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固定化菱形藻(Nitzschia sp.)的生长及营养成分变化



全 文 :海产底栖硅藻是匍匐型贝类鲍、棘皮动物海胆
等许多名贵海珍品苗种生产中必不可少的鲜活饵
料,其培养的成败与否、质量的好坏,都直接影响到
这些水产动物的苗种生产的成败
[1-3]。同浮游藻类
一样,底栖硅藻的大量培养中,其生长同样要受到环
境因素和营养元素的限制;另外底栖硅藻营底栖生
活,不像浮游微藻那样能立体地利用水体及高效利
用营养物质,因此它们的生长还要受到附着面积的
制约,使其扩种培养受到极大的限制,故生产性大规
模培养十分困难,致使底栖硅藻人工控制单种培养
技术未能在育苗生产中推广应用。许多育苗场往往
因底栖硅藻的供饵不足或是培养失败,使上述水产
动物苗种生产受到重大损失
[1,4-5]。
由于底栖硅藻附着生长的特性,因此不能采用适
用于大多数浮游微藻的悬浮培养技术来进行培养生
产。固定化(Immobilization)是构建生物反应器的一
项重要的生物工程技术,已涉及到代谢产物生产、污
水处理、生物传感器、种质保存以及模拟生物反应等
领域
[6-9]。微藻固定化技术的研究主要是对浮游微藻
进行固定化的初步研究,侧重生理特性、有用物质的
生产及水质调控等方面研究
[10-12]。然而,对于附着性
的微藻,如底栖硅藻等的固定化研究的意义更大,但
有关报道甚少,仅见马志珍等
[13]、邹宁等
[14] 研究了不
同固定化载体对底栖硅藻生长的影响。然而培养条
件的变化也会直接影响底栖硅藻主要营养成分含量
的变化,这也直接影响其作为鲜活饵料的质量,而相
关方面的研究尚未见报道。因此底栖硅藻的固定化
技术,对构建适合于底栖硅藻生长的光生物反应器、
进行大规模生产培养,进一步开发利用藻类资源等都
具有十分重要的意义。本实验选用底栖硅藻中的菱
形藻(Nitzschia sp.)作为研究对象,通过控制主要固定
化培养技术参数进行培养,考察其生长和主要营养成
固定化菱形藻(Nitzschia sp.)的生长及营养成分变化
邢荣莲,苏杭,苏群,王长海
(烟台大学 海洋学院,山东 烟台 264005)
摘要:选用底栖硅藻菱形藻(Nitzschia sp.)为实验对象,分别研究了 CaCl2 浓度、胶珠直径、接种密度及胶珠密度对其生长
的影响及后两因素对其主要营养成分含量变化的影响。结果表明: (1)随培养时间的延长,CaCl2 浓度对菱形藻生长有
极显著影响,在 2% CaCl2 溶液中形成的胶珠里菱形藻比生长速率最高; (2)胶珠直径对菱形藻在初期和指数期的生长
影响显著,且较小直径(2.5 ~ 3.0 mm)的胶珠较适宜菱形藻生长; (3)随接种密度和胶珠密度的提高,菱形藻的比生长
速率都有先增高后下降的变化趋势,接种密度较高(2.50×104 ~ 5.50×104 mL-1)时,固定化组的比生长速率是对照组的
2 倍左右。胶珠密度为 220 粒 / (100 mL 培养液)左右较适宜(胶珠直径 3.0 mm); (4)初始接种密度和胶珠密度试验中,
蛋白质、总糖及粗脂肪的含量固定化组低于或相当于对照组,而叶绿素的含量固定化组高于对照组。[ 中国水产科学,
2010,17(2):274-280]
关键词:底栖硅藻;菱形藻;固定化;比生长速率;营养成分
中图分类号:S97       文献标识码:A       文章编号:1005-8737- (2010)02-0274-07
收稿日期:2009-04-28;修订日期:2009-10-20.
基金项目:国家科技支撑计划(2008BAD94B04);山东省优秀中青年科学家科研奖励基金(2008BS06012);山东省黄河三角洲生态
环境重点实验室开放基金资助项目(2009KFJJ02).
