全 文 ：
第 36卷第 6期 水 产 学 报 Vol.36, No.6
2012年 6月 JOURNAL OF FISHERIES OF CHINA June, 2012


收稿日期: 2011-12-18 修回日期: 2012-03-09
资助项目: 宁波市创新团队(2011B81007);宁波市自然科学基金(2010A610028); 浙江省自然科学基金(Y5100066)
通讯作者: 陈海敏, E-mail: chenhaimin@nbu.edu.cn
http: //www.scxuebao.cn

文章编号: 1000-0615(2012)06-0969-05 DOI:10.3724/SP.J.1231.2012.27855
琼胶寡糖诱导坛紫菜活性氧爆发
朱竹君, 陈海敏*, 骆其君, 杨 锐, 严小军, 王秀娟, 何 山
(宁波大学应用海洋生物技术教育部重点实验室, 浙江 宁波 315211)
摘要: 研究了琼胶寡糖诱导坛紫菜氧爆发的响应及其活性氧产生的位点。用琼胶寡糖诱导坛
紫菜, 以微呼吸测量系统检测坛紫菜氧消耗的变化; 以对羟基苯乙酸(POHPAA)化学发光法
检测坛紫菜的 H2O2释放量; 利用 DCFH-DA 染色观察活性氧在细胞上的定位; 并利用实时
定量 PCR检测坛紫菜NADPH氧化酶基因Phrboh的差异表达; 通过 2-AMAC标记琼胶寡糖,
观察其在坛紫菜的结合部位。结果显示, 100 μg/mL琼胶寡糖处理坛紫菜, 出现两次呼吸爆
发, 分别在 4 min和 10 min左右, 强度分别是基础呼吸的 4倍和 14.1倍; 5 min内出现 H2O2
的积累, 15 min达到峰值, 比对照组高出近 10倍。10 μmol/L DPI可部分抑制 H2O2的产生。
3 min内 Phrboh的表达已上调, 并持续近 10 min。DCFH-DA染色显示, 活性氧主要产生在
膜系统上。荧光标记琼胶寡糖的定位发现, 坛紫菜细胞膜上存在琼胶寡糖的结合位点。综上
所述, 琼胶寡糖能识别细胞膜上的结合位点, 并诱导坛紫菜膜系统上的 H2O2爆发, H2O2的
产生与 NADPH氧化酶相关。
关键词: 坛紫菜; 琼胶寡糖; 活性氧爆发; NADPH氧化酶
中图分类号: Q 591.9; S 917 文献标志码: A
在宿主与病原菌相互作用中, 识别是宿主遭
受攻击时的最初反应, 包括对外源信号(来自于病
原菌等)和内源信号(来自于宿主自身的降解物)的
识别。这类信号分子被统称为激发子, 包括寡糖、
LPS、鞭毛蛋白等。激发子的识别发生在宿主细胞
的表面或胞浆中, 之后伴随氧化爆发, 产生活性氧
的释放和积累, 而这与质膜定位的 NAD(P)H 氧化
酶或非原生质体氧化酶相关[1]。产生的活性氧既可
以作为直接的杀菌物质, 又可以作为下游抗性相
关反应的信号分子。氧化爆发已被证实是普遍存在
于动植物防御反应中的一个早期特征性反应。
目前, 藻类学家在研究海藻的防御体系时发
现寡糖是一类重要的激发子。如 Küpper 等[2]报道
褐藻胶寡糖能诱导掌状海带(Laminariales digitata)
产生氧爆发 , 显著地增强其抵御内生植物
Laminariocolax tomentosoides侵染的能力。Küpper
等[3]人用藻酸寡糖处理掌状海带的幼孢子体细胞,
发现能激发其呼吸氧爆发, 而 NADPH氧化酶不可
逆抑制剂 DPI 能够抑制掌状海带孢子体对寡糖的
氧爆发响应。Potin等[4]和Weinberger等[5-6]报道, 在
龙须菜(Chondrus crispus)的配子体受到其寄生绿
藻 Acrochaete operculata 攻击时, 能释放大量的
H2O2, 当释放量达到 100 μmol/L 时, 能有效诱导
A. operculata的死亡。综上所述, 在藻类防御体系
上, 氧化爆发是普遍存在的一个初始反应。
紫菜是亚洲地区重要的经济海藻。在养殖中,
紫菜会遭受病原菌的攻击, 有时会导致紫菜病害
的发生[7], 主要与紫菜的防御系统密切相关。紫菜
的细胞壁是其遭受病原菌攻击时的第一道防线 ,
它以琼胶为主要骨架, 其上结合了硫酸基、酮酸基
等多种基团。当紫菜受到琼胶降解菌等病原菌侵染
时, 细胞壁会被降解成大小、结构不一的碎片。这
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些碎片很可能作为一种信号来激发紫菜自身的防
御反应。但由于这些碎片存在着大小和结构的多样
性, 推测紫菜细胞很可能是以琼胶骨架为识别对
象的。本研究以琼胶寡糖为激发子, 研究其诱导坛
紫菜(Porphyra haitanensis)氧爆发响应的能力, 为
