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秋茄凋落叶酚酸动态变化及其对新月菱形藻的化感效应



全 文 :第53卷 第6期 厦门大学学报(自然科学版) Vol.53 No.6
 2014年11月 Journal of Xiamen University(Natural Science) Nov.2014 
doi:10.6043/j.issn.0438-0479.2014.06.021
秋茄凋落叶酚酸动态变化及其对新月菱形藻的化感效应
段罕慧,张 琼,刘景春,卢豪良,严重玲*
(厦门大学 环境与生态学院,滨海湿地生态系统教育部重点实验室,福建 厦门 361102)
摘要:采用生物测试法,以九龙江口的优势藻种新月菱形藻(Nitzschia closterium)为受体研究了秋茄[Kandelia obova-
ta(S.L.)Yong]凋落叶的抑藻作用,并利用高效液相色谱法对其分解过程中的酚酸化感物质进行了分析.通过酚酸对新
月菱形藻密度以及生理生化的影响,探讨了秋茄凋落叶对底栖硅藻的化感效应,丰富了安全、有效防治藻类的爆发的理
论依据与实践经验,为揭示红树植物与林内微藻间相互关系提供新的科学依据.对新月菱形藻密度测定的研究发现:未
分解秋茄凋落叶水提液的抑藻作用存在浓度效应,随着水提液浓度的增加,抑制作用增强;半分解秋茄凋落叶(半分解
期t50=42d)水提液对新月菱形藻的生长则无明显影响.高效液相色谱检测结果确定秋茄凋落叶中存在对羟基苯甲酸、
香草酸、丁香酸、绿原酸和咖啡酸;随着凋落叶的分解,酚酸的含量下降.标准酚酸物质及混合酸均对新月菱形藻产生化
感抑制作用,且随着浓度增大,抑制作用增强.这表明在红树林根际-沉积物-水环境界面上,红树植物凋落物对微藻的繁
殖起到了一定的调控作用,而酚酸是其中起重要作用的一类物质.
关键词:秋茄;凋落叶;酚酸;新月菱形藻
中图分类号:Q 178.1    文献标志码:A     文章编号:0438-0479(2014)06-0860-07
  
收稿日期:2014-04-18
基金项目:国家自然科学基金(31170471)
*通信作者:ycl@xmu.edu.cn
  植物的化感作用是指植物通过淋溶、挥发、残体
分解和根系分泌向环境释放化学物质,进而对周围植
物(包括微生物)产生直接或间接的有害或有利作
用[1-2].目前,利用植物的化感作用来抑制藻类生长的
研究较为活跃[3-4],其中酚酸类物质是活性较强的一
类化感物质[5-6].从穗花狐尾藻(Myriophyllum spica-
tumL.)中分离出的多种酚酸类化感物质证明对铜绿
微囊藻(Microcystis aeruginosa)的生长有较强的抑制
作用[7].杨维东等[8]发现某些酚酸类化感物质对赤潮
有害藻类塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)
的生长具有抑制作用.
红树林是海岸生态系统重要的初级生产者,是海
湾河口水生生态系统中唯一的木本植物初级生产者,
具有很高的凋落物生产量[9].红树植物残体和凋落物
是红树植物与水环境和底质环境相互影响的连接点,
其构成和含量对浮游和底栖的藻类均会产生一定影
响.残体和凋落物不仅是生态系统的重要有机碳源,
而且也是微生物重要的底物来源,同时也是环境中化
感物质的一个主要来源[10].周海超[11]建立了秋茄
[Kandelia obovata(S.L.)Yong]叶片凋落物的失重
模型,利用非线性回归分析拟合得到分解模型为y=
22.805+76.981e-0.024 7 x(p<0.000 1,R2 =
0.993 8).可 知 秋 茄 叶 片 凋 落 物 的 分 解 系 数 为
0.024 7,计算得到其半分解期(t50)为42d.
在红树林区中,硅藻是主要的微型藻类[12],在红
树林生态系统中有着重要的生态作用,与红树植物、
底栖动物和其他有关动物一起共同构成食物网,维持
着该生态系在海陆交界生态脆弱带的稳定发展.因此
研究红树植物代表物种秋茄凋落物中化感物质的成
分和含量,以及对其生境中硅藻的作用,是厘清红树
林湿地系统功能机制的关键一步.本文选择福建九龙
江红树林区的优势底栖硅藻新月菱形藻(Nitzschia
closterium)作为受试藻种,采用野外实验与室内实验
相结合的研究方法,检测了秋茄凋落叶分解过程中酚
酸含量的变化,研究了不同分解期凋落叶以及不同浓
度酚酸对新月菱形藻生长的影响,为揭示红树植物与
林内微藻间相互关系提供新的科学依据.
