全 文 ：第 44 卷第 18 期
2016 年 9 月
广 州 化 工
Guangzhou Chemical Industry
Vol. 44 No. 18
Sep. 2016
腐烂龙须菜自水解生产琼胶寡糖的可行性研究*
朱思颖，陈丹琦，梁家铭，李海新，李 蓉，柯德森
(广州大学生命科学学院，广东 广州 510006)
摘 要:在不同温度、供氧量、盐度及处理时间条件下，对腐烂龙须菜的还原糖含量、琼胶酶活力及分子量进行分析，以
探究龙须菜腐烂过程中自水解生产琼胶寡糖的可行性，并分析影响其水解程度因素。实验表明，腐烂龙须菜中有一种活性物质能
降解琼胶生产琼胶寡糖。35 ℃、淡水半厌氧、腐烂处理 96 h时的龙须菜产琼胶寡糖含量为“完好”样品近 6 倍，酶活力是 0 h酶
活力的约 8. 2 倍。该条件下处理 48 h的腐烂龙须菜的小分子琼胶寡糖的相对含量达 98. 71%。
关键词:龙须菜;腐烂;琼胶酶;琼胶寡糖;分子量
中图分类号:S985. 4 + 9 文献标志码:B 文章编号:1001 －9677(2016)018 －0052 －04
* 基金项目:广东省自然科学基金项目 (2014A030313531);广州市科技计划项目 (201510010108) ;广东省专业综合改革试点项目 (生物工程，粤教高
函［2013］113号);2016广东省级大学生创新训练项目(教务〔2016〕58号) ;第十五届全国“挑战杯”竞赛立项 (2016:琼胶寡糖)。
第一作者:朱思颖 (1993 －)，本科生。
通讯作者:柯德森 (1966 －)，博士，教授。
Feasibility Study of Agar Oligosaccharide Production by Self Hydrolysis
during Decay Process in Gracilaria Lemaneiformis*
ZHU Si － ying，CHEN Dan － qi，LIANG Jia －ming，LI Hai － xin，LI Ｒong，KE De － sen
(School of Life Sciences，Guangzhou University，Guangdong Guangzhou 510006，China)
Abstract:Under the conditions of different temperature，the amount of oxygen，salinity and treatment time，the
content and the molecular weight of reducing sugar were measured，as well as the agarase activity in Gracilaria
lemaneiformis was analyzed during decay process. The feasibility study of agar oligosaccharide production by self hydrolysis
during decay process in Gracilaria lemaneiformis was studied and the related factors affecting the degree of hydrolysis were
analyzed. The results showed that the agar could be degraded to produce agaro oligosaccharides during decay process in
Gracilaria lemaneiformis. The agar oligosaccharide content in 96 h was 6 times as much as that of the natural species. The
enzyme activity in 96 h was 8. 2 times as much as that in 0 h. The small molecule agarose content could reached 98. 71%
when Gracilaria rotted in fresh water at 35 ℃ for 48 h.
