全 文 ：徐 晗，孙旻旻，吴品珊，等． DNA条形码、形态学与地理分布相结合的植物果实(种子)鉴定方法———以口岸截获的外来入侵
植物犬蔷薇(Ｒosa canina L．)为例［J］． 杂草科学，2015，33(2):26 － 31．
DNA条形码、形态学与地理分布相结合
的植物果实(种子)鉴定方法
———以口岸截获的外来入侵植物犬蔷薇(Ｒosa canina L．)为例
徐 晗1，孙旻旻2，吴品珊1，王文正3
(1．中国检验检疫科学研究院，北京 100029;2．无锡出入境检验检疫局，江苏无锡 214000;
3．喀什出入境检验检疫局，新疆喀什 844000)
摘要:以单一方法鉴定物种具有参考文献(或比对数据)少、专业要求高的缺点。以新疆口岸进境货车截获
的未知植物果实为例，从分子、形态、地理分布 3 个维度，对该未知果实逐级进行分类鉴定。根据 ITS、atpF － H、
psbK － I 3 段植物 DNA通用条形码序列，以及形态学和地理分布信息，最终确定该未知果实为原产于西亚的蔷薇
科蔷薇属犬蔷薇(Ｒosa canina L．)。本方法简单、准确，弥补了现有单一检测鉴定技术的不足，适用于进境产品中
植物果实或种子的检疫鉴定。
关键词:外来入侵植物;种子;果实;植物检疫;犬蔷薇;DNA条形码;种子形态学;地理分布
中图分类号:S41 － 3 文献标志码:A 文章编号:1003 － 935X(2015)02 － 0026 － 06
Identification Methods Combining DNA Barcoding，Morphology and
Geographical Distribution of Plant Fruits or Seeds
—A Case Study of the Invasive Species Ｒosa canina L． Intercepted at Frontier Port
XU Han1，SUN Min-min2，WU Pin-shan1，WANG Wen-zheng3
(1． Institute of Plant Quarantine，Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing 100029，China;2． Wuxi Entry － Exit
Inspection and Quarantine Bureau，Wuxi 214000，China;3． Kashi Entry － Exit Inspection and Quarantine Bureau，Kashi 844000，China)
Abstract:Species identification is difficult in the case of scarce references and highly trained professional． As a case
study of an unknown fruit intercepted from vehicle entering from Xinjiang Port，we identified this unknown fruit by molecu-
lar，morphological and geographical distribution methods． Based on ITS，atpF － H，psbK － I sequences，fruit morphology
and geographical distribution，we finally identified it is Ｒosa canina L． which originated from Western Asia． The com-
bined identification methods are simple and efficient，improving existing technology，and suitable for identifying plant fruits
or seeds at the ports．
Key words:alien invasive plant;seed;fruit;plant quarantine;Ｒosa canina L．;DNA barcoding;seed morphology;geo-
graphical distribution
收稿日期:2014 － 11 － 26
基 金 项 目:国 家 科 技 支 撑 计 划 (编 号:2012BAK11B01、
2012BAK11B03) ;院所基金(编号:2014JK010) ;质检公益性行业
项目(编号:201510162) ;江苏省科技项目(编号:2014KJ51)。
作者简介:徐 晗(1981—) ，女，博士，研究方向为植物学。E － mail:
xuhangin@ gmail． com。
2013 年，中国进出口贸易总值达 4． 16 万亿美
元，首次超过美国位列世界第一。与此同时，有害生
物通过国际贸易传播的概率也大大增加。近几年，
以边境口岸为主的有害生物截获事例不断增多，其
中不乏危害国家经济生活安全的有害物种。如此之
多的外来生物，亟需快速、准确的检测鉴定方法。植
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物检疫中外来有害植物的鉴定多以形态学为主。其
中，有关制定与发布的国家标准 12 项、行业标准 20
项，方法基础与背景主要为形态学。此外，口岸截获
