全 文 ：农杆菌介导转化石斛兰 —蝴蝶兰杂交种类
原球茎体的研究
曹　颖 ,胡尚连 ,孙　霞 ,卢学琴 ,韩　颖
(西南科技大学生命科学与工程学院 ,四川 绵阳 621000)
摘要:以类原球茎体为受体材料 , 利用农杆菌 EHA101(pIG121Hm)介导转移 GUS 基因到石斛兰-蝴蝶兰的 2 个杂交品种。
以一种 β-内酰胺类新型抗生素美罗培南(Meropenem)作为抑菌抗生素和以潮霉素为筛选元件进行选择 ,获得了潮霉素抗性
体, 并通过 X-gluc组织化学染色法 ,检测到较强的 GUS 的表达 ,表达率达 80%以上。经过 80 d的选择培养后在 81 个潮霉素
抗性组织中获得了 22株再生兰花。对其中的 9株 PCR阳性的再生植株进行 Northern 分析 ,检测到较强的 GUS 基因表达。
关键词:兰花;农杆菌转化;类原球茎体;潮霉素;美罗培南;GUS
中图分类号:S682.31 　　　文献标识码:A　　　文章编号:1002-7351(2007)03-0027-04
Study on Agrobacterium-mediated transformation of protocorm-l ike bodies of
the hybrid orchid of Dendrobium ×Phalaenopsis
CAO Ying , HU Shang-lian, SUN Xia , LU Xue-qin, HAN Ying
(Col lege of Li fe Science and Engineering , Southwest Universi ty of Science and Technology , MianYang , Sichuan 621000 , China)
Abstract:A case of Meropenem as a novel antibacterial agent and hyg romycin as a selective agent in Agrobacterium-mediated trans-
formation of protoco rm-like bodies(PLBs)o f Dendrobium ×Phalaenopsis was reported in this article.After 80 days of selective
culture , 81 Hyg romycin-resistant bodies were gained and stronger GUS expressions w ere observed by X-gluc histo chemical assay.
The Gus expression efficiencies of resistant PLBs w ere up to 80%.Meanwhile , of 22 plantlets obtained , expression and incopo ra-
tio n of the GUS gene in 9 plantle ts w ere confirmed by PCR analysis and Northern blotting.
Key words:Orchid;Agrobacterium-mediated transfo rma tion;protocorm-like body(PLBs);hyg romycin;Meropenem;GUS
　　农杆菌介导的转化方法已经广泛应用在很多双子叶植物和水稻 、小麦 、玉米等一些单子叶植物上。和
其他的单子叶植物相似 ,兰科植物(Orchidaceous Plants)对农杆菌的感染不敏感 ,离体培养又有一定难度 ,
限制了该方法在兰科植物上的应用 。因此最初一些研究集中在利用粒子轰击(particle bombardment)方法
转移外源基因到兰花中[ 1 , 2] 。但研究表明兰花(如石斛兰)含有一种 Coniferyl alcohol物质 ,可以作为农杆
菌Vir基因(Virulence genes)的潜在诱导子 。而且在光下 ,石斛兰的原球茎(Pro tocorm -like Bodies ,PLBs)
所产生的此类诱导子比叶片多 11倍[ 3] 。这些研究促进了农杆菌介导转化兰花技术的发展 。在石斛兰
(Dendrobium)[ 3 , 4] 、蕙兰(Cymbidium)[ 5] 、风兰(Neof inetia falcate)[ 6 , 7] 、文心兰(Oncidium)[ 8]和蝴蝶兰
(Phalaenopsis)[ 9]等中有转化外源基因成功的报道 ,而且与基因枪转化方法相比 ,可获得较高转化率。
本研究通过农杆菌侵染转化类原球茎体(protocorm-like bodies),将 GUS 基因转入石斛兰—蝴蝶兰的
