全 文 ：第３３卷第３期
２０１５年６月
上 海 交 通 大 学 学 报 （农 业 科 学 版）
ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＳＨＡＮＧＨＡＩ　ＪＩＡＯＴＯＮＧ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ（ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ　ＳＣＩＥＮＣＥ）
Ｖｏｌ．３３Ｎｏ．３
　Ｊｕｎ．２０１５
文章编号：１６７１－９９６４（２０１５）０３－００４３－１０　 ＤＯＩ：１０．３９６９／Ｊ．ＩＳＳＮ．１６７１－９９６４．２０１５．０３．００７
收稿日期：２０１４－０８－２９
基金项目：国家自然科学基金（３１３００５８０，３１３７０６９５）；中国博士后科学基金特别资助项目（２０１３Ｔ６０４５１）
作者简介：张洁（１９８９－），硕士生，研究方向：园林植物种质资源开发与利用，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｊｉｅｓｈｋｅ＠Ｊｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ；
申晓辉（１９６２－）为本文通讯作者，女，博士，教授，研究方向：园林植物种质资源开发与利用，Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｈｅｎｘｈ６２＠ｓｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
百子莲茎尖分生组织蛋白双向电泳体系的建立
张　洁１，孙一凡２，张　荻１，申晓辉１
（１．上海交通大学 农业与生物学院，上海２００２４０；２．上海交通大学 生命科学技术学院，上海２００２４０）
摘　要：以‘蓝色大花’百子莲（Ａｇａｐａｎｔｈｕｓ　ｐｒａｅｃｏｘｓｓｐ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ‘Ｂｉｇ　ｂｌｕｅ’）茎尖分生组织为材
料，对比研究了不同提取与裂解方法制备蛋白样品以排除多酚、多糖及核酸物质对蛋白双向电泳体
系（Ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２－ＤＥ）的干扰。提取过程采用ＴＣＡ／丙酮沉淀法和超声
波破碎法；蛋白裂解过程中分别使用苯甲基磺酰氟（Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　Ｆｌｕｏｒｉｄｅ，ＰＭＳＦ）和乙
二胺四乙酸（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ　Ｄｉａｍｉｎｅ　Ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　Ａｃｉｄ，ＥＤＴＡ）、Ｃｏｃｋｔａｉｌ（广谱性）蛋白酶抑制剂、核酸酶
Ｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｍｉｘ和２－Ｄ　Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ蛋白纯化试剂盒。制备的各蛋白样品经过７ｃｍ　ＩＰＧ（ｐＨ　３～１０）胶
条上样、电泳后发现，使用ＴＣＡ／丙酮沉淀法提取蛋白，裂解液中加入Ｃｏｃｋｔａｉｌ蛋白酶抑制剂裂解
后，用２－Ｄ　Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ试剂盒所制备的样品其双向凝胶电泳图谱效果最好，获得蛋白点数量最多，且
蛋白等电点ｐＩ主要分布于４～８之间。随后，应用分辨率更高的２４ｃｍ　ＩＰＧ（ｐＨ　４～７）胶条进行电
泳效果的验证，蛋白点在凝胶的２个方向上均得到了较好地分离，经过ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ　２－Ｄ　Ｐｌａｔｉｎｕｍ
５．０软件分析后共检测到有效蛋白点８２０个。本研究初步建立了百子莲茎尖分生组织蛋白双向凝
胶电泳体系，为后续开展百子莲属植物蛋白质组学研究提供了重要的技术保障。
关键词：百子莲；茎尖分生组织；蛋白提取；蛋白酶抑制剂；双向凝胶电泳
中图分类号：Ｓ６８２．３２　　　　文献标识码：Ａ
Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｔｗｏ－Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ
Ａｇａｐａｎｔｈｕｓ　Ｐｒａｅｃｏｘ　Ｓｔｅｍ　Ｔｉｐ　Ｍｅｒｉｓｔｅｍ
ＺＨＡＮＧ　Ｊｉｅ１，ＳＵＮ　Ｙｉ－ｆａｎ２，ＺＨＡＮＧ　Ｄｉ１，ＳＨＥＮ　Ｘｉａｏ－ｈｕｉ１
（１．Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｊｉａｏｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２００２４０，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｊｉａｏｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２００２４０，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｓｔｅｍ　ｔｉｐ　ｍｅｒｉｓｔｅｍ　ｈａｓ　ｖｉｇｏｒｏｕｓ　ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ　ｃｏｎｔａｉｎｓ　ａｂｕｎｄａｎｔ　ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ，
ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ａｎｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ　ｗｈｉｃｈ　ｃａｎ　ｓｔｒｏｎｇｌｙ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅ　ｆｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ
ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｓｙｓｔｅｍ（２－ＤＥ）．Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ，ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｙｒｏｌｙｓｉｓ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｗｅｒｅ
ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ　ｔｈｅｓｅ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｓ，ａｎｄ　ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ｔｈｅ　ｓｔｅｍ　ｔｉｐ　ｍｅｒｉｓｔｅｍ　２－ＤＥ　ｓｙｓｔｅｍ　ｉｎ　Ａｇａｐａｎｔｈｕｓ
ｐｒａｅｃｏｘｓｓｐ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ．ＴＣＡ／ａｃｅｔｏｎｅ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｗｅｒｅ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ　ｆｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ
ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ．Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌｙ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ＰＭＳＦ，ＥＤＴＡ，Ｃｏｃｋｔａｉｌ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ
ａｎｄ　ｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｍｉｘ　ｗｅｒｅ　ａｄｄｅｄ　ｉｎ　ｔｏ　ｐｙｒｏｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ　ｔｏ　ｐｒｏｔｅｃｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ　ａｎｄ　ｄｉｇｅｓｔ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ．
Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，２－Ｄ　Ｃｌｅａｎ　Ｕｐ　Ｋｉｔ　ｗａｓ　ｔｈｅｎ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｐｕｒｉｆｙ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓａｍｐｌｅｓ．Ａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｗｅｒｅ
上 海 交 通 大 学 学 报 （农 业 科 学 版） 第３３卷
ｌｏａｄｅｄ　ｏｎｔｏ　７ｃｍ，ｐＨ　ｖａｌｕｅ　３～１０ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ＩＰＧ　ｓｔｒｉｐ，ａｎｄ　ｗｅｒｅ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ　ＩＥＦ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓｅｃｏｎｄ
ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ＴＣＡ／ａｃｅｔｏｎｅ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｐｒｅｆｅｒａｂｌｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｔｏ
ｅｘｔｒａｃｔ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｃｏｃｋｔａｉｌ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ａｎｄ　２－Ｄ　Ｃｌｅａｎ　Ｕｐ　Ｋｉｔ　ｈａｄ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ
ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ｓｕｂｓｔａｎｃｅ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｍｏｓｔ　ａｍｏｕｎｔｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｗｅｒｅ
ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｐＩ　４～８ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｌ，ａｃｃｏｒｄｉｎｇｌｙ，ｔｈｅ　ｈｉｇｈｅｒ　ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　２４ｃｍ　ＩＰＧ（ｐＨ　４～７）ｓｔｒｉｐ　ｗａｓ
ａｐｐｌｉｅｄ　ｔｏ　ｖｅｒｉｆｙ　ｔｈｅ　ａｂｏｖｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｓｅｐａｒａｔｅｄ　ｂｙ　２－ＤＥ　ａｎｄ　ｍｏｒｅ
ｔｈａｎ　８００ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｐｏｔｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ　２ＤＰｌａｔｉｎｕｍ　５．０ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ
ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２－ＤＥ　ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　ｓｔｅｍ　ｔｉｐ　ｍｅｒｉｓｔｅｍ　ｉｎ　Ａｇａｐａｎｔｈｕｓ　ｐｒａｅｃｏｘ，ａｎｄ　ｐｒｏｖｉｄｅｄ　ａｎ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ
ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　ｓｕｐｐｏｒｔ　ｆｏｒ　ｆｕｔｕｒｅ　ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｐｅｃｉｅｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ａｇａｐａｎｔｈｕｓ　ｐｒａｅｃｏｘ；ｓｔｅｍ　ｔｉｐ　ｍｅｒｉｓｔｅｍ；ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ；ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｗｏ－
ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（２－ＤＥ）
　　植物蛋白质组学（ｐｌａｎｔ　ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ），虽然与人
类蛋白质组学相比起步较晚，但随 着 拟 南 芥
（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）、水稻（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ）等模
式植物基因组序列测定的完成和基因组学的深入研
究［１］，已成为后基因组时代的研究热点之一。近年
来，蛋白质组学技术已由植物群体、组织和器官水平
深入至亚细胞水平［２］，一些重要的细胞器如叶绿体、
线粒体等蛋白质组已被鉴定，并发现新的叶绿体和
线粒体蛋白质［３－４］。
蛋白 双 向 凝 胶 电 泳 方 法 （ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｗｏ－
ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｓｙｓｔｅｍ，２－ＤＥ）的应
用始于２０世纪７０年代，实验步骤通常包括蛋白质
的提取、双向电泳样品的制备、第一向等电聚焦
（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｆｏｃｕｓｉｎｇ，ＩＥＦ）、第二向ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝
胶电泳以及凝胶染色等。电泳时，蛋白质迁移速度
取决于其分子形状、分子量大小及所带电荷数，双向
电泳即利用后两项特征使不同的蛋白能够有效分
离。与单向电泳相比，它能从复杂的蛋白质混合物
中分离出更多的成分，是迄今为止蛋白质组学研究
中分离蛋白质最常用的方法之一。
由于蛋白质组学研究需要耗费大量人力、物力
和财力，因此在开展蛋白质组学研究之前进行各组
织蛋白质双向凝胶电泳体系的优化必不可少。酚类
能与蛋白结合成为不可逆的复合物，被多酚氧化酶
和过氧化物酶氧化后在双向凝胶电泳图谱上产生条
纹和人造假点［５］；多糖、核酸和脂类在双向凝胶电泳
图谱中也能引起严重的干扰［６］。因此，蛋白质的提
取和电泳样品的制备直接影响着双向凝胶电泳图谱
的质量。
百子莲（Ａｇａｐａｎｔｈｕｓ　ｐｒａｅｃｏｘ）原产于非洲南部
亚热带地区，为单子叶多年生草本植物［７］，其株型秀
丽，花茎挺立，花朵姿态优美，花色淡雅，花期为６～
８月，不仅是非常理想的地被和花境材料，也是很好
的鲜切花材料，长期以来是西方发达国家的主流高
档花卉之一，在欧美更有爱情花之誉。百子莲喜湿
润土壤，也较耐旱，广泛地应用于园林美化、切花生
产等方面［８］。目前国内外对百子莲的研究主要集中
在植物化学［９－１１］、药理学［１２－１３］、分子生物学［１４－１６］等方
面，而其基因组学和蛋白质组学的研究较少。张荻
等［１７］在对百子莲花芽分化及开花机理的研究中发
现，茎尖分生组织是研究百子莲分化发育以及体细
胞培养过程中非常重要的材料，但因其富含多糖、脂
类、酚类、核酸以及多种次生代谢产物，严重影响蛋
白提取和双向凝胶电泳图谱分离效果。因此，本研
究以蛋白质提取方法和电泳样品裂解方法作为切入
点，对百子莲茎尖分生组织蛋白双向凝胶电泳体系
进行优化，拟获得高质量的双向凝胶电泳图谱，进而
为下一步开展百子莲蛋白质组学的研究提供重要的
技术保障。
１　材料与方法
１．１　试验材料
‘蓝色大花’百子莲（Ａｇａｐａｎｔｈｕｓ　ｐｒａｅｃｏｘｓｓｐ．
ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ‘Ｂｉｇ　ｂｌｕｅ’），露地栽植于上海交通大学农
业与生物学院农场试验地。选择４年生植株的茎尖
分生组织为样品，每个样品称取０．２ｇ，然后立即进
行液氮处理，置于－８０℃超低温冰箱中保存备用。
１．１．１　主要仪器与设备
ＥｔｔａｎＴＭ　ＩＰＧｐｈｏｒ　ＴＭＩＩＩ 等 电 聚 焦 系 统 （ＧＥ
Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＳＡ），Ｔｈｅｒｍｏ　ＥＶＯＬＵＴＩＯＮ　６０型紫
外可见分光光度计，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ　５４１５Ｄ 离心机，
４４
第３期 张　洁，等：百子莲茎尖分生组织蛋白双向电泳体系的建立
Ｔｈｅｒｍｏ　Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ　Ｘ１Ｒ低温高速离心机，超声波
清洗器，超声波细胞破碎仪，雪花制冰机，Ｔａｎｏｎ
ＧＩＳ２０２０凝胶成像系统，涡旋混合器，Ｍｉｌｉｐｏｒｅ纯
水仪，Ｔｈｅｒｍｏ超低温冰箱，脱色摇床，ｐＨ 计（雷磁
ＰＨＳ－３ｅ），电子天平，小型电泳槽和电源（ＪＵＮＹＩ），
ＶｅｒｓａＤｏｃ　Ｍｏｄｅｌ　３０００凝胶成像分析系统（ＢＩＯ－
ＲＡＤ）。
１．１．２　主要生化试剂
固相ｐＨ梯度干胶条（ｐＨ　３～１０，ｐＨ　４～７，７０
ｍｍ×３ｍｍ×０．５ｍｍ），ＩＰＧ　Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ　３～１０，ｐＨ
４～７），尿素（Ｕｒｅａ），硫脲（Ｔｈｉｏｕｒｅａ），ＣＨＡＰＳ，二硫
苏糖醇（ＤＴＴ），碘乙酰胺（ＩＡＡ），Ｎｕｃｌｅａｓｅ　ｍｉｘ，
Ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｍｉｘ （Ｃｏｃｋｔａｉｌ），２－Ｄ　Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ
Ｋｉｔ均 为 ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ 公 司 产 品；Ｔｒｉｓ　ｂａｓｅ，
Ｍｉｎｅｒａｌ　ｏｉｌ，十二烷基硫酸钠 （ＳＤＳ），过硫酸铵
（ＡＰＳ），低分子量标准蛋白 Ｍａｒｋｅｒ购于 Ａｍｒｅｓｃｏ
公司；丙烯酰胺（Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ），双丙烯酰胺（Ｂｉｓ－
Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ），四甲基乙二胺（ＴＥＭＥＤ），牛血清白
蛋白（ＢＳＡ），ＰＭＳＦ，ＥＤＴＡ，甘氨酸，三氯乙酸，丙
酮，乙酸，甲醇，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，甘油，溴酚