的外来植物组织多为果实或种子，有关植物果实或
种子的研究资料少，形态学特征数据不足。随着分
子生物学技术的发展与完善，DNA 条形码概念的被
提出，检测鉴定方法也在不断更新。在科技部支撑
计划项目“检疫性有害生物 DNA 条形码检测数据
库建设及应用(编号:2012BAK11B00)”的支持下，
分子检测鉴定技术在口岸外来有害生物识别工作中
逐步开展。随着检测鉴定方法从形态到分子的不断
完善，鉴定效率也得到提高。
新疆是古“丝绸之路”的重要通道，周边与哈萨
克斯坦、吉尔吉斯斯坦等 8 个国家接壤，是我国邻国
最多、边界线最长的省(区)。新疆对外开放的一类
口岸有 17 个，二类口岸有 12 个，以陆运(公路、铁
路)口岸为主，往来车辆、人员复杂，外来有害生物
传入风险高。本研究通过分子生物学、形态分类学
和物种地理分布信息 3 个方面的研究，对截获于自
喀什口岸入境车辆上的未知果实进行鉴定。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
未知植物果实来源于新疆喀什口岸进境货车车
厢内清理出的废弃物。
1． 2 分子生物学
试验选用 ITS、psbK － I、atpF － H 3 段 DNA条形
码序列用于分析研究，所用引物分别为 ITS5(5 －
GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG －3)和 ITS4(5 －
TCCTCCGCTTATTGATATGC － 3) ，psbK (5 －
TTAGCCTTTGTTTGGCAAG － 3)和 psbI (5 －
AGAGTTTGAGAGTAAGCAT － 3) ，atpF (5 －
ACTCGCACACACTCCCTTTCC － 3)和 atpH(5 －
GCTTTTATGGAAGCTTTAACAAT － 3)。反应体系
为:总反应体积 25 μL，0． 5 μg 模板 DNA，引物各
10 pmol，100 μmol /L dNTP，2 mmol /L MgCl2，2 U
Taq DNA聚合酶。反应条件为 94 ℃预变性 5 min;
94 ℃变性 1 min，47． 0 ～ 51． 3 ℃(ITS序列 51． 3 ℃、
psbK － I序列 47． 0 ℃、atpF － H 序列 48． 3 ℃)退火
1 min，72 ℃ 延伸 50 s，共 37 个循环;最后延伸
72 ℃，10 min。
序列校正软件使用 CondonCode Aligner 与 Gen-
eStudio。所获得序列在 GenBank中配对比较。系统
发育关系分析软件使用 MEGA 6． 0，采用 Neighbor －
Joining算法中的 Kimura 2 － Parameter 模型构建系
统树，自展分析 1 f000 次。
1． 3 形态学比对和地理分布信息收集
种子形态学比对信息来源于种质资源信息网
(GＲIN，germplasm resources information network，
http:/ /www． ars － grin． gov /)以及各国与国内地区
植物志。地理分布信息来源于作物保护大全检索系
统(CPC，crop protection compendium，http:/ /www．
cabi． org /)、全球生物多样性信息网络(GBIF，global
biodiversity information facility，http:/ /www． gbif．
org /)以及各国与国内地区植物志。
2 结果与分析
2． 1 DNA条形码比对结果
将试验所得样品 ITS、psbK － I、atpF － H 3 段基
因序列在 GenBank中配对比较，发现与蔷薇属(Ｒo-
sa)相似度最高。通过 psbK － I，发现未知物种
(XJKS)与 Ｒosa odorata var． gigantea 聚类在一起
(自展支持率 100%) (图 1) ，但仅能初步将鉴定范
围锁定在蔷薇属。通过 atpF － H 序列进一步分析，
发现未知物种与 Ｒosa odorata var． gigantea、Ｒosa
blanda、沼泽蔷薇(Ｒosa palustris)、犬蔷薇(Ｒosa ca-
nina L．)聚类在一起(自展支持率 99%) ，其中与沼
泽蔷薇(Ｒosa palustris)和犬蔷薇(Ｒosa canina L．)的
亲缘关系较近(自展支持率 82%) (图 2)。蔷薇属
ITS序列在 GenBank 中多达 100 条，通过重建系统
发育树，发现犬蔷薇(Ｒosa canina L．)、Ｒosa dumalis
subsp． dumalis与该未知序列相似度最高(自展支持
率 89%)。其中，Ｒosa dumalis subsp． dumalis 与犬
蔷薇(Ｒosa canina L．)为同物异名(图 3)。而 Ｒosa
odorata var． gigantea、Ｒosa blanda 则从属于不同的
进化支(图 3)。
2． 2 形态学鉴定结果
根据“2． 1”节中蔷薇属的鉴定结论，发现该未
知植物果实(或种子)的确与蔷薇科蔷薇属植物瘦
果特征吻合(图 4)。该瘦果淡桔黄色或麦秆色，长
椭圆形并侧弯，具 3 ～ 4 条棱边，长 4． 5 ～ 6． 5 mm，宽
2． 4 ～ 3． 0 mm，果皮木质，表面凹凸不平，内含 1 枚
种子(图 4)。根据进一步对比，发现该未知植物瘦
果与犬蔷薇(Ｒosa canina L．)、肉桂蔷薇(Ｒosa maja-
