全 文 ：卉寿法业 2 0 9年第 26 卷第 2 期 h S an d on gF i sh r e i e s2 00 9, 26 (2 )
摘要 用酿酒酵母 ( sa c hc a拍m y c es 。 , “ s ia 。 )和醋酸醋杆菌 ( Ace t o ba c etr 。 ce i)t 发酵海带 , 将发酵液作为添加剂加
人盐藻 ( D un 8l i e lal s i8l n 。 ) 、 新月菱形藻 ( iN如 he ia c lo setz u m。 ) 基本培养液 ( 1F 2培养液 ) 中 , 定期计数以检测其生长状
况 。 结果表明 : 海带发酵液对盐藻和新月菱形藻 2种单胞藻生长具有促进作用。 发酵液体积分数分别为 .2 5% 和 5% 时 , 盐
藻生长状况相似 , 而新月菱形藻则是在发酵液体积分数为 .2 5%时生长旺盛。
关挂词 海带 发酵 盐藻 新月菱形藻
单细胞藻类广泛分布于海洋、 湖泊水域中。 由于它
们为单个细胞生物体 , 故以单胞藻称。 单细胞藻类中的
饵料种 , 大多数具有生长繁殖快 , 对环境适应力强 , 培
养周期短的特征 , 可在人工控制条件下大量培养获得高
产。 由于它们的生长繁殖适温与鱼 、 虾 、 蟹 、 贝类育苗
相吻合 , 所以在水产动物人工育苗中 , 列入食物系列中
必不可少的基础生物饵料 。 随着人工育苗技术的成熟 ,
单细胞藻类在贝类 、 虾蟹类、 鱼类人工育苗中得到了广
泛应用。 单细胞藻类不仅为水生动物幼体提供了适口的
饵料 , 而且在一定程度上改善育苗水质 , 其在水产养殖
中占据着重要的地位l] 。
天然海藻尤其是褐藻中含有植物营养和微量元素 ,
海藻中近一半的碳水化合物是褐藻酸 、 昆布多糖和甘露
醇lz] 。 目前已研制出多种用海带制备的海藻肥 , 生产工艺
主要有 4种 : l) 碱提法 : 用碱液将海藻消解后过滤 , 这
种处理方法得率很高 , 90 % 以上的活性成分得以保留在
产品中 , 但仍有约 5% 在过滤中损失 ; 2 ) 中型水解 : 得
率较低 , 约 30 % 一 4%0 的干物质顺利被水溶出; 3) 酸提
用微酸溶液 ( .0 ol m 。比的盐酸 ) 消解 ; 4 ) 机械法 : 这
种方法避免了使用任何化学试剂 , 加热 、 冷冻或脱水处
理 , 而且使用机械压力使细胞破碎 , 使海藻中很多的化
合物以天然状态释放 l3] 。
本文采用生物发酵的方法 , 以酿酒酵母和醋酸醋杆
· 由山东大学威海分校大学生科技创新项目“ 海藻提取液的制
备及其对作物生长发育的影响” (项目编号 : A 07 06 1) 与威海市科
技项目 “ 大型海藻的原料资源与生产工艺研究 ” (项目编号 :
的佣4 134 206 13 ) 资助 .
收稿日期: 20 8一 12 一03
菌2: l组成的混合菌发酵海带 , 然后将发酵液作为一种天
然有机营养物添加到 2种单胞藻— 盐藻和新月菱形藻的基本培养液中进行试验 , 以研究海带发酵液对单胞藻
生长的作用。
1 材料与方法
!
.
! 材 料
1
.
1
.
1实验用的干海带 、 酿酒酵母 、 醋酸醋杆菌 、 盐藻 、
新月菱形藻均由中国海洋大学动物生物学研究室提供。
试验用的药品均为分析纯 。 试验用的海水为陈海水 , 经
砂滤及滤纸过滤并灭菌制备 。
1
.
1
.
2 试验仪器 : 恒温振荡器 SH A一 C 、 飞鸽牌离心机
( A
n k e GL一 2 0G一 1 )
、
TU一 15 0 0 紫外可见分光光度计 、
HPG礴X() H 人工气候箱等。
1
.
1
.
3单胞藻培养用的l2F 培养基按孙颖民等3I] 提供的方法
配制 。
!
.
2 方 法
1
.
2
.