蓝，盐酸，β－巯基乙醇，考马斯亮蓝Ｇ－２５０，琼脂糖均
为上海生工生物工程有限公司产品；其他试剂均为
国产分析纯试剂，所有试剂均用去离子水配制。
１．１．３　试剂配制
（１）１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＰＢＳ （ｐＨ　７．０）：配制０．２
ｍｏｌ／Ｌ磷酸一氢钠２２．５ｍＬ，０．２ｍｏｌ／Ｌ磷酸二氢
钠１５ｍＬ，定容至５０ｍＬ。使用前加入 ＰＭＳＦ和
ＥＤＴＡ，终浓度均为１ｍｍｏｌ／Ｌ。
（２）１ｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ　６．８）：将１２．１ｇ
Ｔｒｉｓ碱溶于５０ｍＬ去离子水中，加ＨＣｌ调ｐＨ值至
６．８，将溶液冷却至室温，定容至１００ｍＬ。使用前加
入ＰＭＳＦ和ＥＤＴＡ，终浓度均为１ｍｍｏｌ／Ｌ。
（３）考马斯亮蓝Ｇ－２５０染色液：将１０ｍｇ考马
斯亮蓝Ｇ－２５０溶于５ｍＬ　９５％乙醇中，加入８５％磷
酸，定容至１００ｍＬ，双层滤纸过滤。
（４）胶体染色液：染色液Ａ：１ｇ考马斯亮蓝Ｇ－
２５０溶于３０ｍＬ甲醇，充分溶解，再加３０ｍＬ　８５％
磷酸。染色液Ｂ：１５０ｇ乙酸氨溶于６６０ｍＬ水中，
充分溶解后加入３２０ｍＬ甲醇并混匀。使用前将Ａ
液以１∶２５的比例（Ｖ／Ｖ）缓慢加入Ｂ液。
（５）１０×电泳缓冲液：Ｔｒｉｓ　３０．２ｇ、ＳＤＳ　１０ｇ、
甘氨酸１４４．２ｇ，去离子水定容至１００ｍＬ。
（６）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 上样缓冲液：１ｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－
ＨＣｌ（ｐＨ　６．８）０．６ｍＬ、５０ｍＬ甘油、１０％ＳＤＳ、０．５
ｍＬβ－巯基乙醇２ｍＬ、１ｍＬ　１％溴酚蓝、０．９ｍＬ去
离子水。
裂解 液：７ ｍｏｌ／Ｌ 尿 素，２ ｍｏｌ／Ｌ 硫 脲、６５
ｍｍｏｌ／Ｌ　ＤＴＴ、４％ＣＨＡＰＳ、２％ＩＰＧ　ｂｕｆｆｅｒ。
（７）水化液：８ｍｏｌ／Ｌ 尿素、２％ ＣＨＡＰＳ、１５
ｍｍｏｌ／Ｌ　ＤＴＴ、０．００２％Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ　ｂｌｕｅ、５％（Ｖ／
Ｖ）ＩＰＧ　ｂｕｆｆｅｒ。
（８）平衡液：５０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ　８．８）、６
ｍｏｌ／Ｌ 尿 素、３０％ （Ｖ／Ｖ）Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、２％ ＳＤＳ、
０．００２％Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ　ｂｌｕｅ。配制好的平衡液分装
并保存在－２０℃冰箱中。（９）琼脂糖封胶液：５０
ｍＬ　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上样缓冲液、０．２５ｇ低分子量琼脂
糖、１％溴酚蓝１００μＬ。以２ｍＬ为单位分装，室温
保存。
１．２　实验方法
１．２．１　茎尖分生组织全蛋白的提取
（１）超声波破碎法：采集约０．２ｇ百子莲茎尖
分生组织于１．５ｍＬ　Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ离心管中，每１００
ｍｇ组织加入２００μＬ裂解液。冰浴超声提取蛋白：
功率为１５０Ｗ，工作２ｓ，停５ｓ，重复３０个左右循
环，４℃１５　０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｍｉｎ，弃沉淀，得到的
全蛋白提取液存放于－２０℃冰箱中待用。
（２）ＴＣＡ／丙酮沉淀法：将清洗干净的研钵和研
杵用液氮预冷。采集约０．２ｇ百子莲茎尖分生组织
于研钵中，加入液氮将组织研磨成干粉，并加入适量
１０％ ＴＣＡ／丙酮，继续研磨直至组织呈粘稠状匀浆
并无 颗 粒 状 物 质。收 集 上 述 匀 浆 液 于 ２ ｍＬ
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ离心管中，置于－２０℃冰箱中沉淀过夜，
于４℃１５　０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｍｉｎ，弃上清，分别用
预冷的丙酮、８０％丙酮、丙酮（均含０．３％ ＤＴＴ）重
悬清洗沉淀，并于４℃条件下１５　０００ｒ／ｍｉｎ离心３０
ｍｉｎ，得到蛋白质沉淀室温放置１５ｍｉｎ待丙酮挥发，
然后将蛋白干粉置于－８０℃保存。
１．２．２　蛋白质干粉的裂解
取出上述方法制备的蛋白质干粉样品称重。每
１０ｍｇ干粉加入５０μＬ蛋白质裂解液。依据不同提
取方法获得的蛋白干粉向离心管中分别加入含有１
ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ ＋ １ｍｍｏｌ／Ｌ　ＰＭＳＦ、１％（Ｖ／Ｖ）
Ｃｏｃｋｔａｉｌ及１％（Ｖ／Ｖ）Ｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｍｉｘ的蛋白质裂解
液，方法Ｅ是在加入裂解液后用２－Ｄ　Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ试剂
盒纯化蛋白（表１）。所加裂解液涡旋或超声助溶，４
℃１２　０００ｒ／ｍｉｎ离心约１５ｍｉｎ。弃沉淀，得到的全
蛋白提取液置于－２０℃冰箱中等待制备电泳样品。
５４
上 海 交 通 大 学 学 报 （农 业 科 学 版） 第３３卷
表１　百子莲茎尖分生组织２－ＤＥ样品不同制备方法
Ｔａｂ．１　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　２－ＤＥ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａ．ｐｒａｅｃｏｘｓｔｅｍ　ｔｉｐ　ｍｅｒｉｓｔｅｍ
处理项
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ
提取方法
Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄｓ
裂解方法
Ｐｙｒｏｌｙｓｉｓ　ｍｅｔｈｏｄｓ
Ａ 超声波破碎法 裂解液中加入Ｃｏｃｋｔａｉｌ，冰浴超声助溶
Ｂ　 ＴＣＡ／丙酮沉淀法 裂解液提取，冰浴涡旋助溶
Ｃ　 ＴＣＡ／丙酮沉淀法 裂解液中加入ＰＭＳＦ和ＥＤＴＡ，冰浴超声助溶
Ｄ　 ＴＣＡ／丙酮沉淀法 裂解液中加入Ｃｏｃｋｔａｉｌ和Ｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｍｉｘ，冰浴涡旋助溶
Ｅ　 ＴＣＡ／丙酮沉淀法 裂解液中加入Ｃｏｃｋｔａｉｌ裂解后，用２－Ｄ　Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ试剂盒纯化蛋白
