全 文 ：粼6 卷
98 4
第6 期
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1月
海 洋 学 报
A CT 人 O C E AN L O O G I C AN S I I C A
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入 o v c m b o r . 1 9 8 4
袋磁膜 、 缘修港燕和熟鑫葬
金属破蛋白的舞导与合成
赵学武 王作芸
(山东海洋学院生物系 , 青岛 )
挤 要
将灸礁膜 、 缘管浒苔和孔石纯等分别放`入合有C d 二 一 的人工 海水进 行 诱 导 石 ,
匀浆并分离出其可洛性蛋 良质 , 通选薄柔 .穗;凝胶G 一了5凝胶过滤 , 将分布收 集 液 中
含C d : 十的部分集中 , 再过 D E A E 纤维素离子交换柱 ,进标分布收集 ,并测定其蛋 白
质及 S H基的含量 、 25 o nl 林和28 o m 林的消光值及锡的浓度 . 证实这三 种 藻 均 因
C d
` 诱导而 合成一种小分子的蛋白质 (通过凝胶过滤法测定分子量约一 万 ) 具
右 高S H基含量 、 耐热性和同己重金属结合的高亲合力 , 2沁 m睁的消光值也大于 2 80
m 协的消光值 . 由此证明真挟藻类中的,绿藻也有合成金属一硫蛋 白的特性 .
公嘱硫蛋自 ” 是 一种具有间重金属有结合能力 、 高 S H基含量 、 热稳定性和砍乏 芳 香
族氮墓酸的小分 一于蛋自质 L ’ 一 “ 二 , 卜1前尚未充分明燎其生理功能和待性 , 但尤疑地它 对 亚
金属的毒性具有解毒作用机制 , 并可能参与重金属在有机体 内的代注谢机能 红 ` ’ 攀一
自人I 。 , 、 o s h 。 5和丫 a l l e e ( 10 5 7 ) 以及 K a g e和 v : , 11。 。 ( l `)的 ) 组 ” 2 自马肾皮 j去的细 !1包
,
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:分离 和鉴定 金属硫蛋白后 , 对其在哺乳动物中的存在进行 丁广泛的研究 , 并 已训: 实多种
梅洋动物及 嵘核生物 -一海生蓝藻均具有;合成金属硫蛋 自的特性 一 ’ 一 , 但关于真核 藻 关
迄今仍 映乏报过 .
山 .j 石绳科的海藻是一种分布较为广泛的定生藻 哭 , 抗石染能力较强 , 进行具 \曰 的
研兀 , 除有探 讨重金属一般性的生理代谢规律 , 及 中毒现象扣解除毒性的机理 乙意义外 ,
还可探索能 青将此类蛋自质在多年生的定生藻的体 内之有 _七秘含量 多少 , 用 以作为硫测环
境污染的生理指标 匕 :
` 人 4踢 内几 月 北` 二l 冷全; .
曰 金属酸蛋 自-一英又名为扒 〔 比百{。 十h l 。 。 。 , 本文 以后 简札M 丁。
6期 赵学武等 :袋礁膜 、 缘管浒苔和孔石苑金属硫蛋白的诱导与合成
一 、 材料和方法
实验用的袋礁膜M浏 。对 r o从 a a n夕i 。。 。 a K j讨 l。 、 缘管浒苔E n, e , 。 r Ph a l` 。 二 a ( L . ) J.
A g和孔石苑 U劲“ eP r加 as K ej n。 , 采自青岛太平洋角湾 , 将藻用人工海水冲洗 干 净 后 ,
放入含有 5 p p m 的C d ’ “ 的人工海水中诱导 四天 , 对照组钓人工海水中不含隔 , 中间更换一
次人工海水 . 四天无彩阵藻取出 , 放在一 1 5℃下冰冻 24 小时 , 加 2份体积的 1肠 T r it 。五一10 6、
。 . 1肠刀一琉基乙醇的 0 . I M磷酸缓冲液 , p H 7 . 6 , 在研体中加石英砂研磨匀浆 , 在 20 0 9 ,
4℃离心 1时于钟 , 再 2 0 0 0 0 9 , 4℃离心 3 。分钟 , 把上清液在沸水浴中迅速加热至 60 ℃ , 保温
3分 钟 ,再 2 0 0 0 0 9 , 4℃离心 30 分钟 . 在上清液中加 ( N H ` ) : 5 0 ; 至 的肠 S , 放置冰箱 中过
夜 . 次 日 , 2 0 0 0 0 9 , 4℃离心加分钟 , 将沉淀溶入 4 m l 肠刀一琉基乙博 。 . ol M r r i s书以缓冲
液 , p H S . 6 , 在冰箱中放置 2 4小时 , 2 0 0 0 0 9 , 4℃离心 30分钟 , 经 S e p h a d e 二 G 一 7 5 `柱层析
( 2
.