作者简介:邢荣莲(1977-),女,博士,讲师,研究方向:海洋生化工程. E-mail:xingronglian@163.com
通讯作者:王长海(1962-),男,教授,研究方向:海洋生化工程. E-mail:chwang2001@sina.com
第17卷第2期
2 0 1 0 年 3 月
中国水产科学
Journal of Fishery Sciences of China
Vol.17 No.2
March 2010
第2期 275邢荣莲等:固定化菱形藻(Nitzschia sp.)的生长及营养成分变化
分含量的变化,探讨固定化底栖硅藻的生长和营养成
分的变化,为相关方面的研究提供一些有益的参考,
同时也为提高底栖硅藻的培养效率,构建底栖硅藻光
生物反应器提供理论依据。
1  材料与方法
1.1 藻种
菱形藻(Nitzschia sp.)由大连理工大学提供,烟
台大学藻类生物技术研究室纯化保种。采用加硅
f/2 灭菌海水培养基进行保种。
1.2 培养条件
实验采用加硅 f/2 培养基。培养条件为温度
(20±1)℃,盐度 31±1,光照(375±2.5) μmol·m-2·s-1,
光照周期为 24 h 光照。
1.3 载体的制备
称取海藻酸钠 2.5 g,在开水浴中慢慢搅动(约
1 h)溶入 100 mL 蒸馏水中,配成 2.5%(W/V)的凝
胶溶液,加入 2 g NaCl,煮沸消毒备用。以凝胶溶液
与鲜藻体积比为 4∶1 的比例接种藻种,充分搅匀后
制成胶-藻混悬液,用移液器吸取混悬液,滴入 2%
的 CaCl2 溶液中,约 30 min 后形成固化的海藻酸钙
胶珠。用消毒海水洗涤 2 遍后,按各试验的要求培
养于 150 mL 的三角烧瓶(100 mL 培养液)中
[15]。
1.4 实验设计
1.4.1 CaCl2 浓 度 试 验  分 别 配 制 1%、2%、3%、
4% CaCl2 溶液,灭菌备用。在无菌条件下,将密度
为 2.5×104 mL-1 的菱形藻与海藻酸钠混合,分别
滴入不同浓度的 CaCl2 溶液中形成胶珠,胶珠直径
3 mm,胶珠个数为 300 个,每组设 3 个平行。
1.4.2 胶珠直径试验 用不同型号的移液枪头分
别制备直径为 2.5 mm、3 mm、3.5 mm、4 mm 的胶珠。
藻接种密度为 1.5×104 ~ 2.5×104 mL-1,胶珠粒数
为 300 粒,培养液体积为 100 mL 。每组设 3 个平行。
1.4.3 接种密度试验 在实验室无菌条件下,分别将
密度为 0.75×104 mL-1、1.50×104 mL-1、2.50×104 mL-1、
5.50×104 mL-1 的 藻 细 胞 与 海 藻 酸 钠 混 合,在
2%CaCl2 溶液中制备成胶珠,粒径为 4 mm,粒数为
220 个,培养液体积为 100 mL 。相应接种密度的未
固定化组为对照,每组设 3 个平行进行培养。
1.4.4 胶珠密度试验 胶珠密度定义为相同的藻
初始接种总密度,相同培养液(体积 100 mL)中,三
角瓶中胶珠的数量。将海藻酸钠-菱形藻混合液滴
于 2% 的 CaCl2 溶液制备成胶珠,分别设有数量为
84 粒、150 粒、225 粒、300 粒的固定化组,每组藻最
终接种密度为 1.5×104 ~ 2.5×104 mL-1,相同接种
量未固定化组为对照,每组设 3 个平行进行培养。
1.5 测定方法
1.5.1 藻体生物量的测定 定期取 5 ~ 10 粒胶珠,
在 2% 的柠檬酸钠溶液中溶解,收集藻液并在超声
波仪器中处理 30 ~ 60 min,采用血球计数板计数。
根据公式 K=
( )N N
t t
3.322 lg lg
1 0
1 0#
-
-
计算比生长速率。
式中,N0 为 t0 天时藻细胞数,N1 为 t1 天时藻细胞数
[12]。
1.5.2 理化成分含量测定 [16] 总糖采用硫酸 - 蒽
酮比色法测定;蛋白质采用考马氏亮蓝染色法测
定;粗脂肪用乙醚采用索氏提取法测定;叶绿素采
用丙酮提取和比色法测定。
1.6 数据统计分析
实验数据采用 SPSS11.5 软件进行统计学分析。
2  结果与分析
2.1 CaCl2 浓度试验中菱形藻的生长
培养过程中观察发现,固定化藻落在胶珠中分
布较均匀,第 1 天就观察到各组胶珠内均有气泡产
生,说明藻进行光合作用,已经开始生长。第 3 ~ 4
天颜色明显变深,呈黄褐色,在三角瓶底部胶珠中的
气泡明显增多,胶珠开始自动上浮,立体分布于培养
体系中。第 8 天胶珠颜色开始逐渐变深,第 10 天胶
珠呈深褐色,开始下沉,有少量藻细胞外溢的现象,
同时在三角瓶底部也出现了少量淡黄褐色的藻落斑
点。光学显微镜检查并未发现藻细胞外部形态有大
的变化,细胞顶面观及大小等均与未固定化组相似。
CaCl2 与胶珠中菱形藻的比生长速率关系见图1。
图中所示的是不同处理培养时间相对初始时间的藻
细胞比生长速率。从图 1 可以看出,在 2% CaCl2 溶
