全 文 ：第 23卷第 3期 大 连 水 产 学 院 学 报 Vol.23No.3
2 0 0 8年 6月 JOURNALOFDALIANFISHERIESUNIVERSITY Jun.2 0 0 8
文章编号:1000-9957(2008)03-0210-05
用流加培养技术在光生物反应器中
培养新月菱形藻的研究
任 莉红 1 , 孙 利 芹1、2 , 王 长 海1、2
(1.烟台大学海洋学院 ,山东 烟台 , 264005;2.大连理工大学 环境科学与生命学院 ,辽宁 大连 116024)
摘要:应用微生物流加培养技术对新月菱形藻 Nitzschiaclosterium分别进行恒速流加培养 、 变速流加培养 ,
并与一次性培养进行了比较。结果表明:不同的流加方式对新月菱形藻的生长 、 蛋白质 、 胞内多糖产量影
响显著;恒速流加培养 10 d的藻密度 、 蛋白质及多糖的含量分别为 (1.901 ±0.050) ×107cell/mL、
(42.82±4.03)mg/L、 (95.68±3.99)mg/L, 是一次性培养的 2.29、 1.62、 2.15倍;在变速流加培养中 ,
当流加控制因子 K=0.167时 , 藻密度 、 蛋白质 、 多糖的含量分别是一次性培养的 4.83、 6.23、 6.12倍。
关键词:新月菱形藻;流加培养;生物量;蛋白质;多糖
中图分类号:Q949.27 　　　　文献标识码:A
　　新月菱形藻 Nitzschiaclosterium是水产经济动
物虾 、 贝类育苗时的良好生物饵料 [ 1] , 其计划性 、
稳定性的供给直接关系到育苗的成败 。在实际生产
中 , 水泥池开放式的藻培养往往由于生产不稳定 、
易污染而导致藻密度低 , 供给不足 , 也常因投入过
多藻液导致育苗池的水污染 , 进而影响水质 , 特别
是投放被污染的和老化的藻液时更为严重[ 2] 。因
此 , 光生物反应器的研制与开发是近年来研究的热
点 , 其中气升环流式光生物反应器则是其中的典型
代表[ 3] 。
在光生物反应器中 , 营养盐的质量浓度直接影
响新月菱形藻的生长 , 一次性加入量过大会抑制藻
的生长 [ 4] 。因此 , 如何解决高质量浓度营养盐对
藻生长的抑制问题 , 是实现高密度培养的关键 。采
用流加培养技术 , 可以有效消除底物对产物的抑
制 、毒害作用 , 促进细胞生长和代谢 , 从而取得较
高的生物量和代谢产物[ 5] 。该技术已广泛用于微
生物的培养 , 在动植物的培养中也有报道[ 6] , 在
微藻的培养中 , 王克明[ 7] 、 田治立等 [ 8] 已分别将
其用于盐藻与纤细角毛藻的培养 , 其效果显著 。但
关于用流加培养技术培养新月菱形藻尚未见报道 。
为了解决高质量浓度营养盐对新月菱形藻生长的抑
制问题 , 提高藻的生物量 , 促进次级代谢产物的积
累 , 本研究中 , 作者在营养盐 (N、 P、 C、 Si)预
试验的基础上 , 对用不同方式流加培养新月菱形藻
进行了初步研究。
1　材料与方法
1.1　材料
新月菱形藻种由烟台大学海洋生化研究所纯化
并保存。试验用海水取自烟台近海域 , 经 0.22 μm
膜过滤后使用 。
柱式光生物反应器规格为 120 mm×700 mm,
有效体积为 2L。平板光生物反应器光径为 10 cm,
容积为 30 L, 结构见图 1。
1.2　方法
1.2.1　预试验　在开始恒速流加和变速流加试验
前 , 首先在柱式光生物反应器中进行预试验 , 以确
定流加 N、 P、 C、 Si的质量浓度。培养基采用 f/2
配方 [ 9] , 根据试验设计改变 N、 P、 C、 Si的质量
浓度 , 其水平见表 1。连续光照 , 光照强度为4 000
lx, 温度为 (23±1)℃, 通气量为 1.5 L/min, 接
种密度为 5×105cel/mL。每个试验组设 3个重复。
1.2.2　流加培养试验　
1)培养条件 。将对数生长期的藻液接种到装
　收稿日期:2007-10-15