Key words:Gracilaria lemaneiformis;rot;agarase;agar oligosaccharide;molecular weight
琼胶在工业生产中应用非常广泛，却不能人工合成，只能
从产琼胶红藻中提取。而龙须菜是江蓠属海藻中提取琼胶质量
最好的种类之一，其琼胶含量达 20% ～ 25%，琼胶凝胶强度可
达 1000 g·cm －2以上。
琼胶在食品、医药卫生、日用化工、轻工业等方面有广泛
的应用［1］。但由于琼胶凝动性强，不容易被吸收，因此在应用
方面受到很大限制。而琼胶经酸水解后主要形成由琼二糖的重
复单位连接而成的寡糖，即琼胶寡糖，水溶性好，有利于人体
吸收，是一种新型的海洋功能性低聚糖［2］，因此琼胶寡糖的研
究成为新的热点。
目前琼胶寡糖虽然在食品、医药、生物等许多方面有广阔
应用前景，但琼胶寡糖至今还没有进行产业化的生产［3 － 4］。而
到目前为止，实现降解琼胶生产琼胶寡糖的琼胶酶工业化生产
的菌株只有大西洋假单胞菌，其产品来自于 Sigma 公司，价格
昂贵，而我国尚没有琼胶酶的产品［5 － 8］。
本实验充分利用低成本的腐烂龙须菜，用单因素法探究腐
烂龙须菜的天然琼胶酶降解琼胶产琼胶寡糖的可行性及将腐烂
龙须菜不同温度、供氧量、海水与淡水、时间等条件腐烂处理
下对琼胶寡糖含量进行对比研究，目的是探究较高产量的应用
价值高的琼胶寡糖生产的最适条件，因此经济利用价值十分
高。
1 实 验
1. 1 实验材料和试剂
新鲜龙须菜:2016 年 1 月购于广东省南澳岛，用清水冲洗
干净后用海水浸泡、氧气泵供氧备用。海水［9］:每 100 mL 水
含 3. 5 g海盐配制。3，5 －二硝基水杨酸［10 － 11］:精确称取 3，5 －
二硝基水杨酸 40 g，溶于 800 mL浓度为 2 mol·L －1的 NaOH溶
液中，加入 2000 mL蒸馏水，再加入 1200 g的酒石酸钾钠，待
溶解后用蒸馏水定容至 4000 mL。Tris － HCl 缓冲液。0. 2%琼
胶溶液:琼脂粉，天津市致远化学试剂有限公司，Tris － HCl缓
第 44 卷第 18 期 朱思颖，等:腐烂龙须菜自水解生产琼胶寡糖的可行性研究 53
冲液溶解。
1. 2 培养环境因素对腐烂龙须菜的处理
1. 2. 1 温度处理
称取 120 g新鲜龙须菜用蒸馏水稍微冲洗，用酒精消毒后
的小刀切断龙须菜 (100 次)，平均分成 3 份均匀置于 3 个大小
一致干净烧杯中，分别标志为:“损伤 25 ℃”、“损伤 35 ℃”、
“损伤 45 ℃”。隔 24 h测一次还原糖含量，共测 3 次。(对照为
海水浸泡、氧气泵供氧的备用龙须菜，测量时标志为“完好”，
以下简写为“完好”龙须菜。)
1. 2. 2 供氧量、海水与淡水处理
在温度处理的结果的基础上，选出合适的温度进行如下操
作:称取 240 g新鲜龙须菜用蒸馏水稍微冲洗，用酒精消毒后
的小刀切断龙须菜 (200 次)，平均分成 6 份后均匀置于 6 个大
小一致的干净烧杯中，其中 3 个烧杯中加入 600 mL 淡水，另
外 3 个加入配制好的 600 mL 海水，从海水和淡水处理的烧杯
中各取 3 个烧杯分别用保鲜膜密封、敞开、用氧气泵供氧，用
于提供利于海水厌氧、淡水厌氧、海水半厌氧、淡水半厌氧、
海水好氧、淡水好氧的微生物生长环境。测定腐烂培养 24 h和
48 h的还原糖含量以确定最适条件。(对照“完好”龙须菜)
1. 2. 3 最适培养时间实验
以上两实验得出的最适条件为基础，重新称取 120 g 新鲜
龙须菜用蒸馏水稍微冲洗，用酒精消毒后的小刀切断龙须菜
(100 次)后适宜条件培养，在腐烂培养时间为 15 h、24 h、
40 h、49 h、64 h、73 h、87 h、96 h时测定腐烂龙须菜样品和
“完好”龙须菜还原糖含量。(对照为“完好”龙须菜)
1. 3 腐烂龙须菜提取液的天然琼胶酶活力测量［12］
称取约 100 g新鲜龙须菜材料用蒸馏水冲洗，用酒精消毒
后的小刀切断龙须菜，置于干净的烧杯中，加淡水浸泡龙须菜