2个杂交品种(Jeshika和Maruyoshi)中 。用美罗培南(Meropenem)作为抑菌抗生素和以潮霉素为筛选元
件进行选择 ,探讨了石斛兰—蝴蝶兰的杂交品种对潮霉素的敏感性和美罗培南在转化过程中作为抑菌抗
生素的可行性。从 109个转化的类原球茎体中获得 22株再生兰花 ,通过 X-gluc组织化学染色法 、PCR检
测和 Northern分析 ,检测到 GUS基因的表达 。
1　材料和方法
1.1　植物材料
2个石斛兰—蝴蝶兰的杂交品种 Jeshika 和Maruyoshi ,由日本广岛县立大学生物资源学部新美研究室
　收稿日期:2007-04-18
　作者简介:曹　颖(1972-), 女 ,西南科技大学讲师 , 硕士 ,从事生物技术研究。
第 34 卷 第 3 期
2 0 0 7 年 9 月
福 建 林 业 科 技
Jour of Fujian Forestry Sci and Tech
Vol.34　No.3
Sep., 2 0 0 7
提供 。由幼嫩叶片诱导而来的 PLBs在 1/2 MS 培养基附加 15%椰子水(Coconut Water)、2%蔗糖和
0.3% gellum gum 上培养 ,25℃,60 d继代 1次 。
1.2　农杆菌和质粒
利用三亲交配法将双元载体 pIG121Hm[ 10 ,11]转入农杆菌 EHA101中 。pIG121Hm 的 T-DNA区含有
35S-GUS 、Nos-NPT Ⅱ和 35S-HPT 基因。其中 GUS基因的 5′端含有一个来自于 castor bean 的过氧化氢
酶基因的改良内含子 ,这使得 GUS基因只在植物中表达 ,而不在细菌中表达[ 10] 。
1.3　潮霉素和美罗培南对 PLBs生长的影响
将对照(未经转化)PLBs分别置于含 5 mg·L -1 、10 mg·L-1和 20 mg·L-1潮霉素的 1/2MS 培养基上
培养 60 d ,观察 PLBs对潮霉素的敏感性 。
同样 ,将对照 PLBs置于含有不同浓度 Meropenem(0 mg·L-1 、5 mg·L-1 、10 mg·L-1 、20 mg·L-1 、50
mg·L-1)培养基上 ,培养 20 d和 40 d后 ,记录增加的鲜重。
每个潮霉素和美罗培南浓度处理有 3次重复 ,每个重复含有 10个 PLBs。
1.4　转化方法
含有质粒 pIG121Hm 的农杆菌 EHA101在附加 50 mg·L-1卡那霉素和 25 mg·L-1潮霉素的液体 LB
培养基上培养过夜(28℃,120 rpm)。室温下 3 000 rpm离心10 min。然后用 10 mm M gSO4溶液将沉淀重
悬 ,将菌液浓度调到 OD600=0.6 ～ 0.8;将 PLBs浸没在菌液中(添加 100 mg·L-1乙酰丁香酮),抽真空 10
min ,在摇床上以 40 rpm 振荡 30 min;转到无菌滤纸上去除多余的菌液 ,然后在 1/2MS(无激素)培养基上
培养 3 d。
经过 3 d的共培养后 ,用含50 mg·L-1美罗培南的无菌水洗 3次 ,在1/2MS 添加 50 mg·L-1美罗培南
和 25 mg·L-1潮霉素的培养基上选择培养 ,抑制残留农杆菌生长和筛选潮霉素抗性组织 。
将获得的抗性愈伤组织置于 1/2 MS 附加 1 mg·L-1 BA和 25 mg·L-1潮霉素的再生培养基上诱导植
株再生。
1.5　β-glucuronidase(GUS)组织化学分析
潮霉素抗性组织按 Jefferson等(1987)[ 12]的方法进行染色 ,观察GUS 的表达。
1.6　转化植株的 PCR检测和 Northern分析
用 Li H 等(2001)[ 13]报道的 CTAB法分别提取转化植株和未转化的对照植株的基因组 DNA 。根据
GUS 基因序列 , 设计 2 个特异引物(引物 1:5 -CCCT TACGCTGAAGAGATGC-3′ , 引物 2:5 -
TCTCTTTGATGTGCTGTGCCTG-3′),该引物能扩增出一段大小约为 400 bp的GUS 基因片段 。PCR反
应条件为:94℃,1 min;60℃,1 min;72℃,1 min。35个循环 。0.8%(w/v)的琼脂糖凝胶电泳分离扩增产
物 ,EB染色 ,紫外灯下观察照相 。
取PCR阳性转化植株和未转化的对照植株的叶片 ,用 TRIzol (Invert rigon)提取总 RNA。以质粒
pIG121Hm 为模板 ,按照上述引物和条件扩增出的 PCR产物(约400 bp的 GUS 基因片段)为探针 ,按照分
子克隆手册方法进行杂交 。
2　结果和分析
2.1　2个杂交品种的 PLBs对潮霉素的敏感性
未经转化的2个石斛兰-蝴蝶兰的杂交品种(Jeshika 和Maruyoshi)的PLBs分别置于含5 mg·L -1 、10