１．２．３　Ｂｒａｄｆｏｒｄ法［１８］测定蛋白质浓度
（１）蛋白质含量标准曲线的制作：取出１０
ｍｇ／ｍＬ的ＢＳＡ样品，稀释至１ｍｇ／ｍＬ。分别吸取
０、２０、４０、６０、８０、１００μＬ于６个Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ离心管
中，用去离子水将所有样品体积加至１００μＬ，并加
入３ｍＬ考马斯亮蓝Ｇ－２５０染色液，测定各样品的
吸光度。使用 Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ　Ｅｘｃｅｌ对蛋白质样品吸光
度与其浓度进行线性回归分析并得到标准曲线。
（２）蛋白质样品浓度的测定：取出少量蛋白质
样品用缓冲液稀释至１００μＬ，加入３ｍＬ考马斯亮
蓝Ｇ－２５０染色液，测定其吸光度。并根据之前测出
的蛋白质标准曲线计算出样品的总蛋白质浓度
（μｇ／μＬ）。
１．２．４　琼脂糖单向凝胶电泳检测
取不同提取及裂解方法制得的蛋白样品１０μＬ
进行１％琼脂糖凝胶电泳，１２０Ｖ电泳３０ｍｉｎ，凝胶
放入Ｔａｎｏｎ　ＧＩＳ２０２０凝胶成像仪中进行图像扫描
分析，检测样品中核酸残留情况。
１．２．５　双向凝胶电泳
（１）胶条水化上样：水化板用超纯水清洗干净，
自然晾干。将制好的样品加入胶条槽中，取出ＩＰＧ
干胶条，胶面向下放置于样品之上，使液体浸润整个
胶条，加入覆盖油，胶条水化８ｈ。
根据标准曲线计算出７ｃｍ　ＩＰＧ胶条和２４ｃｍ
ＩＰＧ胶条的全蛋白样品上样量分别为２００和９００
μｇ，上样体积分别为１２５和４５０μＬ。
（２）第一向等电聚焦：将胶条从水化板中取出，
胶面向上放入等电聚焦板中，添加覆盖油，等电聚焦
在２０℃下自动进行，每根胶条的极限电流为５０
μＡ，详细的等点聚焦参数设置见表２。等电聚焦后
的胶条放入平衡管中于－８０℃冰箱中保存备用。
（３）胶条平衡：从－８０℃冰箱中取出装有ＩＰＧ
胶条的平衡管，进行平衡处理。第１步平衡：等电聚
焦结束后，取出ＩＰＧ 胶条，放入１０ｍＬ含有１％
ＤＴＴ的平衡液中，将平衡管置于摇床上平衡１５
ｍｉｎ。第２步平衡：将第１步平衡后的胶条放入装有
１０ｍＬ含有２．５％碘乙酰胺（ＩＡＡ）平衡液的平衡管
中，将平衡管置于摇床上平衡１５ｍｉｎ。
表２　等电聚焦参数设置
Ｔａｂ．２　Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ　ｓｅｔｔｉｎｇｓ　ｏｆ　ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｆｏｃｕｓｉｎｇ
步骤
Ｓｔｅｐｓ
７ｃｍ　ＩＰＧ胶条
７ｃｍ　ＩＰＧ　Ｓｔｒｉｐ
２４ｃｍ　ＩＰＧ胶条
２４ｃｍ　ＩＰＧ　Ｓｔｒｉｐ
Ｓｔｅｐ　１　 ５０Ｖ２ｈ ５０Ｖ６ｈ
Ｓｔｅｐ　２　 １００Ｖ３ｈ １００Ｖ４ｈ
Ｓｔｅｐ　３ Ｇｒａｄ　３００Ｖ３ｈ Ｇｒａｄ　５００Ｖ３ｈ
Ｓｔｅｐ　４　 １０００Ｖ１ｈ １０００Ｖ１ｈ
Ｓｔｅｐ　５ Ｇｒａｄ　５０００Ｖ１ｈ Ｇｒａｄ　８０００Ｖ１ｈ
Ｓｔｅｐ　６　 ５０００Ｖ３ｈ ８０００Ｖ１０ｈ
Ｓｔｅｐ　７　 ３００Ｖ１０ｈ ３００Ｖ１０ｈ
　　（４）第二向ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳：小心地将平
衡好的ＩＰＧ胶条放置于第二向１２．５％聚丙烯酰胺
凝胶胶面上，轻轻压紧使胶条和胶面紧贴，胶条碱性
端加入低分子标准蛋白 Ｍａｒｋｅｒ以便电泳完成后识
别等电点梯度方向，最后在胶面上加入琼脂糖封胶
液。将电泳装置放入电泳槽中加入电泳缓冲液，避
免气泡的产生。插上电源，７ｃｍ 的胶条８０Ｖ电泳
约３０ｍｉｎ，然后将电压调至１１０Ｖ继续进行电泳，
直至溴酚蓝移至凝胶底部时停止电泳；２４ｃｍ的胶
条以３Ｗ 电泳３０ｍｉｎ，然后１６Ｗ 继续电泳至溴酚
蓝移至凝胶底部。
（５）凝胶染色和图像扫描：超纯水清洗凝胶２
次，每次１５ｍｉｎ。加入固定液，放置于摇床上固定１
ｈ。加入考马斯亮蓝 Ｇ－２５０染色液，放置于摇床上
染色过夜。将染色的凝胶用超纯水清洗，直至凝胶
背景清除为止。利用ＶｅｒｓａＤｏｃ　Ｍｏｄｅｌ　３０００凝胶成
６４
第３期 张　洁，等：百子莲茎尖分生组织蛋白双向电泳体系的建立
像分析系统在３００ｄｐｉ下进行扫描并备份凝胶
图像。
（６） 双 向 凝 胶 电 泳 图 像 的 分 析：应 用
ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ　２－Ｄ　Ｐｌａｔｉｎｕｍ　５．０蛋白分析软件对各
２－ＤＥ凝胶图谱进行分析。
２　结果与分析
２．１　２种蛋白质提取方法的２－ＤＥ比较
超声破碎法与ＴＣＡ／丙酮沉淀法提取的百子莲
茎尖全蛋白样品中检测到的核酸含量如图１所示。
百子莲茎尖分生组织富含核酸分子，超声破碎法不
能有效去除核酸的干扰，制备的样品中仍存在着大
量的核酸分子（图１Ａ）；而ＴＣＡ／丙酮沉淀法经过液
氮研磨，ＴＣＡ／丙酮可将蛋白完全沉淀并去除大部
分残留的核酸分子，减小其对蛋白电泳的干扰（图
１Ｂ－Ｅ），所以，本实验确定ＴＣＡ／丙酮沉淀法用于百
子莲茎尖蛋白双向电泳的全蛋白样品制备。
图１　２种提取方法制备的百子莲茎尖分生组织蛋白
样品中核酸的分离效果检测
Ａ：超声波破碎法；Ｂ－Ｅ：ＴＣＡ／丙酮沉淀法；＊代表蛋白经２－Ｄ
Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ试剂盒纯化后的样品。
Ｆｉｇ．１　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ
ｓａｍｐｌｅ　ｏｆ　Ａ．ｐｒａｅｃｏｘｓｔｅｍ　ｔｉｐ　ｍｅｒｉｓｔｅｍ　ｐｒｅｐａｒｅｄ　ｂｙ
ｔｗｏ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ
Ａ：Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ　ｃｒｕｓｈｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ；Ｂ－Ｅ：ＴＣＡ／ａｃｅｔｏｎｅ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ
ｍｅｔｈｏｄ；Ｖａｌｕｅｓ　ｗｉｔｈ ＊ ａｒｅ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓａｍｐｌｅ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ａｆｔｅｒ　２－Ｄ
Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ　Ｋｉｔ．
２．２　５种蛋白质裂解方法的２－ＤＥ比较
实验中应用的裂解液包含：中性变性剂７ｍｏｌ／Ｌ
尿素和２ｍｏｌ／Ｌ硫脲，还原剂６５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＤＴＴ，两性