lis)瘦果形态特征相似，与 Ｒosa odorata var． gigant-
ea、Ｒosa blanda、沼泽蔷薇(Ｒosa palustris)的果实特
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征差异明显。而且，果实特征相近的肉桂蔷薇(Ｒosa
majalis)在 ITS 序列构建的系统发育树中与未知果
实(XJKS)亲缘关系较远(图 3)。
2． 3 地理分布信息
蔷薇属 200 多种植物广泛分布于亚、欧、北非、
北美各洲［1］。犬蔷薇(Ｒosa canina L．)原产于欧洲、
非洲西北部和西亚，后传入北美洲、大洋洲等地成为
野生植物［2 － 3］，在吉尔吉斯斯坦和哈萨克斯坦均有
分布［4］。沼泽蔷薇(Ｒosa palustris)原产于美国，现
分布于美国、加拿大和荷兰［4］。肉桂蔷薇(Ｒosa ma-
jalis)在欧洲和西伯利亚地区分布较广［4］。该未知
果实发现地点为塔吉克斯坦与新疆边境口岸，结合
“2． 1”和“2． 2”中的鉴定结果，根据地理分布信息，
排除遗传距离较近的沼泽蔷薇(Ｒosa palustris)和种
子形态相近的肉桂蔷薇(Ｒosa majalis) ，进一步确认
该未知果实为原产于西亚，为分布于塔吉克斯坦的
犬蔷薇(Ｒosa canina L．)。
3 讨论
犬蔷薇(Ｒosa canina L．)是野生蔷薇的一种，常
作为栽培品种的野生种质资源，果实、种子作药用或
食品工业原料。在美国内地以及新西兰的内陆山区
与当地植被竞争生长，使牧场的牧草饲用价值降低，
被认为是一种入侵种，其最早危害记录可追溯至
1895 年［5 － 6］。犬蔷薇隶属的蔷薇属植物分布广泛，
物种基因组杂合度高，野生种过渡类型多样，几乎所
有种都可以种间杂交，是一个公认的难以界定的生
物类群［7］。犬蔷薇本身也是一类遗传多样性丰富
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的由不同地理变种、变型组成的生物类群［8 － 9］。尽
管在以形态学为主的传统分类学上有关蔷薇属的分
类争议不断，分类体系不一。但诸多分子生物学手
段如 DNA条形码技术、遗传分子标记等对种、品种、
居群等遗传多样性的研究已对传统形态分类学起到
了良好的校正和补充作用，一些复合类群的分类问
题在不断得到解决［10 － 11］。通过形态和分子生物学
相结合的方式，可以将未知物种界定为某一属、组、
种或复合群中。
本研究便通过 DNA 条形码、传统形态分类学以
及物种地理分布三方面信息，将截获到的未知植物果
实鉴定到蔷薇科蔷薇属的犬蔷薇(Ｒosa canina L．)。
通常情况下，对产品中截获到的植物果实或种子，选
择传统形态分类方法进行鉴定。但有关植物种子和
果实的文献不多，用于比较的特征少。植物分类学
中的专业术语以及植物学基础知识也限制了口岸一
线人员对截获物种的正确鉴定。此外，如前段所述，
果实或种子形态特征易受生境或杂交的影响而改
变，种内会发生不同程度的变异，在缺乏鉴定经验的
情况下又加大了鉴定难度。
而单一的分子生物学鉴定方法，如果缺少种属
水平的分类学研究和数据支持，也难以开展准确的
种及种下分类阶元的界定。不同物种相同或不同的
基因序列提供的信息量不同，适宜序列的选取也决
定了鉴定的有效性［12 － 14］。而且在前期研究基础缺
乏的情况下，难以仅凭一条基因序列将物种细分到
种或种以下分类阶元。但与形态分类学相比，根据
几段 DNA 条形码序列，可以快速、准确地将物种界
定到属。在植物界，核基因 ITS 和叶绿体基因
matK、rbcL等被作为分类的通用序列［12 － 14］。虽然不
同属的适用序列有差异，但根据多条 DNA条形码通
用序列，可以将分类学上比较成熟、特征清晰、争议
少的大部分物种界定出来。因此及多条基因序列特
征比较，通过近缘种比对，可以事先将未知物种锁定
在属的范围，再通过形态分类资料和地理分布信息，
确定到种的水平。
每一个种(或属、科)都有各自的分布范围，占
据地表某一有限生境，同时分布范围也在不断变
化［15］。植物的地理分布数据是植物分类学中必要
的研究资料———标本，必备的采集信息之一。根据
地方与地区植物志，以及不断更新的物种分布信息，
可以通过物种发现地点、传入途径来合理推测物种
类别。通过地理分布信息作为补充，对分子生物学
和形态学的分类结果进行验证，尤其对一些近似种
进行排除。
通过分子生物学界定到属，通过形态学复核鉴
定到种，通过地理分布信息进行排除再次复核，使外
来未知物种的鉴定工作更加有效、准确。该方法也
是对外来植物鉴定日常使用方法的梳理。
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556．
《杂草科学》2016 年将更名为《杂草学报》
《杂草科学》是由江苏省农业科学院主管、江苏省杂草研究会和江苏省农业科学院植物保护研究所
主办的国内唯一杂草研究领域专业科技期刊，刊号 CN32 － 1217 /S。《杂草科学》是中国科技核心期刊、
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为了适应日趋激烈的市场竞争和不断发展进步的杂草科学研究水平，更加突出论文的新颖性和创
造性，持续稳定地提高期刊的被引频次和影响因子，为杂草科学研究提供一个展现最新成果的高水准交
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