1 材料与方法
1.1 藻 种
实验藻种新月菱形藻由厦门大学生命科学学院
第6期 段罕慧等:秋茄凋落叶酚酸动态变化及其对新月菱形藻的化感效应
硅藻研究室保藏,采用f/2培养基培养,培养温度为
(20±1)℃,光照强度100μmol/(m
2·s),光暗周期12
h:12h,每天摇晃3次.
1.2 秋茄凋落叶样品采集
2013年4月,于林区选择树龄、高度及生长状况
较一致的红树植物秋茄植株15株进行标记.在标记
植株的林冠外侧随机采取2 000g衰老叶.衰老叶是位
于枝条下部的黄色叶片,易凋落.
1.3 凋落叶分解实验
分解实验采用尼龙网袋分解法,每袋盛凋落物
40.0g,共30袋,网眼孔径1mm×2mm,分解袋为30
cm×26cm(该面积约为40g凋落物叶片总面积),随
机平铺于秋茄林样地滩涂表面(模拟自然凋落物分布
于滩涂状况),并将分解袋固定于秋茄根部,防止被潮
水冲走.分别于28,42,112d后各取回10袋,用自来
水冲洗干净,并用蒸馏水润洗,擦干后于-20℃冰箱
内保存,用于之后的实验.
表1 酚酸高效液相色谱的检测参数
Tab.1 Parameters of phenolic acids analyzed by high performance liquid chromatography
酚酸
保留时间/
min
回归方程
相关
系数
检测限/
(μg·L
-1)
线性范围/
(μg·mL
-1)
回收率/

对羟基苯甲酸 7.390  y=0.104x-2.851  0.999  0.15  0.1~256  99.9
香草酸 8.793  y=0.107x-2.430  0.998  0.22  0.1~256  100.6
丁香酸 9.955  y=0.180x-1.128  0.999  0.55  0.05~256  100.4
绿原酸 6.803  y=0.094x-3.122  0.999  0.25  0.1~256  99.9
咖啡酸 9.090  y=0.107x-0.745  0.999  0.41  0.1~256  101.2
阿魏酸 19.405  y=0.170x-12.99  0.997  0.38  0.1~256  99.5
1.4 秋茄凋落叶水提液的制备
将秋茄凋落叶用蒸馏水洗净,自然风干后称取剪
碎的叶片10g,放入200mL经高压灭菌的三角瓶中,
加入100mL人工海水,密封后于35℃恒温水浴锅中
浸提48h,每日摇晃3次.而后将水提液过滤,得到的
滤液在5 000r/min下离心15min,取上清液,用一次
性针头式过滤器(水系)过滤除去微生物,得到实验用
水提液母液,质量浓度为100g/L[13].
1.5 秋茄凋落叶水提液对新月菱形藻生长的
影响
  将水提液母液稀释后各取1mL加入49mL初始
浓度为1.77×104 mL-1的藻液中,使得水提物的终质
量浓度分别为400,200,100,50mg/L.以添加相同体
积人工海水的藻液作为对照.实验总体积为50mL,每
个处理3个平行.实验进行6d,每天取样一次,测定藻
液在680nm的OD值.
1.6 酚酸物质对新月菱形藻的抑制效应
将5种酚酸化感物质(均为色谱纯药品)对羟基
苯甲酸、香草酸、丁香酸、绿原酸和咖啡酸用蒸馏水溶
于容量瓶中,配成200mg/L的母液,然后将母液分别
稀释不同浓度,取1mL加入到49mL处于对数期的
藻液中,配成各酚酸物质的终质量浓度分别为0.2,1,
5,25mg/L的处理液,实验前配制,超纯水作对照处
理,共3个重复.实验进行6d,每天取样一次,测定藻
液的OD值.用5种酚酸母液根据分解初期凋落叶中
酚酸物质的比例配制混合酸(25mg/L对羟基苯甲酸
+16mg/L香草酸+5mg/L丁香酸+100mg/L绿
原酸+14mg/L咖啡酸),分别稀释0倍、2倍、5倍和
10倍,取1mL加入到49mL处于对数期的藻液中,
共3个重复.实验进行6d,每天取样一次,测定藻液的
OD值.