离子去污剂４％ ＣＨＡＰＳ和２％（Ｖ／Ｖ）ＩＰＧ　ｂｕｆｅｒ。
为了防止蛋白降解，在裂解液中分别加入了蛋白酶抑
制剂：Ｃｏｃｋｔａｉｌ（广谱性蛋白酶抑制剂），ＰＭＳＦ（丝氨酸
蛋白酶抑制剂）和ＥＤＴＡ（含锌蛋白酶抑制剂）；裂解
液中还选择性地添加了Ｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｍｉｘ以去除样品中
残留的核酸物质；为了使蛋白完全溶解，实验采取了
涡旋助溶和超声助溶的方法。
２．２．１　不同裂解方法制备的样品蛋白质含量变化
各种提取方法及裂解方法制得的蛋白样品经过
标准曲线法进行定量分析，ＯＤ值与蛋白质含量呈
现极好的线性回归（图２）。
图２　蛋白标准曲线
Ｆｉｇ．２　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｃｕｒｖｅ
　　根据标准曲线确定各处理的蛋白质含量（表
３）。
表３　不同制备方法所得样品的蛋白质含量
Ｔａｂ．３　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｐｒｅｐａｒｅｄ　ｂｙ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｍｅｔｈｏｄｓ
处理项Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ 浓度／（μｇ·μＬ－１）Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
Ａ　 ３．４４
Ｂ　 ２．０８
Ｃ　 １．９３
Ｄ　 ４．１７
Ｅ　 １．９８
Ｅ＊ ２．５９
　　注：其中Ｅ＊代表使用２－Ｄ　Ｃｌｅａｎ－ｕｐ试剂盒纯化后的蛋白质
样品。
Ｎｏｔｅ：Ｖａｌｕｅｓ　ｗｉｔｈ　Ｅ＊ａｒｅ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓａｍｐｌｅ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ａｆｔｅｒ　２－Ｄ
Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ　Ｋｉｔ．
２．２．２　不同裂解方法制备的样品蛋白质双向凝胶
电泳图谱对比
不同裂解方法制备蛋白样品的双向凝胶电泳图
谱如图３所示。除方法Ａ外，４种方法均可以得到较
好的蛋白电泳图谱，其中方法Ｂ因没有添加蛋白酶抑
制剂，导致一些低分子量的蛋白降解；而方法Ｃ与方
法Ｂ相反，由于在裂解液中添加ＰＭＳＦ和ＥＤＴＡ，蛋
白点数目比方法Ｂ略有增加。方法Ｄ和Ｅ由于裂解
液中添加了Ｃｏｃｋｔａｉｌ，有效抑制蛋白的降解，图谱中蛋
白点数目较多，同时通过添加Ｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｍｉｘ和应用２－
Ｄ　Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ蛋白纯化试剂盒去除了样品中核酸的干
扰，使得蛋白点在凝胶的酸性端可以得到较好的分
离。由此可以看出，核酸残留是造成双向电泳图谱的
７４
上 海 交 通 大 学 学 报 （农 业 科 学 版） 第３３卷
酸性端出现明显的横向条纹的主要原因，同时也影响
蛋白质的充分聚焦［１９］。经过对比分析，方法Ｄ和方
法Ｅ裂解效果较好，均可应用于百子莲茎尖全蛋白双
向电泳样品的制备。
图３　百子莲茎尖分生组织蛋白双向凝胶电泳图谱
注：各样品蛋白质含量最终确定上样量为２００μｇ（Ａ～Ｅ同表１）。
Ｆｉｇ．３　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ　ｏｆ　Ａ．ｐｒａｅｃｏｘｓｔｅｍ　ｔｉｐ　ｍｅｒｉｓｔｅｍ
Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅ　ｆｉｎａｌ　ｖｏｌｕｍｅ　ｏｆ　ｓａｍｐｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｉｓ　２００μｇ（Ａ－Ｅ　ｉｓ　ｓａｍｅ　ａｓ　ｔａｂ．１）．
２．２．３　不同裂解方法制备的样品蛋白质双向凝胶
电泳图谱有效蛋白点对比
通过ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ　２ＤＰｌａｔｉｎｕｍ凝胶分析软件
得到各图谱中的有效蛋白质点数（表４）。从表４可
以看出，方法Ｂ～Ｅ所得的有效蛋白质点数多于方
法Ａ，且有很大差异。方法Ｄ和Ｅ所得到的凝胶图
谱中的蛋白质点较多，Ｂ、Ｃ相对较少，且蛋白质点
有轻微的横条纹和拖尾现象。
表４　百子莲茎尖蛋白各双向凝胶电泳图谱有效蛋白质点统计
Ｔａｂ．４　Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｐｏｉｎｔ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　Ａ．ｐｒａｅｃｏｘｓｔｅｍ　ｔｉｐ
ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｅａｃｈ　ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ
处理项Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ 有效蛋白点Ｓｐｏｔｓ
Ａ　 １６５
Ｂ　 ３０３
Ｃ　 ３１１
Ｄ　 ３２０
Ｅ　 ３２４
２．２．４　不同裂解方法制备的样品蛋白质双向凝胶
电泳图谱蛋白等电点分布
对各凝胶图谱蛋白点的等电点分布情况进行了
统计分析（图４），９６．０％的蛋白质等电点在４～８之
间，而等电点小于４和大于８的蛋白质点仅占有效
蛋白点总数的４．０％。在５个不同处理中，方法Ｅ
能够在酸性端（ｐＩ＜４）得到最多的蛋白质点。
２．３　２种预制ＩＰＧ胶条的２－ＤＥ凝胶电泳蛋白点分
布状况比较
预制ＩＰＧ胶条的使用范围也会影响蛋白质的
分离效果。实验对各凝胶图谱的蛋白点的等电点和
分子量分布情况进行分析，并构建了百子莲蛋白点
分布图（图５）。
由蛋白点分布分析可知，８１％的蛋白质为酸性
蛋白（ｐＩ　３～７），１９％的蛋白为碱性蛋白（ｐＩ＞７）。
根据这一结果，实验选用了等电点更窄范围的２４
ｃｍ（ｐＩ　４～７）的线性ＩＰＧ胶条进行双向电泳。采用
方法Ｅ制得的蛋白样品进行胶条水化上样，上样量
８４
第３期 张　洁，等：百子莲茎尖分生组织蛋白双向电泳体系的建立
为９００μｇ。按照（表２）的参数进行第一向等点聚
焦，胶条在２次平衡后进行第二向ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电
泳。凝胶经过考马斯亮蓝染色后，得到了效果较好
的凝胶电泳图谱（图６），从图谱上可以看出，蛋白在