液与海藻酸钠形成的胶珠中,藻细胞各时期的比生长
276 第17卷中 国 水 产 科 学
速率均为最快的。培养了 1 d 各组比生长速率差异
不明显(P>0.05),培养 3 d 和 5 d 组的组间比生长速
率差异显著(P<0.05),而培养 7 d 和 9 d 组的比生长
速率差异极显著(P<0.01),说明随着培养天数的延
长,CaCl2 浓度对胶珠中菱形藻生长的影响越明显。
2.2 胶珠直径试验中菱形藻的生长
不同直径胶珠中,菱形藻培养日期相对初始日
期的比生长速率如图 2 所示。从曲线中可以看出培
养初期 1 d 和培养 3 d 各组的比生长速率差异极显
著(P<0.01),直径为 3.5 mm、4.0 mm 的胶珠中藻比
生长速率明显低于直径为 2.5 mm 和 3 mm 的胶珠。
随着培养日期的延长,各组比生长速率差异也逐渐
消减。培养 5 d,直径为 2.5 mm 和 3 mm 的胶珠中
藻的比生长速率明显高于对照组。
2.3 接种密度试验中菱形藻的生长代谢
通过前述试验结果判断,指数生长末期第 6 天
(培养了 5 d)是一个关键点,图 3 只列出不同接种密
度的菱形藻培养 5 d 的比生长速率。从图 3 可以看
出,各接种密度固定化组藻比生长速率均高于对照
组。方差分析表明,在接种量较低(0.75×104 mL-1
和 1.20×104 mL-1)时,固定化组与对照组的生长差
异不明显(P>0.05);而接种量达 2.50×104 mL-1 和
5.50×104 mL-1 时,固定化组与对照组比生长速率差
异分别为显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)。
培养结束时,各组藻细胞主要生理特征如表 1
所示。胶粒密度为 300 粒 / (100 mL)除了叶绿素
含量外,其他成分蛋白质、总糖和粗脂肪含量基本
是固定化组低于或等于对照组。各成分基本在接
种密度较低时含量较高,其中蛋白质在接种密度为
0.75×104 mL-1 和 1.20×104 mL-1 时含量较高,总糖
在接种密度为 1.20×104 mL-1 时含量较高,粗脂肪
在接种密度为 1.20×104 mL-1 和 2.50×104 mL-1 时
含量较高,叶绿素在接种密度为 0.75×104 mL-1 时
含量较高。
2.4 胶珠密度试验中菱形藻的生长代谢
图 4 列出了不同胶珠密度条件下,培养 5 d 菱
形藻的比生长速率。从图中可以明显看出,固定化
组菱形藻比生长速率高于对照组,随胶珠密度的增
加,先升高后降低,方差分析表明,菱形藻生长差
异 不 显 著(P>0.05),其 中 225 粒 / (100 mL)胶 珠
组菱形藻生长最快。
图 1 不同 CaCl2 浓度条件下菱形藻的比生长速率
相同培养天数组间比生长速率的差异:“*”—差异显著(P<0.05);
“**”—差异极显著(P<0.01)
Fig. 1 Specific growth rate of Nitzschia sp. in alginate beads
with CaCl2
‘*’and “**”in the figure indicate significant differences (1-way
ANOVA α=0.05) of specific growth rates in the same culture days:
“*” — P<0.05,“**”— P<0.01
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
培养天数/d
Culture days






K)
Sp
ec
if
ic
g
ro
w
th
r
at
e(
K)
1%
2%
3%
4%
CaCl2
图 2 不同胶珠直径条件下菱形藻的比生长速率
相同培养天数各实验组比生长速率间的差异:“*”—差异显著
(P<0.05);“**”— 差 异 极 显 著(P<0.01);胶 粒 密 度 为 300 粒 /
(100 mL 培养液)
Fig. 2 Specific growth rate of Nitzschia sp. cultured with
different diameter of alginate bead
‘*’and “**”in the figure indicate significant differences (1-way
ANOVA α=0.05) of specific growth rates between experimental groups
in the same culture days:“*”— P<0.05,“**”— P<0.01;the density
of alginate bead is 300 per 100 mL
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0






