全 文 ：第 4卷　第 10期 环境 工 程学 报 Vol.4, No.1 0
2 0 1 0年 1 0月 ChineseJournalofEnvironmentalEngineering Oct.2 0 1 0
乙酰甲胺磷对斜生栅藻的毒性
及细菌降解研究
于彩虹 1　李　浩1　张显涛1　周　昭 1　瞿唯刚 2
林荣华 2　王晓军 2　姜　辉 2　王长宾 2
(1.中国矿业大学(北京)化学与环境工程学院 ,北京 100083;2.农业部农药检定所 ,北京 100125)
摘　要　采用血球计数法测定斜生栅藻细胞数目 ,研究了乙酰甲胺磷对斜生栅藻的毒性作用 , 并通过藻类培养液中接
种经过筛选得到的乙酰甲胺磷高效降解菌测定其对乙酰甲胺磷毒性的去除影响。研究结果表明 , 乙酰甲胺磷对斜生栅藻
的抑制中浓度(EC50)大于 159mg/L, 急性毒性为低毒。但进一步研究发现 , 在 7 d后 , EC50为 174.68 mg/L, 明显低于 24 h
的 1 128.57 mg/L,存在亚慢性毒性。通过藻类培养液接种高效降解菌 Y-6,乙酰甲胺磷对藻类的生长抑制程度减轻。
关键词　乙酰甲胺磷　斜生栅藻　毒性　细菌降解
中图分类号　X172　　文献标识码　A　　文章编号　1673-9108(2010)10-2397-04
StudyontoxicityofacephatetoScenedesmusobliquus
anddegradationofbacteriatoacephate
YuCaihong1　LiHao1　ZhangXiantao1　ZhouZhao1　QuWeigang2
LinRonghua2　WangXiaojun2　JiangHui2　WangChangbin2
(1.ColegeofChemistryandEnvironmentalEngineering, ChinaUniversityofMiningandTechnology(Beijing), Beijing100083, China;
2.InstitutefortheControlofAgrochemicals, MinistryofAgriculture, Beijing100125, China)
Abstract　Astudywascarriedouttodeterminethetoxicityofacephatetothealgae, Scenedesmusobliquus,
makinguseofamicroscopewithcountingchamber.AndastrainofbacteriadesignatedasY-6 wasaddedinto
thesolutiontoevaluatetheefectofdegradingacephate.Itwasshownthatthemedianinhibitionconcentrations
(EC50)weremorethan159 mg/Linslightlyacutetoxicity.Thefurtherresultshowedthatacephatewassub-
chronictoxicitytoalgaewiththeEC50 of7 d(174.68 mg/L), whichwassignificantlylowerthanEC50 of24h(1 128.57mg/L).Whenthehigh-degradingbacteriaY-6wasinoculatedintothesolution, theinhibitionofal-
agebyacephatewaseased.
Keywords　acephate;Scenedesmusobliquus;toxicity;bacteriadegradation
基金项目:国家高技术研究发展计划(863)项目(2007AA10Z404);
中国矿业大学(北京)“大学生创新实验 ”项目(091208g)
收稿日期:2009-10-22;修订日期:2009-12-01
作者简介:于彩虹(1973 ～ ), 女 ,副教授 , 研究方向为环境微生物。
E-mail:caihongy@yahoo.com.cn
　　乙酰甲胺磷是一种广谱性有机磷杀虫剂 ,为甲
胺磷的 N-乙酰基衍生物 。作为 5种高毒农药的替
代产品 , 2007年乙酰甲胺磷在中国的产量仅有
4 000 t,近年来产量逐年剧增 ,有望成为万吨农药大
品种[ 1] 。乙酰甲胺磷具有易溶于水 、在土壤中易淋
溶的特性[ 2] ,存在对水体造成污染的可能性 。随着
乙酰甲胺磷在中国的大量生产和使用 ,相关的农药
废水的处置 、食品和环境中乙酰甲胺磷的残留会越
来越突出 ,且农药给环境带来的副作用将在使用后
的很长时间显现出来 。因此 ,有必要尽早对乙酰甲
胺磷开展相关的环境安全评价及其污染物的去除
研究。
土壤中的乙酰甲胺磷主要是依靠微生物降解 ,
所以利用生态系统中微生物代谢类型的多样性 、生
化适应能力的极强性以及能迅速产生相应酶系的应
急性 ,来快速降解各类人工合成的农药 ,使其完全矿
化成无机物 ,是目前最有潜力 、最有效的研究方法之