　基金项目:农业部暨辽宁省省级高校海洋水产增养殖与生物技术重点开放实验室开放课题 (K2006-03)
　作者简介:任莉红 (1980-), 女 , 硕士。 E-mail:renlihong8866@sina.com
　通信作者:王长海 , 男 , 教授 , 博士生导师。 E-mail:chwang2001@sina.com
DOI :10.16535/j.cnki.dlhyxb.2008.03.011
图 1　平板光生物反应器结构简图
　Fig.1　Thestructureinflatplatephotobioreactor
表 1　预试验因素水平表
　　Tab.1　Thefactorsandleveltableofthepreliminary
experiment
水平
level
因素 factor/(g· L-1)
NaNO3 NaH2PO4 NaHCO3 Na2SiO3
1
2
3
4
5
6
0.20
0.40
0.50
0.60
0.80
0.90
0.03
0.04
0.05
0.06
0.08
0.10
0.20
0.40
0.60
0.80
1.20
1.60
0.05
0.10
0.15
0.20
0.30
0.40
有培养液的光生物反应器中 , 密度为 1.0 ×106
cel/mL。从藻生长的第 3天开始 , 向反应器中流
加培养液 , 直至第 8天 , 共培养 10 d。培养液中
NaNO3 、 NaH2 PO4、 NaHCO3 、 Na2 SiO3的质量浓度
根据预试验选取 , 微量元素 、 维生素 (未加生物
素)的加量同 f/2。用空调把培养温度控制在 (23
±1)℃;光照设为 4 000 lx, 根据灯管到平板的距
离来控制 , 光照周期为 24∶0;通气量设为 3.0
L/min;总培养体积为 15 L。每个试验组设 3个重
复 。
2)恒速流加方案。新月菱形藻的恒速流加培
养试验 , 以一次性培养为对照组 , 对照组中所有营
养成分一次性加入;恒速流加组中 , 营养盐
NaNO3 、 NaH2 PO4、 NaHCO3 、 Na2 SiO3的初始质量
浓度分别设为 0.10、 0.01、 0.10、 0.05 g/L, 流加
富含 N、 P、 C、 Si的培养液 , 使各营养盐的最终
质量浓度分别与对照组中相应营养盐的总质量浓度
相同。试验方案见表 2。
3)变速流加方案。变速流加是根据所培养生
物的特点非线性的进行流加的一种方式。在进行新
月菱形藻的变速流加培养时 , 对照组 (一次性培
养)、变速流加组培养液中 N、 P、 C、 Si的加入量
同恒速流加试验 , 流加速率用一个简单的数学模
型 [ 7]来控制。即在流加区间内 , 设
　　v=dQ/dt=K(t-t0)(t-t1), (1)
其中:v为流加速率 (L/d);t为培养时间 (d);
t0 、 t1分别为流加开始和流加结束时的培养时间
(d);K为流加控制因子;Q为总流加量 (L)。本
试验中 , 在培养开始两天后进行流加 , 培养停止前
两天结束流加 , 则 t0 =2d, t1 =8 d, 对式 (1)积
分可得 Q与 K的关系 , 即
　　　　　Q=36K, (2)
当 Q一定时 , K也随之确定 , 流加速率 v随时间而
变化 。因此 , 可通过确定 Q来控制流加速率 。
表 2　流加培养方案
Tab.2　Testdesignoffed-batchculture
培养方式
culturepatern
底液量 /L
basesolution
流加量 /L
feedquantity
流加速率 /(L· d-1)
feedrate
一次性培养
batchculture 15 0 0
恒速流加
constantfeedrate 10 5 0.833
　　4)流加因子和流加量对新月菱形藻的生物量
及蛋白质 、 胞内多糖的影响试验 。根据式 (2),
在总培养体积相同的情况下 , 改变流加量 Q, 营养
盐质量浓度会发生变化 , 从而影响藻体的生长代
谢。因此 , 可以在不同的流加量下对新月菱形藻进