至刚好覆盖，分别在培养 0 h、24 h、48 h、64 h、96 h、108 h、
120 h、132 h取提取液与琼胶溶液混合 (提取液∶0. 2%琼胶溶
液 = 8∶2)后，马上取 0. 5 mL提取液与琼胶溶液的混合液于 3
支有刻度的试管中，测定还原糖 OD 值。剩下的混合液置于培
养箱中酶解 24 h后测定酶解后的还原糖 OD 值。以酶解前后还
原糖 OD值的变化量衡量酶活力的大小。
还原糖 OD 值测定方法如下:取 0. 5 mL 溶液，加入
0. 5 mL蒸馏水后加入 2 mL DNS，煮沸 10 min，冷却，定容到
7. 5 mL，在 520 nm下测吸光度，依据葡萄糖标准曲线计算粗
酶活。以反应体系中 1 min产生 0. 001 μg 还原糖所加入的酶量
为一个活力单位。
1. 4 龙须菜还原糖含量的测定［10 －11］
将龙须菜分别称取 10 g于烧杯中，用 75%酒精消毒过的剪
刀剪碎至各份龙须菜的剪碎程度接近，用研钵研磨充分形成
浆，分别加入 100 mL蒸馏水。置于 100 ℃水浴锅水浴 30 min，
搅拌，真空抽滤，保留滤液。每一份滤液取分别取 1 mL 至 3
支有刻度的试管中，并加入 2 mL DNS 溶液，100 ℃水浴煮沸
10 min以后，定容到 7. 5 mL，用分光光度计在 520 nm 波长下
比色测定光密度。
1. 5 还原糖的分子量鉴定［13 －18］
取样品 5 mL，加入 50 mL蒸馏水稀释，加热并搅拌使其充
分溶解，冷却至室温后经 0. 45 μm滤膜过滤备用。利用凝胶过
滤 GPC － HPLC (岛津 LC20A，日本岛津公司)进行分子量范围
测定，GPC 色谱柱 ＲBL2054;流动相为纯净水，使用前经
0. 45 μm滤膜过滤，流速 1 mL·min －1;柱温 30 ℃，示差折光
检测器温度 30 ℃;进样量:9 μL。
1. 6 实验数据处理
以上实验重复次数均为 3，取平均值并计算标准误差
(SE)，实验结果表示为:平均值 ± SE。
2 结果与讨论
2. 1 培养温度对龙须菜还原糖产量的影响
图 1 可知，任一时刻下 25 ℃、35 ℃、45 ℃下腐烂龙须菜
的还原糖含量均比无损伤腐烂处理的龙须菜的还原糖含量高，
且 35 ℃与 45 ℃下培养下的还原糖含量更高，这与梅建凤等［3］
的研究结果接近，其中 45 ℃培养的腐烂龙须菜 24 ～ 72 h 时还
原糖含量上升较快，72 h 时还原糖含量为 24 h 时的 2. 8 倍，
25 ℃、35 ℃下培养的腐烂龙须菜在 48 ～ 72 h 之间还原糖含量
呈明显上升趋势;猜测与产琼胶酶的微生物生长繁殖的最适温
度以及酶活性发挥的最适温度有关。考虑到生产成本的因素，
故选取 35 ℃温度下，进行不同氧气和水条件处理龙须菜的还
原糖含量的环境条件探究。
图 1 腐烂龙须菜在不同温度下还原糖含量随时间的变化曲线
Fig. 1 Change of reducing sugar content in rotten asparagus
at different temperaturesvaried with time
注:图中数据为三组平行实验的平均值，
其中垂直短线表示实验的标准偏差
2. 2 溶氧量和水的盐度对还原糖含量的影响
图 2 不同氧气和水条件处理还原糖含量随时间的变化
Fig. 2 Change of reducing sugar content in different oxygen
and water conditions
由图 2 可知，损伤腐烂处理的龙须菜培养 48 h的还原糖含
量均比 24 h高，且条件为淡水、半厌氧条件处理的腐烂龙须菜
的还原糖含量最高，而淡水厌氧条件处理的腐烂龙须菜还原糖
含量次之，可初步确定产琼胶酶的微生物适于生长在淡水、半
厌氧条件，为半厌氧微生物。因此选取淡水、半厌氧条件为最
适条件。
54 广 州 化 工 2016 年 9 月
2. 3 培养时间对龙须菜还原糖含量的影响
图 3 结果可知，35 ℃、淡水、半厌氧条件下培养的腐烂龙
须菜上还原糖含量明显比对照的“完好”样品的还原糖含量