一 [ 3, 4] 。因此 ,分离筛选具有高效降解乙酰甲胺磷
农药的微生物 ,对消除农药污染 、净化环境及社会的
可持续发展具有重要的现实意义 。而迄今为止 ,人
们对于乙酰甲胺磷的微生物降解菌的研究较少 。
环 境 工 程 学 报 第 4卷
斜生栅藻 (Scenedesmusobliquus)是一种常用的
指示生物 ,具有对毒物敏感 、个体小 、繁殖快 、培养方
便的特点 ,可较短时间内得到化学物质对其世代及
种群水平影响的评价[ 5, 6] 。本文研究了乙酰甲胺磷
对斜生栅藻的急性和亚慢性毒性 ,并通过测定斜生
栅藻种群数量变化验证筛选菌株对乙酰甲胺磷的降
解能力 ,为微生物修复乙酰甲胺磷造成的污染提供
理论和实践支持 。
1　实验部分
1.1　实验材料与药品
斜生栅藻(S.obliquus),农业部农药检定所生
物技术研究测试中心周年连续续代培养。使用水生
4号培养基 ,每 1 000 mL储备液(10倍)含硫酸铵
(NH4)2SO4 2 g,过磷酸钙饱和液 Ca(H2PO4 )2 ·
H2O· (CaSO4·H2O)10 mL,硫酸镁 MgSO4· 7H2O
0.80g,碳酸氢钠 NaHCO3 1 g,氯化钾 KCl0.25 g,
三氯化铁 1%溶液 FeCl3 1.50mL,土壤浸出液 5mL,
其中土壤浸出液:用园田土和水以 1∶1混合 ,充分摇
匀 ,静置澄清 24h,取上清液过滤。滤液高压蒸汽灭
菌后贮存备用 ,使用期 1年 。
95%乙酰甲胺磷原药 ,由山东华阳科技有限公
司提供 。
其他试剂均为分析纯 ,购自北京中北林格生物
科技有限公司。
1.2　毒性测定方法
参考 OECD方法 ,采用血球计数板法测定乙酰
甲胺磷对斜生栅藻的抑制作用 。向三角瓶中加入浓
度为 0、1 000、2 000、3 000、4 000和 5 000 mg/L的
乙酰甲胺磷药液和藻液各 20 mL,设置 3个重复 ,初
始藻量控制为 2×104个 /mL。将三角瓶置于恒温
光照培养室中(水温 21 ～ 24℃,采用持续光照 ,光强
4 440 ～ 8 880 Lux),每天手动摇晃 5 ～ 6次。于第
24 h、48 h、96 h、7d、10 d和 14 d分别取样 ,在显微
镜下用血球计数板准确计数藻细胞数 ,测定各浓度
藻类浓度 ,并计算 EC50。
1.3　微生物降解作用测定
1.3.1　培养基
KNO3 1g, (NH4)2SO4 0.5 g, KCl0.5 g,酵母粉
0.05g。
1.3.2　方法步骤
参考 1.2。其中 ,溶液配制为:将乙酰甲胺磷降
解菌中筛选的 Y-6进行液体培养 , 5d后利用分光光
度计在 600nm测定其 OD值 ,并将菌液分别稀释 2
倍和 4倍 。向三角瓶中加入浓度为 1 000 mg/L和 5
000mg/L的乙酰甲胺磷药液和藻液各 20 mL,加入
稀释 2倍的菌液 10mL,设置 3个重复 ,此时接菌量
为 10%;向三角瓶中加入浓度为 1 000 mg/L和
5 000 mg/L的乙酰甲胺磷药液和藻液各 20 mL,加
入稀释 4倍的菌液 10 mL,设置 3个重复 ,此时接菌
量为 5%。
1.4　统计方法
对于加入不同浓度乙酰甲胺磷与对照的斜生栅
藻溶液中藻浓度差异 、接入降解菌与未接菌的乙酰
甲胺磷处理斜生栅藻溶液中藻浓度差异都采用双样
本 t检验进行差异显著性检验。
2　实验结果
2.1　乙酰甲胺磷对斜生栅藻的毒性测定
用 1 000、2 000、3 000、4 000和 5 000 mg/L乙
酰甲胺磷农药对斜生栅藻处理 ,随着农药浓度的升
高 ,藻浓度逐渐降低 ,即农药对藻类的毒性逐渐增
大;随着时间的延长 ,各加药组藻浓度总体也呈逐渐
减少状态 ,至第 14 d, 5 000 mg/L组藻浓度为 0。测
定 EC50分别为 1 128.57、 721.51、605.62、 174.68、
79.53和 89.49 mg/L(表 1),按照《化学农药环境安
全评价试验准则 》规定急性毒性属于低毒等级 。
但是 ,与对照双样本 t检验 ,发现进行在 1 000
～ 5 000mg/L浓度下 ,斜生栅藻数量随时间增加表
现出显著差异 (P<0.05)或极显著差异 (P<
0.01)。 1 000 mg/L处理浓度下从第 7 d开始表现
出极显著差异;4 000 mg/L下 ,从 96 h即表现为极
显著差异 ,而 5 000mg/L处理自 24h即表现出差异
显著 , 48h后 5次检测都表现为与对照极显著差异
(图 1)。以上结果表明乙酰甲胺磷农药对斜生栅藻
数量增长具有明显的抑制作用 ,存在亚慢性毒性。
表 1　乙酰甲胺磷对斜生栅藻毒性测定
Table1　Toxicityofacephateto
Scenedesmusobliquus
测定时间
(d) b值
EC10
(mg/L)
EC50
(mg/L)
EC90
(mg/L)
相关
系数
1 1.92 241.79 1 128.57 5 267.69 0.997
2 1.76 134.88 721.51 3 859.59 0.999