K)
Sp
ec
if
ic
g
ro
w
th
r
at
e(
K)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
培养天数/d
Culture days
2.5 mm
3.0 mm
3.5 mm
对照 Control
4.0 mm
z
第2期 277邢荣莲等:固定化菱形藻(Nitzschia sp.)的生长及营养成分变化
图 3 不同接种密度条件下培养 5 d 菱形藻比生长速率
培养 5 d 固定组与对照组比生长速率间的差异:“*”—差异显著(P<0.05);“**”—差异极显著(P<0.01)
Fig. 3 Specific growth rate of Nitzschia sp. at different inoculum density after 5 days’culture
‘*’and “**”in the figure indicate significant differences (1-way ANOVA α=0.05)of specific growth rates between immobilization groups and control
groups:“*” — P<0.05,“**”— P<0.01
表 1 不同接种密度条件下菱形藻的主要营养成分
           Tab. 1 Nutritional ingredient of Nitzschia sp. of different inoculum density % 
成分
Ingredient
0.75×104 mL-1 1.20×104 mL-1 2.50×104 mL-1 5.5×104 mL-1
固定化组
Immobilization
对照组
Control
固定化组
Immobilization
对照组
Control
固定化组
Immobilization
对照组
Control
固定化组
Immobilization
对照组
Control
蛋白质
Protein
17.54 16.72 11.71 14.14 8.61 10.50 6.56 8.16
总糖
Total sugar
1.68 3.87 17.89 17.23 10.56 12.96 9.67 15.79
粗脂肪
Crude fat
12.39 18.01 19.96 17.78 20.15 19.48 10.59 16.54
叶绿素
Chlorophyll
4.76 3.83 3.84 3.08 4.06 3.07 4.32 3.95
图 4 不同胶珠密度条件下菱形藻的比生长速率
培养液体积为 100 mL.
Fig. 4 Specific growth rate of Nitzschia sp. cultured with different density of alginate beads
Volume of culture solution is 100 mL.
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0.75 1.2 2.5 5.5
接种密度 / (×104·mL-1)
Inoculum density






K)
Sp
ec
if
ic
g
ro
w
th
r
at
e(
K)
固定化组 Immobilization
对照组 Control
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
对照
Control
84 150
胶珠数量/粒
Alginate beads numbers/pill
225 300






K)
Sp
ec
if
ic
g
ro
w
th
r
at
e
278 第17卷中 国 水 产 科 学
表 2 显示,蛋白质、总糖、粗脂肪的含量都是对照
组比固定化组高,在胶珠密度较低时 [84 粒 / (100 mL)
和 180 粒 /(100 mL)] 含量较高,叶绿素含量对照组
比固定化组低。
表 2 不同胶珠密度条件下菱形藻的主要营养成分
Tab. 2 Nutritional ingredient of Nitzschia sp. under different density of alginate beads % 
成分 Ingredient
胶粒数量 / 粒 Alginate bead numbers / pill
对照 Control 84 180 225 300
蛋白质
Protein
19.02 14.63 18.21 9.97 12.05
总糖
Total sugar
26.42 10.60 8.21 4.51 5.65
粗脂肪
Crude fat
33.78 22.72 12.90 9.14 11.63
叶绿素
Chlorophyll
1.32 2.07 2.24 2.54 1.94
注:培养液体积为 100 mL.