行培养 , 试验方案如表 3所示 。
表 3　不同流加量下新月菱形藻的培养试验方案
　Tab.3　Testdesignoffed-batchwithdifferentfeeding
rates
底液量 /L
base
solution
流加量 /L
feeding
quantity
流加控制因
子 K　feeding
controlfactor
流加速率
feedingrate/ (L· d-1)
3、 8d 4、 7d 5、 6d
7.5 7.5 0.208 0.555 1.386 1.803
9.0 6.0 0.167 0.445 1.114 1.447
10.0 5.0 0.139 0.371 0.926 1.205
10.5 4.5 0.125 0.333 0.834 1.083
11.0 4.0 0.111 0.296 0.740 0.962
12.0 3.0 0.083 0.221 0.554 0.719
1.2.3　生物量及生化组成的测定　
用无菌海水适当稀释后 , 采用血球计数板计数
细胞个数;用蒽酮硫酸法 [ 10]测定多糖 , 经回归分
析可得葡萄糖标准曲线方程为 y=0.7719x+
0.1786, R2 =0.9879;采用考马斯亮蓝法 [ 10] 测定
蛋白质 , 经回归分析可得蛋白质标准曲线直线方程
为 y=1.1056x-0.0344, R2 =0.9950。
1.3　数据分析
用 SPSS13.0软件处理数据。预试验中选取第
10 d的藻体细胞数做方差分析 , 流加试验中选取
第 10 d的藻体细胞数 、 蛋白质和胞内多糖进行方
211第 3期　　　　　　任莉红 ,等:用流加培养技术在光生物反应器中培养新月菱形藻的研究
差分析 , 影响显著的进行 Duncans多重比较 , 试
验结果用 x±s表示。
2　结果与分析
2.1　预试验
为了确定流加试验中营养盐的质量浓度 , 分别
研究了 NaNO3、 NaH2 PO4、 NaHCO3、 Na2 SiO3对新
月菱形藻生长的影响 , 结果见图 2。从图 2可见 ,
随着 NaNO3 、 NaH2PO4、 Na2SiO3质量浓度的增加 ,
新月菱形藻的细胞密度先增加后下降 。当 NaNO3质
量浓度为 0.60 g/L时 , 生长最快 , 藻密度可达
1.583×107cel/mL;当 NaNO3质量浓度超过 0.60
g/L时 , 藻密度下降。 NaH2PO4质量浓度为 0.03 ～
0.05g/L时 , 随着其质量浓度的增加 , 新月菱形
藻的生长加快;当 NaH2 PO4质量浓度为 0.05 g/L
时 , 藻细胞生长最快 , 密度可达 1.612 ×107
cel/mL;质量浓度继续增加 , 藻生长速率下降。
Na2SiO3质量浓度较低时 , 添加硅可以加快新月菱
形藻的生长。当 Na2 SiO3质量浓度达到 0.30 g/L
时 , 新月菱形藻生长最快 , 密度高达 1.706×107
cel/mL;质量浓度继续增加 , 藻密度降低。当
NaHCO3质量浓度小于 0.40 g/L时 , 新月菱形藻生
长缓慢 , 密度低;NaHCO3质量浓度为 0.40 ～ 0.80
g/L时 , 细胞生长最快;当质量浓度大于 0.80g/L
时 , 藻生长速率下降 , 密度降低 。本试验结果表
明 , 高质量浓度的 NaNO3 、 NaH2 PO4 、 NaHCO3、
Na2SiO3对新月菱形藻细胞的生长产生抑制作用 。
从方差分析结果 (表 4)可见 , 不同质量浓度
的 NaNO3、 NaH2PO4 、 NaHCO3 、 Na2SiO3对新月菱
形藻生长的影响非常显著 (P<0.01)。
图 2　预试验结果 ( x±s, n=3)
Fig.2　Resultsofpreliminaryexperiment
2.2　流加培养对新月菱形藻生长及代谢的影响
为了考察流加技术消除高质量浓度营养盐引起
的抑制作用 , 分别进行恒速流加和变速流加培养试
验 。对照组与流加组中 NaNO3 、 NaHCO3 、 NaH2