高;在 15 ～ 40 h时，还原糖含量呈指数上升，64 h后趋于平稳
上升，在实验时间内，培养时间为 96 h的腐烂龙须菜上还原糖
含量是对照样品近 6 倍。因此 35 ℃、淡水半厌氧的条件更利
于腐烂龙须菜上还原糖的积累。
图 3 35 ℃、淡水、半厌氧处理腐烂龙须菜还原糖含量随时间的变化
Fig. 3 Changes of reducing sugar content at 35 ℃ in fresh water and
half rotten asparagus anaerobic treatment with time
2. 4 腐烂龙须菜天然琼胶酶活力验证
根据图 4 结果可见，腐烂龙须菜的琼胶酶活力在龙须菜腐
烂 0 ～ 96 h呈上升趋势，96 h 时酶活力达到最大后开始下降，
其上升趋势与图 3 所示结果相吻合。培养时间为 96 h提取液酶
活力是 0 h时约 8. 2 倍。对 0 h、48 h和 96 h的酶活力进行单因
素方差分析，计算结果显示，说明龙须菜腐烂处理 0 h、48 h、
96 h之间酶活力差异达极显著水平，96 h 时的酶活力极显著大
于 0 h和 48 h，结果证明腐烂龙须菜的提取液中存在具琼胶酶
活性物质，促进琼胶水解产生琼胶寡糖。
图 4 腐烂龙须菜酶活力随时间变化图
Fig. 4 Gracilaria decay of enzyme activity over time
2. 5 还原糖分子量测定结果
将 GPC高效液相色谱法所测还原糖的保留时间划分为 3 部
分:其中保留时间为 3 ～ 6 min 为大分子量，保留时间为 7 ～
10 min为中分子量，保留时间 11 ～ 14 min部分为小分子量。其
中，小分子量的还原糖可初步认为是琼胶寡糖。以各部分峰面
积占总波峰面积的百分比(%)近似表示该部分分子量的可溶性
糖的相对含量，结果如表 1 所示。对“完好”、海水半厌氧、
淡水半厌氧的小分子量相对含量进行单因素方差分析，结果为
P = 4 × 10 －15 ＜ ＜ 0. 01，说明不同条件处理腐烂龙须菜所得小分
子量的相对含量的差异达极显著水平，其中淡水半厌氧处理条
件下小分子量达到 98. 71%，为未经处理的“完好”龙须菜的
近 8 倍，证明淡水、半厌氧条件下培养腐烂龙须菜自水解生产
的琼胶寡糖最多，与上述实验结果均吻合。
表 1 液相色谱法测定不同条件处理腐烂龙须菜
所得分子量分布表
Table 1 Liquid Chromatography different processing conditions
rotting asparagus dish molecular weight distribution
of the resulting table
样品名称
大分子量
面积比 /%
中分子量
面积比 /%
小分子量
面积比 /%
完好 87. 51 0 12. 49
淡水好氧 12. 63 0 87. 37
淡水半厌氧 1. 29 0 98. 71
淡水厌氧 10. 60 0 89. 40
海水好氧 100. 00 0 0
海水半厌氧 41. 71 0 58. 29
海水厌氧 38. 70 0 61. 30
3 结 论
本实验探究了腐烂龙须菜是否能通过自水解生产应用价值
高的琼胶寡糖，实验证实了在适宜条件下，腐烂龙须菜能产生
一种活性物质，这种活性物质使腐烂龙须菜自水解生产海洋功
能性低聚糖———琼胶寡糖。
本实验通过改变温度、溶氧量、水盐度、培养时间等条件，
测定腐烂龙须菜上还原糖的含量 (通过测定还原糖 OD值并绘制
还原糖标准曲线，标准曲线为:y = 2. 1802x，Ｒ2 = 0. 9927)初步
确定损伤腐烂处理能增大琼胶寡糖的产量，进一步通过腐烂龙
须菜提取液的天然琼胶酶活力验证，证实了腐烂龙须菜能产生
一种活性物质，这种活性物质可能是一种琼胶酶，能促进水解
琼胶生产还原糖，而这种还原糖最终通过还原糖的分子量测定
初步鉴定为琼胶寡糖。本实验探索并得到腐烂龙须菜生产琼胶
寡糖的相对合适条件，推测该条件适合产琼胶酶的微生物的生