1海带发酵液的制备 l) 将干海带洗净在烘箱中烤
干 , 用粉碎机粉碎至粉末 , 20 目过筛 , 取 5 0 9加人 Z L
蒸馏水 , 然后加人盐酸调 PH值至 .3 0 , % ℃下酸解 24 小
时 ; 2 )用纱布过滤后 , 测定发酵前样液的 p H 、 总糖 、 总
还原糖 、 总酸度 、 总氨基酸 、 总蛋白 , 然后向滤液中添
加蒸馏水至 Z L , 加人 10 9葡萄糖 , 配成培养液 , 1巧℃
高压灭菌 30 分钟 ; 3 ) 向培养液中加人酿酒酵母和醋酸
醋杆菌 , 酿酒酵母 : 醋酸醋杆菌为 2 : 1 , 其中酵母浓度为
2 x I J 个m/ l , 37 ℃下发酵 60 小时 , 1 s o lr 分钟离心 10
分钟得发酵液。
1
.
.2 2发酵液指标的测定
开奇法业 29 0年第 26卷第 2期 S ha n do ng i Fs he ri e s 209 0, 2 6 ( 2 )
1
.
.2 2
.
1发酵液总糖的测定14 1) 标准曲线的制作 : 分别
取 10 闻m l葡萄糖标准溶液。耐 、 0 . 1耐 、 :.0 ! 耐 、 .0 3 ml 、
0
·
4 m l
、
0
·
S ln
、
0
.
6 m l
、
0
.
8 m l加入 8支试管中并编号 ,
用水补足到 1 . 0 血 , 再各加人 10 耐葱酮试剂摇匀 , 同时
置于沸水浴中 , 精确反应 7分钟 , 立即取出置于冰水浴
中迅速冷却 。 待溶液达室温后以空白管为对照 , 测各管
62 O ln 处的 A62D 。 以含糖量为横坐标 , sA 加为纵坐标作标
准曲线。 2 )样品测定: 取 4支试管编号 , 各加人待测溶
液 1. 0 m l , 空白管用 1 . o ml 水代替 , 再向各管加人 or d
葱酮试剂摇匀 , 按 l) 进行操作 , 读取 A。 的光密度值 ,
算出平均值。 利用标准曲线查出含糖量 。
1
.
.2 .2 2 发醉液总还原糖的测定阎 吸取 s ml 发酵液放人
25 m m / 20 m m试管中 , 向另一试管中加人 s ml 蒸馏
水 (作为对照液 ) , 向各试管中加入5 耐萨氏试剂 , 摇匀 ,
试管口盖以玻璃球 ,把试管加人沸水浴中加热一定时间 ,
取出后迅速冷却徐徐加人 2 ml KI 溶液 , 接着迅速加人
1
.
5 m l l m ol lL H ZSO ;溶液 , 摇匀使沉淀全部溶解 , 用
N心 20 3标准溶液 ( .0 ol mo 巩 )滴定 。 滴定接近终点时 ,
溶液变为淡黄色 , 加人 l ml 淀粉指示剂 , 继续滴定至蓝
色消失为止 。 记录 N a ZS 0 3标准溶液消耗量 。 同时做空白
试验。
1
.
.2 .2 3 发酵液总蛋白的测定14 1) 标准曲线的制作: 分
别取 10 叼m l牛血清白蛋白溶液 0 m l 、 0 . 2 。 11、 0 . 4 m l 、
0
.
6 m l
、
0
.
8 m l
、
1
.
0 m l加人 6支试管中并编号 , 用水补
足到 1 . 0耐 , 再各加人 5 .0 耐考马斯亮蓝液 , 加人考马斯
亮蓝-G 250 蛋白试剂后摇匀 , 放置 2分钟然后在 595 n m
波长下比色测定并记录 A59 。 以各管相应标准蛋白质含
量 ( 林g ) 为横坐标 , A , 为纵坐标作标准曲线 。 2) 样品
测定: 试管中加发酵液样品 1. o lm , 再加人 .5 o iln 考马斯
亮蓝 -G 250 试剂并摇匀 , 放置 5分钟后 , 在豹5 n m 波长
下比色 , 记录 A S , 。 根据所测 sA , 从标准曲线上查得蛋白
质含量 。
1
.
.2 .2 4发酵液总氨基酸的测定 l5] 移取 2份 5 。 U发酵液 ,
各用蒸馏水稀释 10倍 , 其中一份加人 3滴中性红指示剂 ,
用0 . l m 。讥氢氧化钠标准溶液滴定至由红变为唬拍色为
终点 , 用 1 m ol lL 氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色为终
点 。 分别记录 2 次的碱液毫升数 , 计算结果 。
1
.