２ 个 方 向 上 都 得 到 了 较 好 的 分 离。 经 过
ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ　２ＤＰｌａｔｉｎｕｍ　５．０软件分析后，凝胶图
谱上能检测到８２０个蛋白点，这些蛋白点从双向凝
胶图谱上的分布来看，其等电点主要集中在４．０～
７．０，蛋白分子量主要分布在８～１２０ｋＤａ之间。
综合上述分析，使用ＴＣＡ／丙酮沉淀法提取蛋
白、裂解液中加入Ｃｏｃｋｔａｉｌ蛋白酶抑制剂，裂解后用
２－Ｄ　Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ试剂盒纯化蛋白所制备的样品双向
凝胶电泳图谱效果最好，获得蛋白点数量最多；采用
２４ｃｍ（ｐＩ　４～７）的线性ＩＰＧ胶条，可以获得高分辨
率、重复性好的全蛋白双向电泳样品，可应用于百子
莲茎尖蛋白双向电泳。
图４　百子莲茎尖分生组织蛋白各双向凝胶电泳图
谱蛋白质点等电点分布
Ｆｉｇ．４　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｐｏｉｎｔ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａ．ｐｒａｅｃｏｘｓｔｅｍ
ｔｉｐ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｅａｃｈ　ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ
图５　百子莲茎尖分生组织蛋白点的分布图
Ｆｉｇ．５　Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｄｉａｇｒａｍ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｐｏｉｎｔｓ　ｏｆ
Ａ．ｐｒａｅｃｏｘｓｔｅｍ　ｔｉｐ　ｍｅｒｉｓｔｅｍ
图６　利用２４ｃｍ　ＩＰＧ胶条得到的百子莲茎尖蛋白
双向电泳图谱
Ｆｉｇ．６　Ａ．ｐｒａｅｃｏｘｓｔｅｍ　ｔｉｐ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｇｅｌ
ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ　ｇｏｔ　ｂｙ　２４ｃｍ　ＩＰＧ　ｓｔｒｉｐ
３　讨论
３．１　ＴＣＡ／丙酮沉淀法适用于百子莲茎尖分生组织
蛋白质的提取
实验比较了ＴＣＡ／丙酮沉淀法和超声波破碎法
提取蛋白质的质量。超声波破碎法是通过振动产生
的机械力破碎细胞，细胞破碎效果比较好，所制得的
样品蛋白质浓度较高。但是，此方法可导致样品中
低丰度蛋白损失较大，并存在蛋白降解的现象，且制
备的蛋白样品中会存在大量的核酸分子（图１Ａ），这
对后续等电聚焦实验产生很大的影响，获得的蛋白
图谱质量较差。因此，富含核酸与次生代谢产物的
细胞组织不适合用超声破碎法制备蛋白双向电泳的
样品。
ＴＣＡ／丙酮沉淀法是目前提取植物蛋白的常用
方法之一，其中 ＴＣＡ能有效地抑制蛋白酶对蛋白
质的水解作用，具有降低次生代谢物质的干扰、减少
蛋白降解等优点［２０－２１］；丙酮溶液能除去样品中的酚
类及色素等干扰物质，同时实验过程中采用的高速
离心办法能较好地去除多糖的影响。很多植物样
品，如巴东木莲（Ｍａｎｇｌｉｅｔｉａ　ｐａｔｕｎｇｅｎｓｉｓ）的雌蕊柱
头［２２］、槟榔（Ａｒｅｃａ　ｃａｔｅｃｈｕ）叶片［２３］、茶树（Ｃａｍｅｌｌｉａ
ｓｉｎｅｎｓｉｓ）叶片及芽［２４］、石斛（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ　ｎｏｂｉｌｅ）叶
片等应用此方法都获得了较清晰的２－ＤＥ图谱［２５］。
而李惠敏［２６］等在研究沙田柚（Ｃｉｔｒｕｓ　ｒｕｔａｃｅａｅ）花粉
管可溶性蛋白提取的过程中发现，利用ＴＣＡ／丙酮
沉淀法提取蛋白样品的２－ＤＥ图谱带极不稳定，重
复性也不高，而利用超声波破碎法得到的２－ＤＥ图
９４
上 海 交 通 大 学 学 报 （农 业 科 学 版） 第３３卷
谱稳定性好，且重复性高，这可能是因为沙田柚花粉
管（花粉粒的内壁通过花粉外壁上的萌发孔或沟向
外伸出的细管）中含有较多的酶类、多糖类（细胞壁
地主要成分果胶及纤维素等）和蛋白，没有过多的核
酸干扰，超声波破碎法可以更均匀地破碎花粉管，提
高蛋白的提取效率。而ＴＣＡ／丙酮沉淀法易引起花
粉粒破碎不均匀，造成蛋白提取不充分而降低了实
验结果的可重复性。
３．２　２－Ｄ　Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ　Ｋｉｔ是小样品量蛋白质的最佳
纯化方法
裂解过程需充分使样品中的蛋白质溶解、解聚、
变性和还原，以使蛋白质在第一向等电聚焦电泳中
有效分离。为了达到这一目的，双向电泳样品中务
必包含中性变性剂（即尿素或尿素衍生物的混合
物），中性或两性去污剂和还原剂能够还原蛋白质中
的二硫键并使蛋白质保持还原状态。实验结果表
明，虽然在样品制备过程中，ＴＣＡ／丙酮沉淀蛋白质
可去除盐离子、脂类等干扰物质，但裂解蛋白质干粉
后使用２－Ｄ　Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ　Ｋｉｔ纯化蛋白质样品所得的蛋
白点数量更多，凝胶图像效果更好。王明娟等［２７］对
珍珠黄杨（Ｂｕｘｕｓ　ｓｉｎｉｃａ　ｖａｒ．ｐａｒｖｉｆｏｌｉａ）叶片蛋白
质提取方法的研究结果表明，２－Ｄ　Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ　Ｋｉｔ制
备样品得到的图谱清晰，蛋白点饱满，无纵向或横向
拖尾，形状规则、无条纹，电泳效果较好。郑天慧
等［２８］使用２－Ｄ　Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ　Ｋｉｔ进行大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ
ｍａｘ）花瓣蛋白双向电泳体系的优化，也获得了较好
的纯化效果。因为２－Ｄ　Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ　Ｋｉｔ能够有效地除
去蛋白质样品中的核酸、盐离子、酚类、糖类化合物
以及脂类等干扰物质，使电泳样品中蛋白质的浓度
和纯度大大增加，并保证蛋白质在其等电点处聚焦
完全，进而得到高分辨率的双向凝胶电泳图谱。但
是２－Ｄ　Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ　Ｋｉｔ价格较高，增加了蛋白质样品
制备的实验成本，适合于纯化样品量较少（０～２００
μｇ之间）的蛋白样品。
３．３　裂解液中加入Ｃｏｃｋｔａｉｌ和Ｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｍｉｘ适宜
于大样品量蛋白质的纯化
百子莲茎尖分生组织中含有较多的核酸，因此，