7 x 一o o c m ) 用 o . o l M T r i s一 H C I缓冲液 ( p H S . 6 洗脱 , 流速 15 nl l / h , 按每 管 s m l分
部收集 , 测定 25 o m 件和 2 80 。 件的消光值 , 并用北京第二光学仪器厂生产的 W Y一 2 型 原子吸
收分光光度计测定 C d “ ` 浓度 .
将诱导组的 S e p h a d e x G 一75 分离后相当于一万左右分子量处的收集液集 中 ( 即 M T部
分 ) , 通过 D E A E “纤维素离子交换柱 ( 1 . 7 x 30 ℃ m , 预先用 T r is 一 H CI 缓 冲 液 p鸭渗平
衡 ) , 用 T r i s一 H CI 缓冲液 ( pH S . 6 ) 和 。 . 0一。 . 6M N a CI 线性梯度浓度洗脱 , 分 部 收 集 ,
测定 25 o m 协和 28 Om 卜的消光值和 C d浓度 , 并用考马氏亮蓝 G 25 o测定 C d浓度曲线的高 峰 处
的蛋白质含量 〔 ’ ` 〕 , 及用 5 , 5 `二硫代二 ( a 一硝基苯甲酸 ) 测定 S H基含量 〔 ’ 竺 ’ .
二 、 结果与讨论
在含有 5 p p m C d 竺 ` 的人工海水 中诱导四天后的海藻 , 其体内的C d 愁 `含量均有明 显增
加 , 以缘管浒苔含量最高 , 诱导后的乙d “ ` 浓度为 3 4 . 59 毫克 /克鲜重 , 其次是 孔 石 药 , 袋
礁膜的浓度最低 . 如按增加倍数来计算 , 缘管浒苔增加“ 倍 , 石纯增加 59 倍 , 袋礁膜增加
23 倍 (见表 1 ) , 在 s p p m C d 竺 ` 的海水中 , 缘管浒苔吸收的C d , 卜较其它两 种 藻 为多 (表
1 )
.
表 1 经 C d ” ,诱导四天后藻体C d Z ` 含量的变化
诱导前 诱导后
增加倍数
含量微克 /克鲜重 际准差 6 x ’ 含量俄克 /克鲜熏 { 标准差石:
孔石苑 0竺_ 卜_ _ _ 。 · 05 一 _ _ _红_ _ -竺 - _上_ 竖3 _ _ _ _ _ _ } _ _ _ _ _ _竺
缘管浒苔 0 · 5 , 1 。 · 。 3 3 4 . G
袋礁膜 0 . 3 4 7 . 8 8 0 . 4 2
界 报 6 卷
将经诱导后的海藻分离提取出的可溶性部分 , 通过 S e p h a d e x G 一了5 柱层析 , 在其分离
图谱中均可看到 C d 竺 ` 浓度曲线具有三个吸收高峰 , 分别在分子量约五万的大分 子 量 处 ,
一万左右的分子量处 (相当于 M l ’ ) , 和小分子量处 ( 图 1一 B , 2一 B , 3一B ) . 从这三 种藻的
28 o m 终和 25 o m 件的吸收曲线 ,可看出它们均具有二个明显的吸收高峰 , 其一在相当于 高 分
子量的C d高峰处 , 另一在相当于低分子量的 C d高峰处 , 其 2 80 m 卜的消光值大于 2 50 nr 件的
消光值 . 而在一万左右的 M T分子量处 , 这三种藻则表现出明显的差异 , 只有孔石药有 ,
明显的小吸收峰 , 2 50 。 卜的消光值大于 2 80 m 件的消光值 . 从孔石药的 S e p ha d 。 、 (宁一了5的分
离图谱 中 , 一万左右分子量处出现紫外的吸收峰 ,而且也符合M T 的25 o m 抖的 消光值大 于
28 0 m协的消光值的特征 , 证实在孔石鱿的可溶性部分确有 M T 存在 , 但缘管浒苔和袋 礁膜
则同孔石药明显不同 , 在一万左右分子量处不明显瑰紫外吸收高峰 , 而且 2 80 。 环的消 光值
仍大于 2 50 m协的消光值 , 也不 符合 M T的特征 . 显然 , 只通过 S e p h ad e 、 右一书的 柱层析尚
不足以证实缘管浒苔和袋礁膜存在 M ` r (图卜B , 2一B , 3一 B ) .
