列的重复次数
。
图 小片段 的分离和扩增过程检测结果
, 龙须菜基因组 入 基因组 超声破碎结
果 基因组 酶切结果
连接后预扩增产物
, , , 入 二
卿
亡 一
核心序列 类型 微卫星的数量 个 小计 个
一
, 完全型
不完全型
完全型
不完全型
复合型
含有微卫星 的富集以及文库的构建
将 拜 小片段 的 产物变性与固定
在杂交膜上的探针进行杂交 ,洗脱的杂交片段用 巧 肛
的 将其溶解 ,取 拼 做模版 ,进行 扩增 ,将
产物与 一 载体连接 ,转化 ,共获得 个 白
色菌落 。取 个菌落进行 扩增 ,检测插人片段
的大小在 一 的范围内 见图 。
合计
图 富集文库插人片段大小检测
微卫星克隆的分离及其特性
实验采用菌落原位杂交的方法对 个菌落进行
杂交 ,获得 个阳性菌落 ,选择其中 个信号较特
异的菌落进行测序 ,只有 个克隆含有微卫星序列 。
通过菌落 对转化获得的 个白色菌落进
行筛选 ,共筛选出 个出现重复序列条带的克隆 ,将
这些克隆再做检测 进行检测 ,共获得 个阳性
克隆 ,即通用引物扩增条带与重复序列扩增条带长度
不同的克隆 ,从中选取条带长度差异较大的克隆 个
进行测序 ,有 个克隆含有微卫星 。
在测序的总共 个克隆中共有 个微卫星位
点 ,每个克隆中含有的微卫星 在 一 个不等 。
每个微卫星 的核心序列重复次数在 次 含
讨论
实验中使用了 种探针 。和 。,而所获
得的两碱基的重复绝大多数为 重复 ,占总数
的 , 重复仅有 个 占 ,这与其它文献
中提到的双核昔酸在植物中多以 或
重复 ,而动物中多以 重复相吻合 〔 〕。与
等报道的 、中多为 重复也相
吻合 〔`口。
实验所获得的微卫星序列中完全型 微卫
星有 个 ,占 不完全型 微卫星有
个 ,占 复合型 微卫星有 个 ,
仅占 ,这与其他植物和动物以及海洋生物中的报
道基本吻合 。
除了两碱基重复以外 ,还得到一些四碱基重复 ,多
为 重复 ,共 个 ,但重复次数均
次 , 个 重复 ,重复次数为 次和 次 , 个
重复 ,重复次数为 一 次 。另外还发现 个小
卫星 ,重复次数在 一 次之间 。这些多个碱基的重复
与其他两碱基重复距离一般都很近 ,多不超过 个碱
基 ,但是与之相邻的两碱基重复和这些多碱基重复不
能构成复合微卫星 。
实验用地高辛标记对 个菌落通过菌落原位杂
交进行筛选 ,有 。个 出现阳性信号 ,取 个
克隆测序 ,仅有 个含有微卫星 ,假阳性达到
以上 ,因此地高辛标记检测并不适合应用于龙须
菜微卫星的筛选 。与地高辛标记相比较 ,荧光标记的
中 国 海 洋 大 学 学 报 年
特异性更高 ,更适合应用于菌落原位杂交 。用 筛
库的方法筛选微卫星 , 个克隆中最终确定为阳性的
有 个 ,仅为 ,用于测序的 个克隆中有
个含有微卫星 ,假阳性的现象明显减少 。另外采
用 的方法进行筛选还能够根据扩增片段的长度
估计侧翼序列的大小 ,进而初步估计是否有足够的侧
翼序列设计引物 。但是这种方法费时费力 ,如果进行
大量的筛选 ,工作就会很大 ,成本也较高 。
本次实验共获得了 个克隆 ,对其中 。个
进行了筛选 ,仅获得 个含有微卫星 的插人序
列 ,得率仅有 ,这种筛选微卫星 的方法得
率较低 ,多用于微卫星 含量丰富的物种 ,而植物
中的微卫星含量比较低 ,使用这种方法筛选微卫星
难度较大 〕。因此目前在筛选微卫星 的
时候 ,多采用磁珠富集的方法 。磁珠富集 片段是
基于磁珠表面的链亲和素与标记于 探针上的生物
素之间的共价结合 ,该法简单 、高效 ,适合应用于微卫
星含量不高的物种皿〕。
一般而言植物基因组中微卫星的含量不如动物丰
富 ,仅为动物的 左右 〕。有研究证明微卫星在基
因组中的丰富程度与进化程度具有一定的相关性 ,一
般而言越低等 ,基因组越小的物种微卫星含量就越
少 〕。本实验进行了大量的筛选工作 ,但是获得的微
卫星序列却很少得率仅为 ,可以证明龙须菜的微
卫星 含量较低 ,与其较低的进化程度有相关性 。
一般而言藻类在遗传进化中的地位低 ,其微卫星标记的研究比动物 、植物 ,包括海洋生物如海参 、扇贝 ,以及
鱼虾类等的难度大 ,研究水平滞后 ,有待于进一步加
强 。
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7 期 逢巧巧 ,等 龙须菜微卫星 的初步研究
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责任编辑 于 卫