在细胞裂解过程中应该添加核酸酶以去除核酸的影
响。通过实验观察发现，使用含有Ｃｏｃｋｔａｉｌ和核酸
酶的裂解液处理蛋白质干粉可以达到令人满意的结
果；与使用２－Ｄ　Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ试剂盒制得的凝胶效果相
比，２种方法得到的蛋白质点数量和凝胶图谱表观
效果较为相似。在裂解液中加入核酸酶能够有效地
去除核酸干扰的影响，但需要注意的是，在加入核酸
酶之前需要先加入蛋白酶抑制剂以防止室温下蛋白
质的降解，加入核酸酶之后必须在室温下孵育以防
止其酶活性过低而无法完全地去除核酸。所以，当
需要制备的百子莲茎尖分生组织样品量较大（２００
μｇ以上）时，可以考虑选择此方法（裂解液中加入
Ｃｏｃｋｔａｉｌ和Ｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｍｉｘ，冰浴涡旋助溶）进行蛋白
样品的制备，以达到较好的效果。
杭 楠 等［２９］ 比 较 了 坛 紫 菜 （Ｐｏｒｐｈｙｒａ
ｈａｉｔａｎｅｎｓｉｓ）叶状体蛋白质双向电泳样品的多种制
备方法，实验结果表明在裂解液中加入 ＴｒｉｔｏｎＸ－
１００得到２－ＤＥ图谱最为清晰，蛋白质点聚焦最好，
基本没有水平和垂直拖尾现象，且蛋白点数最多。
杜智欣等［３０］初步建立了青岛浒苔（Ｅｎｔｅｒｏｍｏｒｐｈａ
ｐｒｏｌｉｆｅｒａ）完整叶绿体蛋白质样品的制备方法，研
究表明含有 Ｕｒｅａ以及ＣＨＡＰＳ的蛋白裂解液可以
在提取过程中获得更多的叶绿体蛋白，在裂解液中
加入ＥＤＴＡ和ＰＭＳＦ（即本实验中制备方法Ｃ）所
制备的叶绿体蛋白样品的２－ＤＥ图谱条带更多，损
失的蛋白量少，且蛋白的分辨率更高，这与本实验的
结果是一致的。由于植物样品的多样性，没有一种
特定的裂解液配方可以适用于各种样品，因此，在样
品制备的过程中，需根据样品自身的特点和研究目
的来进行方法的优化，选择最适合的变性剂、去污剂
和还原剂，进而得到高质量的２－ＤＥ图谱。
３．４　根据样品的蛋白质等电点选择合适的ＩＰＧ胶
条有助于提高蛋白质分离效果
蛋白质分离方法的比较是蛋白质组学研究的第
一步，除此之外，良好的双向电泳体系还必须具有高
分辨率、稳定性和可重复性。选择的ＩＰＧ胶条不
同，在２－ＤＥ图谱上出现的蛋白点数和２－ＤＥ图谱效
果也不同，通常采用ｐＨ 范围窄的胶条可以显著提
高清晰度和分辨率。马成梅等［３１］研究了双向电泳
中ＩＰＧ胶条对甜瓜（Ｃｕｃｕｍｉｓ　ｍｅｌｏ）叶片蛋白质的
２－ＤＥ图谱的影响，结果表明，在ｐＨ　３～１０线性、ｐＨ
３～１０非线性和ｐＨ　４～７线性的３种ＩＰＧ胶条中，
ｐＨ　４～７的线性ＩＰＧ胶条在２－ＤＥ图谱上出现的蛋
白点数最多，且分布均匀，清晰度较高；而ｐＨ　３～１０
非线性ＩＰＧ胶条在图谱上出现的蛋白点数要稍多
于ｐＨ　３～１０线性ＩＰＧ胶条。由于采用ｐＨ范围窄
的胶条可以显著提高清晰度和分辨率，因此在进行
植物组织蛋白双向电泳体系建立及优化过程中，ｐＨ
４～７的ＩＰＧ胶条应用广泛，其适用性在许多植物如
甜橙（Ｃｉｔｒｕｓ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ）叶片［３２］、大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ）
花瓣［２８］、番茄（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）子叶等组织
０５
第３期 张　洁，等：百子莲茎尖分生组织蛋白双向电泳体系的建立
中已得到证实［３３］。郝强等［３４］使用２４ｃｍ、ｐＨ４～７
的 线 性 ＩＰＧ 胶 条 对 大 叶 黄 杨 （Ｂｕｘｕｓ
ｍｅｇｉｓｔｏｐｈｙｌｌａ）、扶芳藤（Ｅｕｏｎｙｍｕｓ　ｆｏｒｔｕｎｅｉ）及北
海道黄杨（Ｅｕｏｎｙｍｕｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ　Ｔｈｕｎｂ）、金心黄杨
（Ｅｕｏｎｙｍｕｓ　ｊａｐｏｍｃｕｓ）和小叶黄杨（Ｂｕｘｕｓ　ｓｉｎｉｃａ）
等５种常绿阔叶树种叶片的蛋白双向电泳体系进行
了优化，结果表明５种植物叶片蛋白质２－ＤＥ图谱
背景清晰，分辨率高，重复性好。总之，选择的ＩＰＧ
胶条不同，在２－ＤＥ图谱上出现的蛋白点数和２－ＤＥ
图谱效果也不同。在实验过程中，可以先采用ｐＨ　３
～１０的宽范围的线性ＩＰＧ胶条观察植物组织蛋白
的整体分布，根据等电点的分布情况选择较适合的
窄ｐＨ范围的ＩＰＧ胶条进行蛋白双向电泳，进一步
得到蛋白点数更多，分辨率更高的２－ＤＥ图谱。本
研究经过对蛋白点分子量、等电点和理论蛋白分布
图进行分析，结果表明百子莲茎尖分生组织中９６％
蛋白质等电点分布在４～８之间，因此，采用２４ｃｍ、
ｐＨ　４～７窄范围的线性ＩＰＧ胶条，考马斯亮蓝染色
后可得到８２０个蛋白点，实现了对百子莲茎尖分生
组织蛋白的有效分离。
综上所述，蛋白质样品的制备是蛋白双向凝胶
电泳的关键步骤，采用不同的蛋白质制备方法会改
变蛋白质的溶解度、解聚和变性程度，这将直接影响
到双向凝胶电泳的最终效果。本试验通过不同的蛋
白提取方法及裂解方法，初步优化出一套适合于百
子莲茎尖分生组织的蛋白质双向凝胶电泳体系，为
今后开展百子莲属植物蛋白质组学的研究提供了重
要的技术保障，也为其他物种组织中含有较多核酸
的蛋白质样品的分离、纯化提供了有价值的参考。
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ｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　ｗｏｏｄｙ　ｐｌａｎｔ　ｓａｍｐｌｅｓ ［Ｊ］．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，
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ｐｒｏｔｅｏｍｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ ［Ｊ］．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２００４，４（２）：
２８５－２９８．
［７］　Ｋａｒｍａｒａ　Ｂ　Ｉ，Ｍａｎｏｎｇ　Ｄ　Ｔ，Ｂｒａｎｄｔ　Ｅ　Ｖ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｓｏｌａ－
ｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ａ　ｄｉｍｅｒｉｃ　ｄｉｈｙｄｒｏｃｈａｌｃｏｎｅ　ｆｒｏｍ
Ａｇａｐａｎｔｈｕｓ　ａｆｒｉｃａｎｕｓ ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００５，５３
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