1.7 秋茄凋落叶中化感物质酚酸含量的测定
1.7.1 色谱条件
基于分离效果与工作效率(表1),本实验选择
Hypersil-ODS,HC-C18(2),Analytical 4.6mm×250
mm反向色谱柱,并进行了优化.运用Agilent 1200高
效液相色谱及其色谱工作站测定秋茄凋落叶(未分解
和半分解)中的化感物质酚酸.Agilent 1200高效液相
色谱系统配备 G1311A四元泵、G1379A在线脱气系
统以及G1315BDAD检测器.所选用的色谱条件为:
Hypersil-ODS,HC-C18(2),Analytical 4.6mm×250
mm反向色谱柱,流动相为质量分数2%的乙酸溶液
(pH 2.6)-甲醇混合液(体积比75∶25),流速为1mL/
min,进样量为100μL,柱温(25±2)℃,检测波长为
280和320nm.
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厦门大学学报(自然科学版) 2014年
6种酚酸混合标样经高效液相色谱分析发现,各酸
在色谱图上均为单峰,可以进行很好地分离.前3种属
于苯甲酸类衍生物,后3种属于肉桂酸类衍生物.
1.7.2 秋茄凋落叶中化感物质酚酸的提取
采用在鲜样中加入超纯水振荡的方法提取酚酸
类化感物质[14-15].将鲜样冻干后,磨碎,称取0.1g,加
入1.5mL超纯水水,振荡混匀30min后,4℃离心;
取上清液,过0.22μm滤器,保存在棕色安捷伦瓶中,
-20℃保存,待测.
1.8 统计分析方法
本实验所有数据均为3个重复处理的平均值.采
用Excel进行数据初步处理和作图,用SPSS19.0软
件进行单因素方差分析、多重比较分析(LSD)和相关
分析,p>0.05,差异不显著;p<0.05,差异显著.
表2 不同分解期秋茄凋落叶中的酚酸含量
Tab.2 Phenolic acids content in K.obovataleaf litter in different period
分解时间/

对羟基苯甲酸/
(μg·g
-1) 香草酸/(μg·g
-1) 丁香酸/(μg·g
-1) 绿原酸/(μg·g
-1) 咖啡酸/(μg·g
-1)
平均值 标准偏差 平均值 标准偏差 平均值 标准偏差 平均值 标准偏差 平均值 标准偏差
0  1 253.34  282.15  810.72  48.41  238.31  11.24  5 072.21  241.61  717.02  101.35
28  365.06  87.16  180.75  46.82  131.05  38.54  13.22  1.42  5.64  0.43
42  1.85  0.07  2.70  0.05  1.29  0.05  5.54  0.18  2.07  0.08
112 — — 1.22  0.14  0.51  0.07 — — — —
  注:n=3,“—”表示未检出.
2 结果与分析
2.1 秋茄凋落叶水提液对新月菱形藻的化感
效应
  采用测定藻液在680nm处的吸光值(OD680)来
反映藻细胞的密度,二者具有良好的相关性(y=
342.5x-7.131,R2=0.995).由图1(a)可知,未分解
凋落叶水提液100,200,400mg/L处理组新月菱形藻
OD680显著低于对照组(p<0.05),其抑制效应随着秋
茄凋落叶水提液质量浓度的升高而增强;50mg/L的
处理组藻密度与对照组差异不显著(p>0.05).200
mg/L处理下新月菱形藻在第2天生长加快,3d以后
OD680开始低于对照组,并于第3天开始提前进入衰亡
期.由图1(b)可知,各质量浓度的半分解秋茄凋落叶
水提液处理下的新月菱形藻的生长均低于对照组,但
无显著影响(p>0.05).
(a)未分解凋落叶;(b)半分解凋落叶.
图1 秋茄凋落叶水提液对新月菱形藻生长的影响
Fig.1 Effects of K.obovataleaf litter water extracts
on the growth of N.closterium
2.2 秋茄凋落叶中酚酸的组成
秋茄凋落叶中酚酸检测结果如表2所示,阿魏酸
未被检出.在4个不同分解期(0,25,50,100d)的凋落
叶中均可检测到香草酸和丁香酸.随着分解期的延
长,不同酚酸含量均有不同程度的下降,在分解42d
(即半分解期)后,各酚酸含量有显著下降,112d时对
羟基苯甲酸、绿原酸和咖啡酸已无法检出.这表明随
分解期的延长,酚酸含量降低.