.2 2 5 发酵液总酸度的测定slI 吸取发酵液 s ml , 加人
酚酞指示剂 . 用氢氧化钠标准溶液 ( .0 01 m o l J )滴定至
微红后 30 秒不褪色记录消耗 Nao H标准溶液体积 , 计算
结果。
1
.
.2 3发酵液肥效研究
1
.
.2 3
.
1试验设置 3组 : 对照组 、 实验组 I 、 实验组 n 。 其
中各实验组均为 3瓶 , 并根据所测得的总糖含量 , 合理
设置实验组中加人的发酵液的量 。
1
.
.2 .3 2对照组仅加人 1F 2培养液 , 实验组 I 和 n加入的
发酵液的体积分数分别为 .2 5% 和 5% 。 其中盐藻和新月
菱形藻的培养液总体积分别为 1 80 iln 和 160 ml 。
1
.
.2 .3 3将得到的 14 瓶单胞藻培养液在 12 1℃下灭菌20 分
钟 。
1
.
.2 3.4 在无菌操作台中 , 接种经活化的藻种。 盐藻接种
量均为 20 ml , 新月菱形藻接种量均为 40 ml , 使藻液恰
好为 20 耐 , 藻种密度达到 1护个 /耐 。
1
.
.2 3
.
5 将培养瓶放在生态培养箱中培养 , 控制温度 25 .0
士 0
.
1℃ , 湿度为 ( 24 .0 上 0 . 1) % , 在 3 《XX) lx 光照下照
射 16 小时 , 然后黑暗 8小时。 每天摇晃培养瓶 1 一 2次。
1
.
.2 .3 6 培养周期为 7天 , 每天用血球计数板计数藻数量 。
上述试验重复 3次 。
2 实验结果
2
.
1 发酵液的指标
发酵前 p H为 7 .0 , 总糖含量为 1 . 35 叭 , 总还原糖
为 1.0 0 ~ 0讥 , 总蛋白为 .0 0 83 m岁ltn , 总氨基酸为 2.6 1
mm o比 , 总酸度为 .0 60 m m o讥 ; 发酵后 pH : 5 一 6 , 总糖
为 1 . 10 叭 , 总还原糖为 36 .9 ~ 。砚 , 总蛋白为 o . 103 m岁
lnI
, 总氨基酸为 3 . 8 7 m m o lL , 总酸度为 12 . 16 m m o ljL 。
将上述实验数据制成相对值图表 (见图 l) , 以便结
果分析 。
圈 , 发醉液发醉前后指标相对值比较
结果表明 : 酿酒酵母和醋酸醋杆菌海带发酵液发酵
前后各个指标均有明显变化 , 其中总糖含量降低 ; 总还
原糖 、 总氨基酸量及总酸度显著增高; 总蛋白含量升高。
2
.
2 盆藻 、 新月芝形藻数1 变化
卉寿违业 9 20 0年第 2“ 卷第 “ 期 S ha n do ng i Fs he ri es 2 09 0, 2 6 (2 )
表 1 盐藻数t 的变化 (单位 : 1伊个闹 )
培养时间(小时 )
对照组
实验组 I (2 . 5% )
实验组 n (5 . 既 )
0 24
l 0
l O
34
46 士 9 27 士 3
勺
2 1 士 5
36 士 4 27 士 5 48 士 6 26 士 2 3 1 土 6
4 5 土 12 22 士 4 40 士 4 36 士 7 27 士 1 3 1 士 2
盐藻 、 新月菱形藻种群数量测试结果见表 1 、 2 , 以
数量为纵坐标 , 以培养时间为横坐标得图 2 、 3 。
.2 2
.