长并使其产生的琼胶酶活性更高。实验结果表明:在 35 ℃左右、
淡水、半厌氧条件下，琼胶寡糖在腐烂龙须菜培养时间小于 96 h
时产量呈上升趋势，15 ～40 h时呈指数增长，64 ～96 h平稳上升
且 96 h时产量达到最高，为对照的“完好”样品的近 6 倍;龙
须菜腐烂处理时间为96 h提取液的酶活力是0 h提取液酶活力约
8. 2倍，而被小分子量琼胶寡糖相对含量在淡水半厌氧处理下为
未经处理的“完好”龙须菜的近 8 倍。此结果对将来进一步放
大生产琼胶寡糖具有重要的参考价值。
参考文献
［1］ 柯德森，刘春媚，周子琳，等．海水提取龙须菜琼胶的碱处理条件优
化［J］．广州大学学报:自然科学版，2012，11(5):35 － 39．
［2］ 刘美英，梅建凤，易喻．琼胶寡糖生物活性的研究进展［J］．药物生
物技术，2008(6):493 － 496．
［3］ 梅建凤，应国清，刘美英，等．酶解琼胶制备活性寡糖的工艺条件研
究［J］．浙江工业大学学报，2011，39(2):119 － 122．
［4］ 李能章，邱荣蓉，彭远义． 琼胶酶的研究进展［J］． 生命科学研究，
2006，10(2):62 － 66．
［5］ 朱磊，薛永常．琼胶酶酶学研究进展［J］．生命的化学，2016，36(2):
193 － 197．
(下转第 92 页)
92 广 州 化 工 2016 年 9 月
形成连续而均匀的薄膜。当高锰酸钾用量为 5 ～ 6 g 时，所得
ＲGO的电阻率约为 1. 2 × 10 －3 Ω /cm，而当高锰酸钾用量进一
步增大，所得 GO经还原后的电阻率则也随之上升，这可能是
因为高锰酸钾用量的增多固然可以使石墨得到充分氧化，但也
会使 GO中的含氧官能团增多，GO层的缺陷也更加严重，通过
HI还原后，GO还有更多的碳碳双键无法恢复，导致 ＲGO的电
阻率增大。由此可见，通过化学还原法制备石墨烯时，既要考
虑氧化剂的用量来保证 GO 在溶剂中的分散性，同时也必须注
意不要过度氧化，导致还原后导电性能的降低。
3 结 论
在化学氧化还原法制备石墨烯的过程中，高锰酸钾的用量
对所得 GO的形态、结构及在溶剂中的分散性能及成膜的好坏
有着较大的影响，高锰酸钾用量越大，所得 GO分散液越清亮，
分散液的均匀与稳定性都随之提高，但对化学还原后所得的
ＲGO导电性能有着不利的影响。综合以上因素，在氧化过程
中，石墨与高锰酸钾的质量比最好控制在 2. 5 ～ 3 之间，在此
条件下所得氧化石墨烯分散液的分散性较佳，同时也能保证还
原后所得石墨烯较高的导电性能。
参考文献
［1］ Novoselov K S，Geim A K，Morozov S V，et al． Electric field effect in
atomically thin carbon films［J］． Science，2004，306(5696):666 －
669．
［2］ Thomas Ｒ W，Amir Y． Nanomaterials:Graphene rests easy［J］． Nature
Nanotechnology袁 2010，5(10) :699 － 700．
［3］ 孙启安，张小平，张志芳，等． 石墨烯无机复合材料的研究进展
［J］． 热加工工艺，2016，45(12):9 － 12．
［4］ Nair Ｒ Ｒ，Blake P，Grigorenko A N，et al． Fine structure constant
defines visual transparency of graphene［J］． Science，2008，320
(5881) :1308．
［5］ Li X，Magnuson C W，Venugopal A，et al． Graphene films with large
domain size by a two － step chemical vapor deposition process［J］．
Nano Letters，2010，10(11) :4328 － 4334．
［6］ Tromp Ｒ M，Hannon J B． Thermodynamics and kinetics of graphene