PO4 、 Na2SiO3的总质量浓度相同 , 且都在抑制藻生
长的质量浓度范围内选取。根据预试验结果 ,
NaNO3 、 NaH2 PO4、 NaHCO3 、 Na2 SiO3的最终质量
浓度分别取为 1.00、 0.10、 1.00、 0.50 g/L, 试验
结果见表 5。
方差分析与 Duncan多重比较结果显示 , 变速
流加培养 、恒速流加培养与一次性培养之间差异均
显著 (P<0.05), 且变速流加培养与恒速流加培
养 、 一次性培养之间差异均极显著 (P<0.01)。
恒速流加培养 10 d后 , 新月菱形藻的生物量 、 蛋
白质 、胞内多糖含量分别为 (1.901±0.050) ×
10
7cel/mL、 (42.82 ±4.03)mg/L、(95.68 ±3.99)
mg/L,分别是一次性培养的 2.29、 1.62、 2.15倍。
212 大 连 水 产 学 院 学 报　　　　　　　　　　　　第 23卷
表 4　预试验的方差分析
Tab.4　Varianceanalysisinthepreliminaryexperiment
项目
item
差异源
sourceofvariation
平方和 / (×1013)
sumofsquares
自由度
df
均方和 / (×1012)
meansquare F P
组间 betweengroups 4.853 5 9.706 8.879 0.001
NaNO3 组内 withingroups 1.312 12 1.093
总计 total 6.165 17
组间 betweengroups 6.104 5 1.221 5.890 0.006
NaH
2
PO
4 组内 withingroups 2.487 12 0.207
总计 total 8.591 17
组间 betweengroups 12.525 5 2.505 12.1511 0.000
NaHCO3 组内 withingroups 2.474 12 0.206
总计 total 14.999 17
组间 betweengroups 9.369 5 1.874 13.776 0.000
Na2SiO3 组内 withingroups 1.632 12 0.136
总计 total 11.001 17
　注:F0.05 (5, 12)=3.106, F0.01 (5, 12) =5.064。
表 5　培养方式对新月菱形藻生长及代谢的影响( x±s, n=3)
Tab.5　Effectofculturepatternongrowthandmetabolism
　　　ofthealgaNitzschiaclosterium
培养方式
culturemode
生物量 /
(107cel· mL-1)
biomass
蛋白质 /
(mg· L-1)
protein
胞内多糖 /
(mg· L-1)
polysaccharide
一次性培养
batchculture 0.830±0.042cB 26.36±2.54cB 44.50±4.03cB
恒速流加
contantfeeding 1.901±0.050bB 42.82±4.03bB 95.68±3.99bB
变速流加
variousfeeding 3.860±0.056aA 143.69±2.26aA 268.64±2.47aA
注:同列中标有不同大写字母者表示组间差异极显著 (P<0.01),
标有不同小写字母者表示组间差异显著 (P<0.05), 下同。
Note:Themeanswithdiferentcapitalleterswithinthesamecolumnare
verysignificantlydiferentatthe0.01probabilitylevel, oneswith
diferentlitleletersbeingsignificantlydiferentatthe0.05prob-
abilitylevel, etsequentia.