1盐藻种群数量变化
经方差分析 , 对照组与各实验组之间 , 各培养时间
藻的数量差异极显著 ( P< .0 0 1 )o
由图 2可知 , 实验组与对照组比较 : 培养 72 小时 ,
对照组 、 实验组 I 、 1 藻数量分别为 4 0 、 3 6 、 2 2 ( x
10 ( xX)个 /m l) , 对照组数多于实验组 。 此外实验组盐藻 图 2 盐旅数 t 的变化
数量均在对照组以上 , 其中在 12 0小时时 , 对照组 、 实 间比较发现 : 二者变化趋势一致数量差别不大 , 体积分
验组 I 、 n藻数量分别为 18 、 48 、 36 ( X 10 以x〕个 /m l) , 数为 .2 5% 和 5% 的发酵液对盐藻的促进作用相似 。
说明海带发酵液对盐藻生长有促进作用 。 实验组 I 、 n .2 .2 2新月菱形藻种群数量变化
表 2 新月菱形旅数. 的变化 (单位 : 1少个 /inl )
培养时间(小时 )
对照组
实验组 I (2 . 5% )
实验组 n (5% )
l 0
I 0
28 士 3 20 士 5
44 士 8 19 土 4
35 士 7 66 士 5 6 7 士 12 72 士 2 82 士 5
27 士 3 30 士 6 36 士 8 36 士 7 42 土 8
经方差分析 , 对照组与各实验组之间 , 各培养时间
藻的数量差异极显著 ( P< .0 ol o)
图 3 新月菱形旅数t 的变化
由图 3可知 , 实验组与对照组比较 : 培养 0 一 48 小
时 , 对照组藻数量多于实验组 ; 培养时间为 48 一 16 8小
时 , 实验组 I 藻数量均在对照组以上而实验组 n在培养
14 小时时低于对照组 , 如在培养 14 小时时 , 对照组 、
实验组 I 、 1分别为 34 、 8 2 、 40 ( x 10 0X() 个 /m l ) , 实
验组数明显高于对照组 , 说明培养时间大于48 小时时海
带发酵液对新月菱形藻生长有促进作用 。 实验组 I 、 1
间比较发现 , 培养 0 一 48 小时时 , 实验组 n数量多 , 此
外 , 实验组 I数量远多于实验组 n , 尤其在培养% 一 168
小时过程中 , 实验组 I数量接近或超过实验组 n 的2倍 ,
说明培养时间大于48 小时时 , .2 5% 的海带发酵液对新月
菱形藻的生长促进作用更强 。
3 讨 论
3
.
1培养 72 小时时 , 盐藻数量对照组多于两实验组 , 可
能是取样时对照组样品未摇匀导致藻细胞数过高。另外 ,
也可能是在培养过程中 , 盐藻利用发酵液中的某种物质
代谢产生了抑制自身生长的物质 , 而后随着代谢的继续
将这种抑制物分解使得藻数量正常增加超过对照组 。
3
.
2 培养 0 一 48 小时时 , 新月菱形藻数量对照组多于两实
验组 , 可能是取样时 , 对照组样品未摇匀导致藻细胞数
过高。 另外 , 也可能是发酵液中含有某种不利于新月菱
形藻生长的物质 , 但随着代谢过程这种物质被分解 , 使
得藻数量正常增加超过对照组 。
3
.
3 由实验可知 , 海带发酵液虽对 2种藻生长均有促进作
用 , 但对不同单胞藻的作用也不同。 本实验仅对盐藻和
新月菱形藻 2种单胞藻在体积分数为 .2 5% 和 5% 的海带
发酵液下的生长情况进行研究 。 为了进一步研究海带发
酵液的肥效 , 需要对多种单胞藻 , 添加不同浓度的发酵
液进行研究。
3 .4 本实验中海带发酵添加的菌种是酿酒酵母和醋酸醋杆
卉寿渔业 29 0年第 26卷第 2期 S ha n do ng i Fs he ri e s 2 009 , 26 ( 2 )
自2 0( 刃年以来国内外许多专家学者对方斑东风螺的
人工育苗和养殖进行了比较详细的研究 , 但对方斑东风
螺从浮游幼体向甸甸幼体变态期间营养需求的研究还较
少 。 资料 〔 , 一 4 〕表明: 方斑东风螺在浮游幼体阶段为植食
性 , 即以单胞藻为食 , 当附着变态为甸甸幼体 , 进人底栖
期后即转为动物肉食性 , 其变态前后存在着明显的食性
转变 。 目前人工育苗生产中 , 均投喂鱼 (蟹 ) 浆或碎鱼
(蟹 ) 肉以满足其变态幼体的摄食需要 。 但投喂鱼 (蟹 )
浆小颗粒肉糜悬浮于养殖水体中 , 不能被已变态的底栖
生活的甸旬幼体摄食 , 容易污染水质 ; 大颗粒肉糜虽然
沉于水底 , 但也不能被甸甸幼体完全摄食 , 养殖人员又
没有办法及时将它们清除 , 极易造成底质污染 。 因无法
获得足够的食物和营养 , 加上水质恶化 , 容易导致浮游
幼体和甸甸稚螺因病害大量死亡 , 这是方斑东风螺育苗
过程中成活率 、 变态率低 , 种苗价格高的主要原因。
面对方斑东风螺良好的市场前景与苗种培育困难造
成的养殖发展受制的现实情况 , 努力开展方斑东风螺养
殖生产相关技术研究具有十分重要的现实意义 。 本人于
20 6年 3 一 8月在广西北海市金湾水产科学研究所下村
养殖场进行了不同饵料对方斑东风螺甸甸幼体生长影响
的研究 , 现将实验情况报告如下 。
1 材 料
!