在秋茄凋落叶中可以检测出对羟基苯甲酸、香草
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第6期 段罕慧等:秋茄凋落叶酚酸动态变化及其对新月菱形藻的化感效应
酸、丁香酸、绿原酸和咖啡酸.但不同分解期的凋落叶
可检出的酚酸种类和含量有所不同,表现出随分解期
延长种类减少、含量下降的趋势.因此本研究参照分
解初期凋落叶中的酚酸含量和比例配制相应浓度的
混合酚酸来研究酚酸物质对新月菱形藻的化感效应.
2.3 酚酸物质对新月菱形藻的抑制作用
图2展示了不同质量浓度的对羟基苯甲酸、丁香
酸、香草酸、绿原酸和咖啡酸化感物质对新月菱形藻
生长曲线的影响.统计结果分析表明,5种酚酸化感物
质均对新月菱形藻的生长产生化感效应.
图2 酚酸对新月菱形藻生长曲线的影响
Fig.2 Effects of phenolic acids on the growth curve of N.closterium
5种化感物质在质量浓度为0.2~25mg/L时,各
酚酸化感物质基本表现为对新月菱形藻产生抑制作
用.随着质量浓度的增加,抑制作用增强,在高质量浓
度(≥5mg/L)下除香草酸处理组外均提前进入衰亡
期.按分解初期凋落叶中酚酸比例配成的混合酸,低
质量浓度(稀释5~10倍)时抑制作用差异不显著,高
质量浓度下表现出显著的抑制效应,新月菱形藻的密
度较之对照组显著降低(p<0.05).与未分解凋落叶
作用相比,同样呈现出高浓度抑制,低浓度作用不显
著的趋势.
从相对生长率(图3)来看,0.2mg/L处理下,除
对羟基苯甲酸和丁香酸处理组在第2天使新月菱形
藻的相对生长率略有上升(分别上升了0.15和2.05
个百分点)外,其余各处理组均低于对照组,且在第3
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厦门大学学报(自然科学版) 2014年
图3 不同浓度的酚酸对新月菱形藻相对生长率的影响
Fig.3 Effects of different concentrations phenolic acids on relative growth rate of N.closterium
天差值达到最大;1mg/L处理下,各处理组的相对生
长率均低于对照组;5和25mg/L处理下,各处理组的
相对生长率与对照组的差值较之于低质量浓度处理
组明显增大,表明随质量浓度增加各酚酸对新月菱形
藻的抑制作用增强.混合酸各处理组在3~6d内相对
生长率较之对照组明显降低(p<0.05).随着稀释倍
数的增大新月菱形藻相对生长率的下降趋势随之降
低(图4).
3 讨 论
通过本研究发现,未分解的秋茄凋落叶水提液在
不同浓度下体现出了不同的化感作用,在低浓度时无
明显影响,较高浓度时出现短暂的促进作用.这与李
春强等[16]研究的不同红树植物对中肋骨条藻(Skele-
tonema costatum)的化感作用的结果相似,秋茄植物体
浸提液对微藻产生显著的抑制作用,且随浓度增加,
抑制作用增强.柴民伟等[17]研究发现,4种药用植物
浸提液对蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)的生
长具有化感抑制效应.孙志伟等[13]的研究也表明,秋
茄叶片提取物对2种赤潮藻均具有显著的化感抑制
图4 混合酸对新月菱形藻相对生长率的影响
Fig.4 Effects of mixed phenolic acids on relative
growth rate of N.closterium
作用,不同浓度提取物化感作用强度不同.并推测这
可能是由于秋茄凋落叶水提物中存在3类物质:1)是
促进藻类生长的物质,2)是抑制藻类生长的物质,3)
是对藻类生长没有明显作用的物质.最终表现出来的
效果是这3类物质共同作用的结果.本文在水提液低
浓度时各物质含量都较低,对新月菱形藻未表现出明
显的作用.200mg/L下开始是促进藻类生长的物质
占优势,随着这类物质的消耗减少,抑制作用越来越
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第6期 段罕慧等:秋茄凋落叶酚酸动态变化及其对新月菱形藻的化感效应
明显.