growth on SiC (0001) ［J］． Physical review letters，2009，102(10) :
106104．
［7］ Lomeda J Ｒ， Doyle C D， Kosynkin D V， et al． Diazonium
functionalization of surfactant － wrapped chemically converted graphene
sheets［J］． J． Am． Chem． Soc．，2008，130:16201 － 16206．
［8］ Tung V C，Allen M J，Yang Y，et al． High － throughput solution
processing of large － scale grapheme［J］． Nature Nanotech，2009，4:
檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵
25 － 29．
(上接第 54 页)
［6］ 王晓燕，桑卫国，章宗铭．腐烂紫菜中琼胶酶高产菌株的筛选及鉴
定［J］．食品科技，2009，34(7):2 － 5．
［7］ 缪伏荣，李忠荣．琼胶的降解及其产物的开发应用［J］．现代农业科
技，2007(2):125 － 128．
［8］ 林伯坤，陆国永，宋燕，等．海洋细菌 Agarivoranssp． HZ105 的琼胶降
解酶系［J］．生物技术通报，2015，31(1):160 － 166．
［9］ 赵玉芬，李洪仁．人工海水的配制及经济可行性评估［J］．沈阳教育
学院学报，2001，2(3):117 － 118．
［10］ 彦繁鹤，周金梅，吴如春． DNS 法测定甘蔗渣中还原糖含量［J］．食
品研究与开发，2015，36(2):126 － 128．
［11］ 王丽娜，陈水钫，张兵，等． 3，5 －二硝基水杨酸法测定多糖含量的
研究进展［J］．吉林医药学院学报，2009，30(4):232 － 234．
［12］ 林立昊，惠宏杉，齐军仓，等．紫外分光光度法测定啤酒大麦籽粒脂
氧合酶活力的研究［J］．核农学报，2016，30(5):926 － 933．
［13］ 袁梦，马玉晨．高效液相色谱 －示差折光法测定蜂蜜中三种还原糖
含量［J］．食品与发酵科技，2015，51(1):87 － 90．
［14］ 孙文，巢志茂，王淳，等．瓜蒌饮片中总糖及还原糖的含量测定［J］．
中国实验方剂学杂志，2013，19(1):96 － 99．
［15］ 逯平杰，代容春，叶冰莹，等． 高效液相色谱法测定甘蔗节间果糖、
葡萄糖和蔗糖的含量［J］．食品科学，2011，32(2):198 － 200．
［16］ 马志刚，曹秋娥，丁中涛．高效液相色谱法测定丹参及其复方制剂
中的 3 个丹参酮［J］． 云南民族大学学报:自然科学版，2013，22
(6):391 － 393．
［17］ Inger Krong － Mikkelsen，Ole Hels，Inge Tetens，et al． The effects of
L － arabinose on intestinal sucrose activity:dose － response studies in
vitro and in humans［J］． AmJClinNutr，2011，94(2) :472 － 478．
［18］ BEＲNAＲDEZMM， MIGUELEZJD， QUEUEIＲOBJG． HPL Cdeter
mination of sugarsinvarieties of chestnutfruits from galicia［J］． Journal of
Food Composition and Analysis，2004，17(1) :63 － 67．
［19］ 丁洪流，李灿，金萍，等．高效液相色谱 －蒸发光散射法测定食品中
的单糖、双糖、低聚果糖和糖醇［J］．色谱，2013，31(8):804 － 808．