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袋礁月旬均 S o p h ad c x( 子一 7 5的份 弃图谱
— 2 5 Om肚 · … 2 8 O m林 - -一 C d柱一 一 2 .了义 l 0(1 o m 流速一 一 3 .酬 ,’h
1. 人— 对照组 卜 R一一 C创犯导担
此二种海藻经诱异后的 5 e p ll a d o x ( ,一石分离图谱 中均出现三个C d 三 高峰 , 这一现象与
已报道的多数哺乳动物及海洋兰仁物的分离图谱有所不同 , “ , 这此动物的 ` 一 〔{ 二 浓 度 曲
线大多数均只在相 ’气于 M T 的分 子量处有一 个高峰 , 或是在大分 一子量处也有一吸收峰 ,但 比
前者高峰明显降低 , 这一明滩差异是否反映出藻类的 M 厂「`了动物之间的不同 , 值得引起重
视 . 未加C d “ ’ 诱一导的孔石纯 、 缘管浒苔和袋礁膜三个对照组 , 其 s e p h a d e x 〔;一巧 之分离图
谱 , 与诱导组相同之处是 25 o m 排和 2 8 o m 件的吸收曲线均有二个高峰 , 其一在大 分子量处 ,
另一在小分子量处 . 但在分子量一万左右处 ,三种藻的 2 5 O m 件和 2 80 m 件的吸收曲线均没 有
峰值 , 而且整个的 C d浓度曲线均很低 , 大部分是零 , 孔石苑只有在约 5 0。 。分 子量处有痕
量存在 ; 缘管浒苔分布较乱 , 在 M T分子量也有但量太微 ; 袋礁膜在高分子量处和低 分子
量处均有微量 C d存在 (图卜 A , 2一八 , 3一 八) , 由此证实不 加C d “ ` 诱导的石珑科绿藻不能合
6期 赵学武等 : 袋礁膜 、 缘管浒苔和孔石茹金属硫蛋白的诱导与合成
创耐 l!ó` L刊 l!叫 llwel姗eswe
洗脱毫开数
图 2
2 一 B
护气
,一缘管浒苔的S e p h a d e x G 一 75 的分离图谱
— 2 5O m 卜 … … 2 8 0 . p - -一 C d柱 侧一佗夕 x 扣 。二 流速— 30 m l/ h
2一 A— 以照组 2一 B— C d诱导组
洗脱毫升数 洗 脱 毫 升一 数
图 3 . 孔石药的S e p h a d e x G 一 7 5的分离图谱
— 2 50 m 卜 …… 2 8 O m 卜 一- 一C d柱— 2 . 7 义 一o o e m 流速— 3 o m l / h3一人— 对照组 3一B— C d 诱导组
成金属硫蛋自 .
将三种海藻诱导组的 S气p h “ d “ x G 一75 分离后相当于一万左右分子量处 (即 M T 部分 )
的收集液集中 , 用 D E A E纤维素离子交换柱进一步提纯后 ,其 25 o m 卜和 2 80 m协的吸收曲线
与C d浓度曲线的高峰位置相重合 , V e均在 了。一 90 ml 之间 , 三种海藻的D E A E一纤 维 素分
离图谱中 , C d均比较集中 , 只有单一高峰 , 其 25 o m林和 2 80 m卜的吸收曲线 , 三种海藻则略
有不同 , 孔石茹和袋礁膜的吸收曲线 , 除在与C d高峰重合处有一高峰外 , 在洗脱 的 前 部
也有一小峰 , 但比主峰显著低 , 缘管浒节只有在与侃重合的高峰处 有 峰值 (图 4 , 5 ,
。 )
,
3 9 2海 洋 学 报 6卷
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洗脱体积数
图 4 袋礁膜之 M T的 D E A E 一纤维素分离图谱
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洗脱体积数
图 5 缘竹浒苔之 M T 的D E A I于夕拜在素分离图谱
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洗脱体积数
图 6 孔石茹之 M T的D E A E 一纤维素分离图谱
柱 . 了又 3 0 o m 流速一一 2 0 1 1h/
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6 期 赵学武等 : 袋礁膜 、 缘管浒苔和孔石药金属硫蛋白的诱导与合成
孔石药的 S eph ad x e G一 75分离图谱中之相当于 MT分子量处的高峰 , 其 2 80 m件的 消光
值和 25 0 n 琳的消光值分别为0 . 0 6 3和 0 . 09 7 , 两者之间之比值为 1 . 5 ,而对照组分别为 0 . 0 40
和。 . 0 53 , 比值为 1 . 3 , 诱导组仅比对照组大约 15 拓一 而缘管浒苔和袋礁膜在此 处 没 有 高
峰 ,并且 2叨 二 p的消光值也不 比 2 80 二 p的消光值高 . 通过 D F A E 一纤维素离子交换 柱 进一
步提纯后 , 孔石药 A : 5 。 / A : 。 。为 2 . 9倍 , 缘管浒苔为 2 . 。倍 , 袋礁膜为 1 . 5倍 . 而从动物 中
分离的M T ,因其氨基酸组成中芳香族氨基酸残基所占比例较低 ,所以 A : 。 。远远大于 A : : 。 ,
最高可达 15 倍 〔 ` 3 〕 . 藻类的 M `「的 A , 5 。和 A : 。 。 之比值与动物之明显不 同 , 是否因其 氨 基
酸组成的种类与比例和动物之间存在差异 , 尚需通过氨基酸的测定来验证 .