Note:Culture solution is 100 mL.
3  讨论
3.1 CaCl2 浓度对菱形藻生长的影响
由于在不同浓度 Ca2+ 的作用下,褐藻胶中不同
糖醛酸发生交联,形成具有不同强度的不溶性凝胶
珠,其内具有不同程度的孔隙,正是这些孔隙才能使
营养物质进入胶珠内,是为藻良好生长和代谢提供
必须营养物质的主要渠道
[15]。韩丽君等
[17] 考察了
不同浓度 CaCl2 溶液与不同形式糖醛酸形成凝胶珠
后,其强度的变化规律,也证实了这一点。2% CaCl2
溶液所形成的凝胶珠的强度和孔隙度适合于其生
长,当 CaCl2 浓度低时,形成的凝胶珠的强度差,藻
细胞向培养液中分散,而当 CaCl2 含量高时,形成的
凝胶珠的强度大,增加了底物和产物进出胶珠的扩
散阻力,影响细胞正常生长。
Smidsrød 等
[18] 认为,CaCl2 浓度直接影响微藻
细胞的生长。李超敏等
[19] 认为,CaCl2 浓度影响
细胞活性。王建龙等
[19] 进行了 CaCl2 浓度对海藻
酸钙凝胶小球中微生物细胞活性的影响试验,表明
随着 CaCl2 浓度的增加,细胞的活性减弱。可能是
由于渗透压的改变,致使细胞结构变化,活性部分
丧失。
另外本实验培养过程中,还发现 CaCl2 浓度为
2% 制备的胶珠,培养时溶液澄清、透明度最好,这
也可能影响藻生长所需要的光照强度,进而影响底
栖硅藻的生长。
3.2 胶珠直径对菱形藻生长的影响
实验结果说明胶珠直径对底栖硅藻的生长初
期到指数期存在一定影响,且较小的胶珠更利于底
栖硅藻的生长。其原因可能是胶珠直径长短直接影
响物质扩散的距离,从而影响了物质扩散的速度,同
时影响透入胶珠内部的光强。因此,直径较小胶珠
中藻的营养和光照条件都要优于直径较大胶珠中的
藻,因此,有利于藻细胞分裂和生长。固定化组藻经
历了生长初期对环境的适应期,且附着面积增加,到
了指数生长末期生长明显加快,高于对照组。到生
长后期,藻的生长停滞,因而差异不显著。由此可见,
第 6 天指数生长末期是一个关键期,应作为研究和
应用的主要依据。从第 6 天比生长速率来看,胶珠
直径为 2.5 mm 和 3.0 mm 的较高。
3.3 接种密度对菱形藻的生长及其生理特征变化
的影响
Chevalier 等
[20] 研究认为,固定化藻类细胞的比
生长速率通常比自由细胞略低,但固定化底栖硅藻
细胞的比生长速率却略高于自由细胞。本实验也发
现高密度接种量固定化组底栖硅藻比生长速率明显
高于对照组,是对照组的 2 倍左右,这一结果与马志
珍等
[13] 结果一致。但随着接种密度的提高,分析发
第2期 279邢荣莲等:固定化菱形藻(Nitzschia sp.)的生长及营养成分变化
参考文献:
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现,比生长速率却都有明显的下降,说明固定化培养
过程中接种密度并不是越高越好,只有适宜的接种
密度才会促进底栖硅藻的生长。从藻的生物量和经
济成本考虑,接种密度为 2.50×104 mL-1 较适宜固
定化培养,接种量较低、较高都不利于藻细胞的生长
和繁殖。
固定化底栖硅藻的接种密度也会影响藻的生理
生化成分含量的变化。对于底栖硅藻的生长而言,受
到营养物质、环境因素和附着基质的三重限制,而生
长的改变与生理生化的变化有直接关系。相对对照
组,固定化组除了附着面积增加外,其他条件都受到
制约,这可能是造成其主要成分含量较低的原因之
一。藻类细胞在快速的生长时期,其有机物主要用于
生长而消耗,含量相对较低,但随着培养时期延长,有
机物主要用于合成产物而积累,含量相对较高
[21],因
而,获得其较高生物量与较高成分含量的条件并不
一致,从这一方面考虑,针对不同的使用目的应采用
不同的接种密度进行固定化培养。
3.4 胶珠密度对菱形藻的生长及其生理特征变化
的影响
在菱形藻密度相同情况下,胶珠的数量多,藻
细胞的生长出现了先增加后降低的变化趋势,分析
其原因可能是胶珠数量增加为底栖硅藻提供的附着
面积就越大,生长空间也越大,然而过高密度胶珠,
一方面减少了单个胶珠中藻的数量,致使不利于藻
的生长;另一方面会造成培养体系中光的遮挡和衰
减,导致正常光照范围内光合作用减弱,限制藻的生
长。因此,胶珠数量影响底栖硅藻的比生长速率,在
一定范围内与比生长速率成正相关。
4  结论
(1)CaCl2 浓度影响胶珠中的菱形藻的比生长速
率,并且随着培养时间的延长对生长有极显著影响。
2%CaCl2 溶液与海藻酸钠形成的胶珠,形态维持良
好中、孔隙合适,菱形藻比生长速率最快,并且培养
体系溶液澄清、透明度最好,降低光衰减。
(2)胶珠直径分别对菱形藻的生长初期(培养
1 d 和 3 d)和指数期(培养 5 d)影响极显著和显著,
且较小的胶珠更利于菱形藻的生长,胶珠直径为
2.5 mm 和 3.0 mm 时较适宜菱形藻固定化培养。
(3)初始接种密度和胶珠密度都对固定化菱形
藻的生长影响显著。但随着接种密度和胶珠密度
的提高,比生长速率都有先增高后下降的变化趋势。
接种密度较高(2.50×104 mL-1、5.50×104 mL-1)时,