酚酸是植物残体腐解后产生的十分普遍的有机
分子,它们能够对植物体产生显著的化感作用[15].
Zhen等[19]在草莓根系腐解物水提液中检测到对羟基
苯甲酸、香草酸、丁香酸、苯甲酸和邻苯二甲酸5种酚
酸类物质,它们均抑制草莓组培苗的生长,其中以对
羟基苯甲酸的抑制作用最强.本文以目前报道较多的
6种酚酸类物质为标样,采用改进的高效液相色谱法,
在秋茄凋落叶中鉴定出对羟基苯甲酸、丁香酸、香草
酸、绿原酸、咖啡酸5种酚酸物质,室内实验结果表
明,这5种物质均显著抑制了新月菱形藻的生长,是
秋茄凋落叶中起重要作用的化感成分.随分解期的延
长,秋茄凋落叶水提液的抑藻作用显著减弱.秋茄凋
落叶显示出前期分解快,而后趋于平缓的变化趋
势[8].酚酸含量变化也有相同的趋势,这也可以在一
定程度上解释随分解期延长秋茄凋落叶水提液对新
月菱形藻的抑制作用有所减弱.
酚酸的抑藻机理可能与酚酸胁迫下自由基的产
生增加以及膜脂质过氧化有关.酚酸物质改变了膜的
透性,细胞受到氧化伤害,细胞分裂速度下降,酚酸物
质抑制藻生长,并且浓度越高,抑制作用越明显.张庭
廷等[20]的研究表明,对羟基苯甲酸和阿魏酸对水华鱼
腥藻(Anabaena aquae)和蛋白核小球藻均有明显的抑
制作用,其中对羟基苯甲酸的化感抑制作用较阿魏酸
显著,对水华鱼腥藻的抑制作用比对蛋白核小球藻显
著,本文结果与其有相似的趋势.根据秋茄凋落叶酚
酸比例配制成的混合酸对新月菱形藻的抑制作用比
秋茄凋落叶水提液弱,则可能是由于存在其他化感物
质同时在起作用.除酚酸类物质外,许多红树植物中
含有甾醇、萜类、生物碱、环硫醚等化学成分,有的还
有黄酮、醌类等化学成分[21],都可能对微藻产生化感
作用.
本文选择福建九龙江红树林区的优势底栖硅藻
新月菱形藻作为受试藻种,测试其在红树林生境中受
到凋落物酚酸物质的化感作用.采用野外实验与室内
实验相结合的研究方法,检测了秋茄凋落叶分解过程
中酚酸含量的变化,研究了不同分解期凋落叶以及不
同浓度酚酸对新月菱形藻生长的影响,为研究红树林
湿地系统功能机制提供了新思路.
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Dynamics of Phenolic Acids Extracted fromKandelia obovata(S.L.)Yong
Leaf Litters and Their Alelopathic Effects on Nitzschia closterium
DUAN Han-hui,ZHANG Qiong,LIU Jing-chun,LU Hao-liang,YAN Chong-ling*
(Key Laboratory of the Ministry of Education for Coastal and Wetland Ecosystems,
Colege of the Environment &Ecology,Xiamen University,Xiamen 361102,China)
Abstract:In order to explore the alelopathy of mangrove leaf litters,Nitzschia closterium was used to examine the alelopathy
effects of Kandelia obovata (S.L.)Yong leaf litters on algagrowth.The results showed that water extract of undecomposed K.
obovataleaf litters significantly inhibited the growth of N.closterium,the inhibition effects increased at higher concentrations of leaf
litters.Water extract of half-decomposed(t50=42d)K.obovataleaf litters had no significant effect on the growth of N.closterium.
Hydroxybenzoate,vaniloid,clove acid,chlorogenic acid and caffeic acid were determined by high performance liquid chromatography
in K.obovata leaf litters,and the concentration of these components decreased with the decomposition of leaf litters.Our data
showed that these phenolic substances had significant alelopathy effect on N.closterium.Therefore,mangrove plants controled the
growth of microalgae in the rhizosphere-sediment-water interface,and alelochemicals was an important reason.This study enriched
the theory and practical experience in preventing algal outbreaks safely and effectively,providing a new basis for revealing the rela-
tionship between mangroves and microalgae.
Key words:Kandelia obovata(S.L.)Yong;leaf litters;phenolic acid;Nitzschia closterium
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