mg·L-1和 20 mg·L-1潮霉素的 1/2 M S培养基上培养 60 d。结果表明 ,不同基因型的 PLBs对潮霉素的
敏感度不同。其中 Jeshika对潮霉素非常敏感。在 5 mg·L -1潮霉素的条件下 , Jeshika 的 PLBs的存活率
仅为对照的 30%, 10 mg·L-1浓度就可完全抑制其 PLBs的生长。与 Jeshika不同 , Maruyoshi 对潮霉素有
较强的耐受性。即使 20 mg·L -1潮霉素也不能完全抑制其生长 。
在其后的转化实验中 ,选定 25 mg·L-1潮霉素浓度作为 2种外植体的筛选浓度 ,减少假阳性抗性组织
的获得。
·28· 福 建 林 业 科 技 第 34 卷
2.2　美罗培南对 PLBs生长的影响
在转化过程中 ,本研究选用一种 β-内酰胺类新型抗生素美罗培南(日本住友制药)作为抑菌抗生素 。
通过在培养基上添加不同浓度的美罗培南 ,检测美罗培南对未转化的对照 PLBs生长的影响。从表 2 可
知 ,培养 20 d时 ,除了 10 mg·L-1美罗培南对类原球茎体鲜重的增加有较明显的影响外 ,其余处理与对照
相比均无显著差异。而且 ,随着培养时间的延长(40 d后),高浓度的美罗培南(50 mg·L-1)对 PLBs生长
反而有较明显的促进作用 。
2.3　受体基因型和培养时间对转化的影响
共培养 3 d后 ,感染的 PLBs被转到选择培养
基(1/2MS培养基添加 50 mg·L-1美罗培南和 25
mg·L -1潮霉素)选择培养 ,筛选潮霉素抗性组织 ,
同时抑制残留农杆菌生长 。
当用 5 个月龄的 Maruyoshi 的 PLBs为转化
受体 ,开始筛选 15 d后 ,几乎一半被侵染的组织变
褐死亡。而在相同的选择条件下 , 以 2 个月龄的
PLBs作为受体 , 从 115个侵染组织中获得了 107
个抗性组织(表 3)。可见筛选初期 ,幼嫩的 PLBs
对潮霉素有更强的忍耐性 。但随着筛选培养的延
长 ,在筛选 80 d后 ,抗性组织的获得率均为30%左
右 ,没有显著区别。
研究结果还表明 ,不同基因型的受体对农杆菌
转化的效率有较大的影响 。同样幼嫩的 Jeshika 的
PLBs(2 个月龄)在筛选的初期就有大量的褐化死
亡。在筛选80 d后 ,获得的抗性组织率只有 15%,
为另一基因型 Maruyoshi的 1/2左右(表 3)。
2.4　抗性组织中GUS 表达率
在 25 mg·L-1潮霉素条件下筛选 3周后 ,挑选
潮霉素抗性 PLBs进行 GUS 组织化学染色 。在这
2个杂交品种中检测到了GUS 的强烈表达(图 1),
表达率均达 80%以上 ,说明 EHA101对 Jeshika 和
Maruyoshi 这 2种杂交品种都有很好的侵染效果 。
2.5　转化植株的 PCR检测和 Northern分析
转化的 287个 PLBs 经过 80 d的选择培养后
获得了 81个潮霉素抗性组织(表 2)。将获得的抗
性愈伤组织置于 1/2 MS 附加 1 mg·L-1 BA和 25
mg·L-1潮霉素的再生培养基上诱导植株再生 ,获
得了 22株再生兰花 。分别提取再生植株和未转化
的对照植株的基因组 DNA ,进行 PCR分析。在22
株再生植株中 ,有 9株呈 PCR阳性 ,扩增到预期的
约 400 bp的片段 ,在对照植株中未扩增出此条带
(图 2:A)。选取 PCR 阳性的植株叶片提取总
RNA ,进行 Northern分析 , 9个样品均检测到较强
的GUS基因表达 ,在对照植株中没有杂交条带产
生。
表 1　Jeshika 和Maruyoshi 的 PLBs对潮霉素的敏感性
品种 潮霉素浓度/ mg·L-1 PLBs的数量 存活的PLBs 数量 存活率/ %
Jeshika 0(control) 30 30 100
5 30 9 30
10 30 0 0
20 30 0 0
Maruyoshi 0(control) 30 30 100
5 30 28 93
10 30 17 57
20 30 4 13
＊:每个潮霉素浓度处理有 3 次重复;每个重复有 10 个
PLBs(每个 PLBs约 0.5 cm 大小)。
表 2　美罗培南对 PLBs 生长的影响
美罗培南浓度/ mg·L-1 培养 20 d 后增加的鲜重/ mg 培养 40 d后增加的鲜重/mg
0(Control) 1.35a 3.35b
5 1.12a 3.14b
10 0.29b 1.57c
20 0.98ab 3.20b
50 1.63a 4.36a
＊:每个数值是3 个处理的平均值;经方差分析(Duncan DB
, 1955), 在 P<0.01 水平上 , 相同字母表示没有显著差
异。
表 3　受体基因型和培养时间对抗性组织获得率的影响