寡糖激发紫菜防御反应提供基础理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料和试剂
坛紫菜叶状体, 采自象山坛紫菜养殖场。实验
前, 先用无菌海水清洗 2~3 次, 0.7% KI(w/v)杀菌
5~10 min, 20 ℃下活化 24~48 h。
琼胶寡糖, 由本实验室自制, 聚合度 2~10。
RNAiso Plus试剂盒, PrimeScript RT reagent Kit
Perfect Real Time试剂盒, SYBR Premix Ex TaqTM
II(Perfect Real Time)试剂盒均购自 TaKaRa公司。
1.2 方法
坛紫菜氧消耗检测 100 μg/mL 琼胶寡糖
处理坛紫菜, 用微呼吸测量系统(Unisense PA2000)
检测培养液的实时溶氧量。再计算坛紫菜的呼吸速
率, 用 R(nmol/g·s)表示。
R=△CO2·V/(m·△t)
式中, △t 表示两点实时溶氧量的时间间隔(s); △
CO2表示在△t内溶氧量的变化(μmol/L); V表示培
养液总体积(μL); m表示坛紫菜叶片鲜重(mg)。
R′ =(RrealRbasal)/Rbasal
式中, R′表示相对呼吸速率; Rreal 表示寡糖处理组
的呼吸速率; Rbasal表示对照组的呼吸速率。
坛紫菜释放 H2O2检测 以含 100 μg/mL琼
胶寡糖的海水培养液处理坛紫菜叶片 1 h(培养密
度为 7 mg/mL)。各时间点取培养液 , 添加
POHPAA混合剂(6.13 μmol/L POHPAA, 276.9 U/L
POD, 8.6 mmol/L Tris-HCl, pH=8.8), 避光反应 35
min后检测吸光值(ex=313 nm, em=400 nm)。具体
计算方法参照文献[8]。
坛紫菜原生质体的制备 坛紫菜原生质体
按许星鸿等[9]的方法制备。海螺酶提取自短滨螺
(Littorina brevicula)。
DCFH-DA 染色观察坛紫菜细胞活性氧产生
部位 坛紫菜用琼胶寡糖(100 μg/mL)避光处理
1 h 后, 加入 DCFH-DA(50 μmol/L)和 POD(45
U/mL), 避光染色 45 min后在荧光显微镜下观察绿
色荧光产生部位, 即活性氧产生部位。
坛紫菜的 NADPH氧化酶基因 Phrboh差异表
达检测 100 μg/mL琼寡糖处理坛紫菜, 在各时
间点采集叶片, 提取总 RNA。反转录成 cDNA 后
进行实时定量 PCR 检测。以藻类 NADPH 氧化酶
类似物保守区为模板, 设计 Phrboh定量正向引物:
5-TGCCGCTCAAGACGACCTA-3; 反 向 引 物 :
5-CACCCACCACAGACCCAGA-3, 扩增 90 bp片
段。以 18S为参照基因, 正向引物: 5-AGTTAGGG-
GATCGAAGACGA-3, 反向引物: 5-CAGCCTTG-
CGACCATACTC-3。两基因同一程序下进行扩增:
holding, 95 ℃ 3 min; 循环, 95 ℃ 10 s, 58 ℃
18 s, 72 ℃ 15 s, 40 循环; melting, 60~90 ℃。用
2ΔΔCT法进行结果分析。
2-AMAC 荧光标记寡糖观察细胞上寡糖结合
位点 2~4 mg 琼胶寡糖用 200 μL 1 mol/L
NaCNBH溶解, 加入 200 μL 0.1 mol/L 2-AMAC[由
21 mg 2-AMAC固体溶于 1 mL冰醋酸和 DMSO混
合液(V︰V=3︰17)中配成], 避光 , 90 ℃水浴 30
min 后将反应管放入冰中终止反应, 以四氢呋喃
萃取未反应荧光剂, 反复离心(12 500 r/min, 4 ℃,
15 min)直至荧光没有为止。
将 100 μg/mL 荧光标记的琼胶寡糖避光处理
紫菜 30 min, 在荧光显微镜下观察荧光部位, 即寡
糖结合位点。
数据分析 数据以 x ±SD 表示, n=3。用
(One-Way ANOVA)单因素方差分析方法进行统计
分析。
2 结果
2.1 琼胶寡糖诱导坛紫菜 H2O2爆发
100 μg/mL琼胶寡糖处理 5 min后, 检测到坛
紫菜迅速释放 H2O2(图 1)。在 15 min时, H2O2释
放量达到峰值(102.1±6.82) nmol/L, 比对照组高出
近 10倍。单因素方差分析表明, 琼胶寡糖诱导 15
min 时, 对坛紫菜产生 H2O2 爆发有高度显著的影
响(P<0.01)。用 10 nmol/L的 DPI预处理坛紫菜, 再
用琼胶寡糖诱导, H2O2的积累浓度有所降低, 峰值
为(57.37±14.62) nmol/L, 说明坛紫菜产生 H2O2与
NADPH氧化酶存在一定相关性。