.
! 亲裸来源及培育
亲螺来源于广西北海市自然海区采捕 , 一般培育
7 一 10 天开始产卵受精。 孵化出的浮游幼体每天收集 1次
到培育池中培育 。 在浮游幼体变态进人葡旬幼体 (即稚
螺期 ) 培育期间 , 将变态为甸甸幼体的方斑东风螺移到
另外的培育池进行实验 。
收稿日期: 20 8一 12一2
1
.
2 海水与饵杆
1
.
2
.
1实验海水 培育池规格为 4 m x 3 m x 1 . 5 m 的水
泥池。 池水深 1 . l m , 每 2砰设充气石 1个 , 充气量保持
在微波状态。 光照调节在 1 X() 0 一 1 50 lx , 水深保持在
90
一 10 e m
, 海水 p H值为 8 . 1 一 5 . 3 、 盐度为 27 一 3 0 、 水
温稳定在 28 一 30 ℃ 土 1℃ , 每天换水量加大到 30 % , 换
水器网目为60 一 8 0 目。 实验海水从海区抽取 , 经过沉淀
和沙滤池过滤处理 。 不同盐度海水用井水调节。
1
.
.2 2 肉糜及人工配合饵料的营养与投喂 肉糜为小杂鱼 、
虾蟹经过加工制作。 藻粉、 B P粉 、 虾片购自北海市金湾
水产技术开发有限公司 。
小杂鱼肉糜 (以蓝圆够为分析 )主要营养及投喂 水
分69 % 、 粗蛋白64 % 、 粗脂肪 8名5% 、 粗灰分 .7 3% ; 用
搅拌机打成肉糜后 , 用手捏成小团直接投喂 。
虾片主要由虾粉 、丰年虫粉 、 乌贼粉等配制而成 ,其
主要营养及投喂 : 粗蛋白) 4 % 、 粗灰分鉴 8% 、 粗脂肪
) 8%
、 粗纤维鉴 4% 、 水分感 7% ; 投喂前用 10 目筛
绢袋搓洗 , 合水直接泼洒投喂 。
BP粉主要由动植物蛋白、 卵磷脂 、 氨基酸等配制而
成虾片 , 其营养及投喂 : 粗蛋白) 48 % 、 粗灰分` 5% 、
粗脂肪 ) 12 % 、 粗纤维鉴 4% 、 水分共 7% ; 投喂前用 10
目筛绢袋搓洗 , 合水直接泼洒投喂 。
藻粉由纯天然螺旋藻制做成 , 其主要营养及投喂 :
粗蛋白) 5 1% 、 粗灰分毛 7% 、 粗脂肪 ) 7 % 、 粗纤维簇
3%
、 水分落 8% 、 碳水化合物 〕 8% 、 投喂前用 10 目筛
绢袋搓洗 , 合水直接泼洒投喂 。
!
.
3 实验方法与操作
根据方斑东风螺幼体生长营养需要和食性要求 ,设计
5个系列不同饵料种类 , 每个系列设 3个实验重复组 , 每
组饵料总量为螺体重的5% , 每天 10伪和 1:6的分别投喂。
菌 , 为了使发酵液的肥效更显著 , 可进一步研究最合适
的发酵用菌种及比例 。
参 考 文 献
1 宫一震 , 王韶华 . 单细胞藻种的培养技术【IJ . 内陆水产 , 2007 ,
34 (8 )
:
10一 11
2 曾呈奎 , 相建海 . 海洋生物技术 [M l . 济南: 山东科学技术出版
社 , 199 8
孙颖民 , 石玉 , 郝彦周 . 水产生物饵料培养实用技术手册 (第二
版 ) [M I . 北京 : 中国农业出版社 , 2的5
俞建瑛 , 蒋宇 , 王善利 . 生物化学实验技术!M l . 化学工业出版
社 , 2 0 5
孙平 . 食品分析【M l . 化学工业出版社 , 20 04
SH A
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n if s h e yr biiot
e er s o cur
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i n g o n ht e er e f s u fr 么c e . B ia s e d o n het i n v e s it g iat o n er s u lt s
,
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g a v e s o me er fe er
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