4 2.17 231.79 905.62 3 538.315 0.988
7 1.35 19.645 174.68 1 553.275 0.993
10 1.20 6.77 79.53 934.13 0.998
14 1.53 13.08 89.49 618.47 0.999
2398
第 10期 于彩虹等:乙酰甲胺磷对斜生栅藻的毒性及细菌降解研究
＊表示显著差异(P<0.05, n=5, t检验);＊＊表示极显著差异(P<0.01, n=5, t检验)
图 1　不同浓度乙酰甲胺磷对斜生栅藻的抑制作用
Fig.1　InhibitionofacephateindiferentconcentraionstoScenedesmusobliquus
2.2　降解菌对斜生栅藻浓度的影响
2.2.1　接菌量 5%对对斜生栅藻浓度的影响
表 2表明 ,在 1 000 mg/L乙酰甲胺磷处理的斜
生栅藻中接菌量为 5%时 ,前 96 h藻浓度变化不明
显 , 7 d后藻浓度增长加快 ,显著高于与 1 000 mg/L
乙酰甲胺磷处理的斜生栅藻。接菌在 24 h、48 h、
96 h、7d、10 d和 14 d的藻浓度比值分别是未接菌
处理藻浓度的 0.79、 0.67、 1.28、 2.54、 4.00和
5.80倍 。
表 2　接入 5%乙酰甲胺磷降解菌菌液对
藻类浓度的影响
Table2　Influenceofacephatewith5% degrading
bactericaonScenedesmusobliquus
(104个 /mL)
农药浓度(mg/L)
+接菌量 1d 2d 4d 7d 10d 14d
1 000+5% 2.2 2 4.6 6.6a 8.8A 11.6A
1 000 2.8 3 3.6 2.6 2.2 2
比值 0.79 0.67 1.28 2.54 4.00 5.80
5 000+5% 1.2 1.4a 0.8a 1.2A 1.4A 1.8A
5 000 0.6 0.6 0.4 0.2 0.2 0
比值 2.00 2.33 2.00 6.00 7.00 -
　　a表示显著差异(P<0.05, n=5, t检验);A表示极显著差异(P
<0.01, n=5, t检验)
　　在 5 000 mg/L乙酰甲胺磷处理的斜生栅藻中
接菌量为 5%时 ,从 48h起 ,接菌的斜生栅藻溶液中
藻浓度显著或极显著高于未接菌的 5 000 mg/L乙
酰甲胺磷处理斜生栅藻溶液。接菌在 24 h后的藻
浓度比值即达到未接菌处理藻浓度的 2倍以上 。
2.2.2　接菌量 10%对斜生栅藻浓度的影响
表 3表明 ,在 1 000 mg/L乙酰甲胺磷处理的斜
生栅藻中接菌量为 10%时 ,从 96h藻浓度即显著或
极显著高于与 1 000 mg/L乙酰甲胺磷处理的斜生
栅藻。接菌在 24 h、48 h、96 h、7 d、10 d和 14 d的
藻浓度比值分别是未接菌处理藻浓度的 0.79、
1.00、1.61、2.85、4.55和 6.80倍 。
在 5 000 mg/L乙酰甲胺磷处理的斜生栅藻中
接菌量为 10%时 ,从 48 h起 ,接菌的斜生栅藻溶液
中藻浓度显著或极显著高于未接菌的 5 000 mg/L
乙酰甲胺磷处理的斜生栅藻溶液。当 5 000 mg/L
乙酰甲胺磷处理的斜生栅藻在 14 d测定值为 0时 ,
接菌处理达到 3.2 ×104个 /mL。利用筛选的微生
物(Y-6)处理乙酰甲胺磷 ,能够降低乙酰甲胺磷对
斜生栅藻的抑制作用 。
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环 境 工 程 学 报 第 4卷
表 3　接入 10%乙酰甲胺磷降解菌菌液对藻类
浓度的影响
Table3　Influenceofacephatewith10% degrading
bactericaonScenedesmusobliquus (104 /mL)
农药浓度(mg/L)
+接菌量 1d 2d 4d 7d 10d 14d
1 000+10% 2.2 3 5.8a 7.4A 10A 13.6A
1 000 2.8 3 3.6 2.6 2.2 2
比值 0.79 1.00 1.61 2.85 4.55 6.80
5 000+10% 1 2.4a 1.4a 1.8A 2.2A 3.2A
5 000 0.6 0.6 0.4 0.2 0.2 0
比值 1.67 4.00 3.50 9.00 11.00 -
　　a表示显著差异(P<0.05, n=5, t检验);A表示极显著差异(P
<0.01, n=5, t检验)
3　结　论
(1)乙酰甲胺磷对指示生物斜生栅藻急性毒性
水平为低毒 ,但是在 7 ～ 14d具有明显的抑制作用 ,
乙酰甲胺磷对藻类的长期毒性有待于进一步研究。
(2)接入乙酰甲胺磷降解菌后 ,乙酰甲胺磷对
斜生栅藻的抑制作用明显减弱 ,证明 Y-6对乙酰甲
胺磷具有较好的降解作用 。
参 考 文 献
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2400