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2.2 琼胶寡糖诱导下坛紫菜呼吸氧消耗
在 100 μg/mL琼胶寡糖处理坛紫菜 4 min左右,
检测到坛紫菜出现一个氧呼吸爆发, 持续约 1.5 min,
最高值为基础呼吸的 4倍, 随后坛紫菜呼吸速率恢
复正常。但在糖处理 10 min左右可观察到一个更
大的氧呼吸爆发, 同样持续近 1.5 min, 最高可达
基础呼吸的 14.1倍(图 2)。
2.3 DCFH-DA 染色观察坛紫菜细胞活性氧产生
部位
100 μg/mL琼胶寡糖诱导下, 可在坛紫菜的细
胞外周观察到活性氧产生, 并且也能看到细胞内
点状的荧光信号(图 3-b), 荧光细胞比例可达到
37.9%±6.5%。对坛紫菜细胞原生质体进行相同的
处理, 同样在原生质体的外周和胞内看到荧光信
号(图 3-d)。故推测坛紫菜受琼胶寡糖激发, 在细胞
膜及一些内膜系统上产生了活性氧爆发。
2.4 琼胶寡糖诱导坛紫菜 NADPH氧化酶 Phrboh
差异表达
100 μg/mL 琼胶粗糖处理坛紫菜 3 min, Phrboh
已出现表达上调, 比正常水平上调约 1.73 倍, 并且
12 min 内 Phrboh 一直处于上调。 在 15 min 时,
Phrboh恢复到正常表达水平(图 4)。


图 1 100 μg/mL琼胶寡糖诱导坛紫菜 H2O2爆发
ab表示有高度显著性差异, P<0.01
Fig. 1 H2O2 burst in P. haitanensis induced by
100 μg/mL oligoagars ab means highly
significant difference, P<0.01



图 2 100 μg/mL琼胶寡糖诱导坛紫菜相对
呼吸速率的变化
Fig. 2 Relative respiratory rate of P. haitanensis chal-
lenged by 100 μg/mL oligoagars



图 3 100 μg/mL琼胶粗糖诱导下坛紫菜细胞活性氧产生部位
a, b为非原生质体, a为对照组, b为实验组; c, d为原生质体, c为对照组, d为实验组。
Fig. 3 The site of AOS in intact cells and protoplast of P. haitanensis challenged by 100 μg/mL oligoagars
a, b are non-protoplast, a is control group, b is test group; c, d are protoplast, c is control group, d is test group.




图 4 100 μg/mL琼胶寡糖诱导下坛紫菜Phrboh的差异表达
Fig. 4 Expression level of Phrboh induced by
100 μg/mL oligoagars
2.5 2-AMAC 标记琼胶寡糖观察坛紫菜细胞上糖
结合位点
2-AMAC 标记的琼胶寡糖(100 μg/mL)处理坛
紫菜及其原生质体, 能观察到其细胞膜荧光信号
(图 5-b, d), 说明在坛紫菜的细胞膜上存在琼胶寡
糖的结合位点。
3 讨论
目前, 关于藻类活性氧产生的相关酶机制还
存在争议 , 主要观点: (1) 活性氧由质膜定位的
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图 5 2-AMAC标记的琼胶寡糖处理坛紫菜细胞
a, b为非原生质体, a为对照组, b为实验组; c, d为原生质体, c为对照组, d为实验组。
Fig. 5 The binding of intact cells and protoplast of P. haitanensis with 2-AMAC labelled oligoagars
a, b are non-protoplast, a is control group, b is test group; c, d are protoplast, c is control group, d is test group.