受体 侵染数目
抗性组织数量
筛选 15 d 筛选 50 d 筛选 80 d
2月龄 Maruyoshi 115 107(93%) 81(70%) 41(36%)
5月龄 Maruyoshi 80 44(55%) 44(55%) 26(33%)
2 月龄 Jeshika 92 41(44%) 15(16%) 14(15%)
表 4　农杆菌 EHA101(pIG121Hm)感染时的 GUS 表达率
品种 感染PLBs数 潮霉素抗性 PLBs 数 GUS 阳性率/ %
Jeshika 52 26 81(9/ 12)
Maruyoshi 57 34 88 (10/ 12)
＊:在 50 mg·L -1美罗培南和 25 mg·L-1潮霉素的选择培
养条件下筛选 21 d。
·29·第 3 期 曹　颖 , 等:农杆菌介导转化石斛兰—蝴蝶兰杂交种类原球茎体的研究
图 1　潮霉素抗性 PLBs 中 GUS 表达(A 为 Jeshika;B 为 Maruyosh)
3　讨论
无论是基因枪法还是农杆菌介导法 ,
都需要在受体材料中插入选择标记基因 ,
以便进行转化体的选择培养。一些研究
表明兰花对卡那霉素有较高的耐性[ 1 ,2] 。
如高达500 ～ 700 mg·L -1卡那霉素才能完
全抑制愈伤组织生长 ,而 75 ～ 250 mg·L-1
图 2　转化植株的 PCR检测和 Northern 分析
　A:转化植株的 PCR琼脂糖凝胶电泳图(M:
分子量标准;w t:对照(未经转化的植株);1 ～
9 指 PCR阳性的 9 个植株)。
B:Nor thern 杂交检测转化植株中 GUS 表达:
对照和 1 ～ 9转化植株的叶片总 RNA 20ug ;
探针为 32P 标记的 gusA 基因。
卡那霉素对根的生长有一定的抑制[ 2] ,300 ～ 400 mg·L-1卡那
霉素会使已经生根的再生植株生长停止[ 1] 。因此 ,为避免嵌合
体的产生 ,以 NPTII (Neomycin Phosphotransferse type Ⅱ)作
为选择标记基因时 ,需要高浓度的卡那霉素和长时间的筛选。
相比之下 ,对卡那霉素忍耐性较高的植物 , HPT (Hyg romycin
Phosphotransferse)基因作为选择标记要优于 NPT Ⅱ基因。本
研究中经转化的 2个基因型的石斛兰和蝴蝶兰杂交品种(Den-
drobium Phalaenopsis)的类原球茎 ,在含有 25 mg·L-1潮霉素
(Hygromycin)的筛选培养基上培养 6 ～ 8 周即可得到抗性
PLBs ,而未转化的组织全部死亡。
农杆菌介导转化时 ,共培养 3 ～ 4 d后 ,转化组织需要在含
有抗生素的培养基上培养一段时间 ,杀死或抑制农杆菌的生
长 ,以免其影响转化细胞或组织的生长发育。然而目前常用的
抑菌抗生素如羧苄青霉素(Carbenicillin)、头孢霉素(Cefotax-
ine)等的抗菌活性低 ,在兰花的转化中 ,通常需要 200 ～ 500 mg
·L-1的浓度才能有效抑制和消除残余农杆菌[ 4 ,8 ,14] 。而且一
些研究也表明羧苄青霉素和头孢霉素对植物愈伤组织生长和芽的再生有副作用[ 15-17] 。因此寻找对农杆
菌更敏感 、更有效的抑菌抗生素很有必要。美罗培南(Meropenem Trihydrate)是一种 β-内酰胺类新型抗
生素(日本住友制药),从 1995年开始广泛用于人和动物。与羧苄青霉素和头孢霉素相比 ,美罗培南对农
杆菌有更强的抑制作用。离体培养条件下 ,仅仅 0.2 mg·L-1美罗培南就可以完全抑制农杆菌 LBA4404 、
EHA101和 EHA105的生长 ,而且美罗培南对兰花 PLBs生长和再生没有明显副作用 ,研究还表明 50 mg·
L-1的美罗培南反而促进 PLBs生长[ 18 ,19] 。
兰花是一种重要的观赏植物 ,建立成熟高效的农杆菌转化体系是十分必要的。研究表明 ,在农杆菌介
导兰花的转化过程中 ,以美罗培南为抑菌抗生素和以潮霉素为筛选元件的体系是可行的 ,转化的 287 个
PLBs经过 80 d的选择培养后获得了 81个潮霉素抗性组织 ,获得了 22株再生兰花 。经 PCR和 Northern
分析检测 ,有 9株检测到较强的GUS 基因表达。进一步提高这一系统的转化效率和导入外源有益基因如
建兰花叶病毒(CyMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)的外壳蛋白基因 、抗逆基因等研究仍有许多工作要做 。
＊:感谢日本广岛县立大学新美善行教授(Prof.Yoshiyuki Niimi)对本研究的大力支持。
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