对三种藻的诱导组经 D E A E 一纤维素柱分离后的M T进行蛋 白质和 S H基含量的测定 结
果 , 孔石珑蛋白质含量 为 7 . 9微克 /毫升 , 5 1《 以半胧氨酸残基计算 )含量 为 1 . 7微克 /毫升 ;
缘管浒苔蛋白质 2 7 . 9微克 /毫升 ,半胧氨酸残基 5 . 4微克 /毫升 ;袋礁膜蛋白质 8 . 3微克 /毫升 ,
半胧氨酸残基 1 . 4 微克 /毫升 (见表 2 ) . 尽管由于定量方法准确度的局 限 性 , 出现这种
高 S H基含量的比例 , 已充分反映出其符合M T的共同特性 .
表 2 三种藻之 M T 的蛋白质与半肌氨酸含量
蛋白质含里徽克 /范升 { 半胧氮酸含最微克 /毫升 } 半胧氨酸 /蛋白质
2一19
一
17
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一
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.…孔石苑 {
缘管浒 ” …
袋礁膜 }
由本实验之上述结果 , 可以证实经 C d诱导的孔石冼 、 袋礁膜和缘管浒苔 , 均能合成与
重金属有高度亲和力的蛋 白质 , 分 子量在过 S e p h a d e x G 一75 层析中相当于一万左右 , 具有
抗热性能 , 在 60 ℃下三分钟不变性 , 并且富含有 S H基 , 此类特性与目前 已知的动物中所合
成的M T相同 , 山此可以证实真核藻类也同样具有能由重金属诱导而合成 M T的 机 制 . 但
也发现 一与动物中的M T的特异之处 : 在大分子量处 (非 M T蛋白 质 ) 也 出 现 高 峰 , 而 且
A
: 。 。
/ A
: 。 。 比值偏低 , 因之 , 关于绿藻类— 孔石药 、 袋礁膜和缘管浒苔的 M T 的特性 ,很有必要作更进一步的探讨 .
今 考 文 献
〔 1 〕
〔2 〕
〔子〕
M a r g o s h e s
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K石9 5 , J . H . a n d V a l l e e , B . L , , M e t a l l e t h i o n e i n : a e a d m i u m a n d z i n e 一 e o n t a i n i n g p r o t o i n
f r o m E q u i n e R e n a l C o r t a x
,
J
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C h e 阴 . , 2 3 5 ( 10 6 1 ) , 2 4 3 5一2 44 2 .
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8 9 4 海 洋 学 报 6卷
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,
A r e h s
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B 亡o e h e m . B i o P h y s . ,
〔 5 〕
〔 6 〕
〔 7 〕
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〔 9 〕
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〔1 1〕
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〔1 3〕
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2 7 5 1一 2 76 5 .
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m a r i n e v e 犷t e b r a t e s , M a r
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s y n t h e s i s i n t h e il e p a t o p a n e r q a s o f t h e e r a d 泞 e y l l a s e r r a t a , C o m P . B i o e几曰 m . P 人〕 , s `0 1 . , 6 2 B
( 19了9 ) , 4 r 7 一 4 2 4 .
F r a k e n n e
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F
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f r o m c a d反u m lo a d e d m u s s e l M 夕 t f l“ 5 E d “ l` s , C o 二 P
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A二 s t e r d a m , E l s e v s e r / N o r t b H o l l a n d B i o m e d , P r e s s , 土g了g , 1 9 5一 2 0 6 .
产护州州