NADPH氧化酶生成; (2)由非原生质体氧化酶类产
生 O2或 H2O2[3]。Weinberger 等[10]人发现在 Gra-
cilaria conferta中, 活性氧在质膜被激活, 推测 G.
conferta藻体上质膜定位的NADPH氧化酶对H2O2
的释放有贡献。但 Weinberger 等[11]在亚细胞水平
上进行检测, 显示 G. chilensis的 H2O2在细胞壁释
放。说明亲缘关系非常近的红藻对琼胶寡糖发展出
了两种完全不同的反应来决定 H2O2的产生。其中
G. conferta激活定位在细胞膜的 NADPH氧化酶样
酶, 产生胞外 H2O2, 并能直接作为生物杀灭剂。而
在 G. chilensis 中, H2O2的产生是由细胞壁定位的
寡糖氧化酶作用的, 不涉及原生质体。实验中我们
也观察到, 用 10 μmol/L DPI预处理坛紫菜后, 再
以琼胶寡糖刺激, 仍有一定量的 H2O2 产生, 但强
度降低了 1/2左右。说明在坛紫菜中, 活性氧的产
生除了与 NADPH氧化酶相关外, 可能还涉及其它
的氧化酶类。
近年来, 已有学者从 Chondrus crispus、条斑
紫菜(P. yezoensis)等藻类中克隆到 NADPH氧化酶
类基因 , 又称呼吸爆发氧化酶类似物基因 , 如
Ccrboh、Pyrboh[12]。本研究以这类基因的保守区设
计定量引物, 分析发现在琼胶寡糖的诱导下, 坛紫
菜的 Phrboh表达上调, 且上调时间在 H2O2爆发之
前。说明在坛紫菜中, 琼胶寡糖能诱导 NADPH氧
化酶基因表达上调, 以增强酶活力, 进而参与活性
氧的爆发。
紫菜等红藻在自然水域里生活时, 会经常遭
受到诸如琼胶降解菌等病原菌的攻击。Weinberger
等[10]曾报道琼胶寡糖诱导 G. conferta 产生的防御
信号强到足以杀死藻体表面的附生菌。大约 60%
的附生菌群在藻体被激发后 60 min 内被消灭, 而
大约 90%的琼胶降解菌在藻体被激发后的 15 min
内被消灭。本研究结果显示, 这种防御信号很可能
就是藻体产生的活性氧, 如释放到水体里的 H2O2。
因此推测, 藻体很可能是通过识别自身被降解的
一些细胞壁寡糖碎片, 来调节自身的防御体系, 以
维持自身的健康生长。
综上所述, 在坛紫菜的防御体系中, 寡糖作为
信号分子能结合细胞膜上的相关位点, 在细胞膜
上激发活性氧响应, 活性氧的产生很可能与膜定
位的 NADPH氧化酶类的参与有关。

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Oxidative burst in Porphyra haitanensis (Rhodophyta)
ZHU Zhu-jun, CHEN Hai-min*, LUO Qi-jun, YANG Rui, YAN Xiao-jun,
WANG Xiu-juan, HE Shan
(Marine Biotechnology Laboratory, Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology,
Ministry of Education, Ningbo University, Ningbo 315211, China)
Abstract: Oligosaccharides could induce some physiological responses in algae to defend attacks from
pathogens. One of the earliest responses induced by oligosaccharides was so-called oxidative burst. This
study has surveyed the recognition and oxidative burst response of Porphyra haitanenesis to aga-
ro-oligosaccharide. Oxygen consumption was detected by an oxygen electrode. H2O2 concentrations in the
medium were determined by measuring the dimerization of (p-hydroxyphenyl) acetic acid. The elicited
oxidative burst was observed by loading the P. haitanenesis with redox-sensitive fluorescent probe di-
chlorohydrofluorescin (DCFH-DA). Gene expression level of NADPH oxidase (named Phrboh) was de-
tected by real-time PCR. 2-AMAC labeled agaro-oligosaccharides were used to research the binding of
agaro-oligosaccharide on algae. Results showed that two respiration peaks were observed after addition of
100 μg/mL agaro-oligosaccharide in P. haitanensis. Fourfold increase occurred in the first respiration peak
4 minutes after the addition, and fourteen times higher in the second response 10 minutes after the expo-
sure to agaro-oligosaccharide. The accumulation of H2O2 in the culture medium was detected 5 minutes
after challenged with agaro-oligosaccharide. The concentration of H2O2 reached its peak after 15 minutes,
which was nearly ten times higher than control. The gene expression level of NADPH oxidase in P. haita-
nensis was up-regulated 3 minutes after the addition of agaro-oligosaccharide, suggesting that the synthesis
of H2O2 was closely related to the activation of Phrboh. Based on the analyses of the fluorescence of re-
dox-sensitive dye, activated oxygen species mainly accumulated around the plasma membrane. Under the
fluorescent microscope, specific binding of 2-AMAC labeled agaro-oligosaccharide on cell plasma mem-
brane was also observed, which indicated that there was recognition site of agaro-oligosaccharide on P.
haitanensis plasma membrane. In summary, P. haitanensis could recognize agaro-oligosaccharide and re-
spond with oxidative burst which was associated with the activation of NADPH oxidase.
Key words: Porphyra haitanensis; agaro-oligosaccharide; oxidative burst; NADPH oxidase
Corresponding author: CHEN Hai-min. E-mail: chenhaimin@nbu.edu.cn