而变速流加培养的生物量 、蛋白质 、 胞内多糖的含
量分 别 为 ( 3.860 ±0.056) ×107 cel/mL、
(143.69±2.26)mg/L、 (268.64 ±2.47)mg/L,
分别是恒速流加的 2.03、 3.36、 2.81倍 。
本试验结果表明:流加培养能够有效消除高质
量浓度营养盐对新月菱形藻细胞生长与代谢的抑制
作用 , 且变速流加效果要优于恒速流加 。
2.3　不同流加量对新月菱形藻生长及代谢的影响
为了进一步提高新月菱形藻的生物量 、 蛋白
质 、 胞外多糖含量 , 根据式 (1)和式 (2)设定
6个不同流加量的变速流加试验组 , 以确定变速流
加培养中最佳流加方式。试验结果见表 6。从表 6
可见 , 在不同流加量下 , 新月菱形藻的生物量 、 蛋
白质 、胞内多糖的含量均存在显著差异 。当培养总
体积为 15 L、 控制流加量为 3.0 ～ 7.5时 , 新月菱
形藻的生物量 、蛋白质 、胞内多糖的含量均随着 K
值的增大而增大 , 但当流加控制因子 K=0.208
(即流加量为 7.5 L)时 , 新月菱形藻的生物量 、
蛋白质 、 胞内多糖的含量最大 , 分别为 (4.106 ±
0.061)×107 cel/mL、 (170.05 ±4.22)mg/L、
(286.18±4.30 )mg/L;当 K>0.167 (即流加量大
于 6.0 L)时 , 增大的幅度减小;当 K=0.125 ～
0.167 (即流加量为 4.5 ～ 6.0 L)时 , 各指标值都
较高 。考虑生产中的实际情况 , 流加量应控制在总
培养液的 30% ～ 40%。
表 6　不同流加量下新月菱形藻的培养试验结果( x±s, n=3)
Tab.6　Theresultsoffed-batchwithdifferentfeedingrates
底液量 /L
basesolution
流加量 /L
feedingquantity
生物量 /(107cel· mL-1)
biomass
蛋白质 /(mg· L-1)
protein
胞内多糖 /(mg· L-1)
polysaccharide
7.5 7.5 4.106±0.061aA 170.05±4.22aA 286.18±4.30aA
9.0 6.0 4.010±0.102bB 164.20±3.46bB 272.14±3.22bB
10.0 5.0 3.860±0.056bB 143.69±2.26cC 268.64±2.47cC
10.5 4.5 3.770±0.048cC 112.06±2.87cC 238.23±3.33dD
11.0 4.0 3.320±0.103dD 81.18±4.20dD 206.74±3.21eD
12.0 3.0 3.100±0.093eD 65.75±3.54eE 119.88±3.14fE
213第 3期　　　　　　任莉红 ,等:用流加培养技术在光生物反应器中培养新月菱形藻的研究
3　讨论
本试验结果表明:适宜质量浓度的营养盐可使
新月菱形藻的生长达到最佳状态 , 但加入过量会抑
制细胞的生长。与一次性培养相比 , 流加培养可以
显著提高细胞密度和促进次级代谢产物的积累 , 而
变速流加较恒速流加的效果更为显著 。流加培养技
术可以使营养盐的起始浓度维持在较低水平 , 使藻
较快适应新环境 , 缩短延迟期 , 消除或缓冲代谢产
物对细胞分裂的抑制作用[ 10] 。也可以通过调节培
养过程中营养盐的质量浓度和藻液中的光强 , 使藻
充分吸收营养和光能 , 较长时间处于对数生长期 ,
从而获取较大的生物量 , 这些效果在变速流加培养
中尤为显著 。在藻生长的过程中 , 营养盐的供给量
必须与藻细胞生长对营养盐的需求量相当 , 才能使
藻保持高速率生长 , 获取高密度的藻液 , 从而为次
级代谢产物的积累奠定基础。
营养盐是影响次级代谢产物如多糖 [ 11] 、 多不
饱和脂肪酸 [ 12]积累的环境因子 , 适宜质量浓度的
营养盐可促进次级代谢产物的积累。流加培养方式
可调节藻细胞生长过程中营养盐的质量浓度 , 因此
可以找到一种合适的流加培养方式 , 使藻液中营养
盐的浓度环境与产物积累所需的营养盐的浓度环境
相近 , 以促使次级代谢产物高度积累 。就高密度培
养新月菱形藻以及利用新月菱形藻生产多糖 、 多不
饱和脂肪酸等次级代谢产物而言 , 流加培养模式是
可以尝试的 。
参考文献:
[ 1] 　王彩理 ,任建国.密封袋半连续培养新月菱形藻 [ J] .信阳师范
学院学报:自然科学版 , 2004, 17(1):88-91, 118.