固定化组的比生长速率是对照组的 2 倍左右。选择
适宜的接种密度和胶珠密度是提高底栖硅藻生长速
度和生物量的关键。每 100 mL 培养液中,接种密
度为 2.50×104 mL-1,胶珠数量度为 220 粒左右较适
宜。
(4)初始接种密度和胶珠密度对菱形藻主要营
养成分的含量都有明显影响。蛋白质、总糖及粗脂
肪的含量固定化组低于或相当于对照组,而叶绿素
含量固定化组高于对照组。初始接种密度和胶珠密
度提高生物量与成分含量的条件不一致,因此,针对
不同的使用目的应采用不同的接种密度和胶珠密度
进行固定化培养。
280 第17卷中 国 水 产 科 学
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Growth and nutritional ingredient of immobilized marine benthic
diatom,Nitzschia sp.
XING Ronglian,SU Hang,SU Qun,WANG Changhai
(Ocean School of Yantai University,Yantai 264005 ,China)
Abstract: The growth and nutritional ingredient of Nitzschia sp.,a marine benthic diatom,in alginate beads
were studied. The main factors during the immobilized culture including CaC12 concentration,the diameter of
alginate bead,initial inoculum density and the density of alginate bead were investigated. The results indicated
that: (1) With the culture days increasing,the specific growth rates were significantly affected by CaC12
concentration. The specific growth rate of Nitzschia sp. in beads with 2% CaCl2 was the highest. (2) The diameter
of alginate bead remarkably influenced the growth of benthic diatom in stationary phase and exponential phase. The
suitable diameter of alginate beads for cell growth were 2.5-3.0 mm. (3) There was a tendency of increasing at first
and then decreasing in growth rate of benthic diatom with the increasing of inoculum density and number of alginate
beads. The specific growth rate of benthic diatom in the immobilization groups was about 2 times as much as that
in the control groups as the inoculum densities were 2.50×104-5.50×104 mL-1. The optimal density of alginate
beads was 220 pills/100 mL. (4) In the experiment of initial inoculum density and the density of alginate bead,the
contents of protein,total carbohydrate and crude fat in the control groups were more than that in the immobilization
groups. The content result of chlorophyll compared with above result was opposite. [Journal of Fishery Sciences of
China,2010,17(2):274-280]
Key words:benthic diatom;Nitzschia sp.;immobilization;specific growth rate;nutritional ingredient
Corresponding author:WANG Changhai. E-mail:chwang2001@sina.com