[ 2] 　王丽卿 ,黄旭雄.不同营养盐浓度下微绿球藻生长及水体中氮
磷的变化 [ J] .上海水产大学学报 , 2002, 11(3):215-218.
[ 3] 　王长海 ,欧阳藩 ,周碱.光生物反应器及其研究进展 [ J] .海洋
通报 , 1998, 17(6):79-83.
[ 4] 　焦改志.单胞藻培养过程中接种和添加培养液应注意的几个
问题 [ J] .海洋学报 , 1993(6):15-16.
[ 5] 　WHITAKERA.Feb-batchculture[ J] .ProcessBiochemistry,
1980, 5:1-5.
[ 6] 　SUZNKIT, MOCIH.Automaticsupplementationofmineralsin
fed-batchculturetohighcelmassconcentration[ J].Biotechn-
ol, 1985, 27:2-7.
[ 7] 　王克明.流加培养对杜氏盐藻生物量的影响 [ J] .浙江科技学
院学报 , 2005, 17(3):167-170.
[ 8] 　田治立 ,王长海 ,于贞.纤细角毛藻培养条件的优化 [ J] .海洋
科学 , 2005, 29(2):1-7, 36.
[ 9] 　BOROWITZKAMA.MicroalgalBiotechnology[M] .Cambridge:
CambridgeUniversityPress, 1998:457-465.
[ 10] 　王长海 ,孙颖颖.球等鞭金藻细胞生长抑制因子的初步研究
[ J] .海洋通报, 2006, 25(3):29-33.
[ 11] 　ARADS, FRIEDMANO, ROTEMA.Effectofnitrogenonpoly-
saccharideproductioninPorphyridiumsp.[ J] .AppliedandEnvi-
ronmentalMicrobiology, 1988, 54(10):2411-2414.
[ 12] 　JAIMEF, DIGNAG, EVERM.Renewalrateofsemi-contin-
ousculturesofthemicroalgalP.cruentummmodifiesphycoe-
tythrin, exopolysaccharideandfatyacidproductivity[ J].Journal
ofFermentation＆Bioengineering, 1998, 86(5):477-486.
Fed-batchCultureofalgaNitzschiaclosterium
inaphotobioreactor
RENLi-hong1 , SUNLi-qin1, 2 , WANGChang-hai1, 2
(1.OceanColege, YantaiUniversity, Yantai264005, China;2.SchoolofEnvironmentalandBiologicalScienceandTechnology,
DalianUniversityofTechnology, Dalian116024)　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
Abstract:Thebatchandfed-batchculturemethodswereemployedtoinvestigatetheefectsofculturemodeon
growthofalgaNitzschiaclosterium.Theresultsshowedthatthediferentfashionsoffed-batchculturehaddistinct
efectsongrowthandproductionofproteinandpolysaccharideinthealga.Whenthealgawasfed-culturedwith
invariablefed-velocity, theceldensity, contentsofproteinandpolysaccharideatthe10thdaywere(1.901 ±
0.043)×107cel/mL, (42.82±4.03)mg/L, and(95.68±3.99 )mg/L, respectively, equalto2.29 times, 1.60
timesand2.15timesofbatchculture, respectively.Whenthefeedingrateoffed-batchwasvariable, thebiomass
ofthealgaatthefed-rateof0.167 wasabout4.83 timeshigherthanthatculturedbymethodofbatchculture.
Likewise, thecontentsofproteinandpolysaccharideincreasedby6.23 timesand6.12 times, respectively.
Keywords:Nitzschiaclosterium;fed-batchculture;biomass;protein;polysaccharide
214 大 连 水 产 学 院 学 报　　　　　　　　　　　　第 23卷