全 文 ：第34卷 第5期 水 生 生 物 学 报 Vol. 34, No.5
2 0 1 0 年 9 月 ACTA HYDROBIOLOGICA SINICA Sep. , 2 0 1 0

收稿日期: 2009-12-12; 修订日期: 2010-06-23
基金项目: 中国科学院知识创新工程重要方向项目(KSCX2-YW-G-060); 中国科学院太阳能行动计划(KGCX2-YW-374-12)资助
作者简介: 李秀波(1982－), 女, 辽宁辽阳人; 硕士研究生; 研究方向为藻类生物技术。E-mail: lixiubo666@yahoo.com.cn
通讯作者: 孔任秋, E-mail: kongr@ihb.ac.cn

DOI: 10.3724/SP.J.1035.2010.00893
五种微绿球藻产油和产多不饱和脂肪酸的研究
李秀波 1,2 徐旭东 1 孔任秋 1
(1. 中国科学院水生生物研究所, 武汉 430072; 2. 中国科学院研究生院, 北京 100049)
摘要: 从 5种微绿球藻中鉴别出 4个高产油藻种和 1个产油量很低的藻种。4种高产油微绿球藻在平台期油
脂含量最高, 占细胞干重的 57%以上, 其中三酰基甘油的含量占细胞干重的 32.4%—45.2%。分析 5 种微绿
球藻细胞的脂肪酸组成及 4种高产油藻三酰基甘油中的脂肪酸组成, 发现在高产油藻中, 总的饱和脂肪酸和
单不饱和脂肪酸的比例达到 95%以上, 多不饱和脂肪酸在 5%以下, 而在产油量很低的微绿球藻中多不饱和
脂肪酸比例达 45%以上。高产油微绿球藻三酰基甘油的多不饱和脂肪酸含量在 4%以下, 是生物柴油的优质
原料, 而产油量低的微绿球藻可用于提取 C20:5脂肪酸(EPA)。
关键词: 微绿球藻; 三酰基甘油; 脂肪酸
中图分类号: Q949.2 文献标识码: A 文章编号: 1000-3207(2010)05-0893-05

能源危机是人类面临的共同问题之一。生物柴
油作为一种清洁的可再生能源, 有可能部分替代化
石柴油。目前, 生物柴油大多以植物来源的油脂作
为原料。但是, 油料植物生产有占地面积大、生长
周期长等缺点。相比之下, 产油微藻生长周期短, 单
位面积产量高, 利于工业化生产。自从 20个世纪 70
年代, 美国、澳大利亚和日本等国就已展开利用微
藻生产液体燃料的研究[1]。目前利用微藻生产生物
柴油的研究已得到全世界的广泛关注。不同微藻积
累油脂的能力各不相同, 产油微藻含油量(占细胞干
重)一般在 20%–50%, 某些微藻的含油量甚至可以
达到 77%[2−5]。许多产油微藻的油脂组成与油料植物
相似, 脂肪酸组成以 C16 和 C18 为主[6], 大多数为
饱和或单不饱和脂肪酸, 也有一些微藻有较高的多
不饱和脂肪酸[2]。以微藻生产的生物柴油价格远远
高于化石燃料和以油料作物油脂为原料生产的生物
柴油[7], 离实际应用还有一定距离。为了降低成本要
对各生产环节进行技术的改进和突破, 优良藻种的
筛选和产油条件的分析仍然是研究的重点之一。微
绿球藻(Nannochloropsis)通常作为水产业优良的饵
料以及色素和 EPA的来源, 但研究发现, 其 EPA一
般在膜脂中, 而细胞内储存物三酰基甘油中的脂肪
酸大多为饱和脂肪酸 [8], 这正是生产生物柴油所需
的比例, 因此利用其产油也具一定优势。本研究筛
选了 4 种微绿球藻产油株, 对不同生长时期的产油
情况进行了分析, 测定了平台期总油脂含量及中性
脂三酰基甘油的含量, 比较了藻细胞及三酰基甘油
中的脂肪酸组成, 以期为进一步生产高质量的生物
柴油提供依据。另一方面, 研究微绿球藻产油与产
不饱和脂肪酸的关系, 对于生产 EPA藻种的选育和
工艺改进也具有指导意义。
1 材料与方法
1.1 藻 种
颗粒微绿球藻(Nannochloropsis granulata)、盐
生微绿球藻(Nannochloropsis salina)、海洋微绿球藻
(Nannochloropsis oceanica)、湖沼微绿球藻(Nanno-
chloropsis limnetica)和微绿球藻未定种(Nannochlo-
ropsis sp.)均由本所胡晗华副研究员提供。
1.2 藻种培养条件
除湖沼微绿球藻用 BG11[9]培养基外, 其余 4种
用海水培养基, 添加 f/2 营养盐[10]。在 25℃、持续光
894 水 生 生 物 学 报 34卷
照、光强为 100 μE/m2·s、pH 7.0–7.5条件下通气培养。
1.3 总脂提取
总油脂按氯仿/甲醇萃取的方法 [11,12] 提取。以
6000 r/min 离心收集藻细胞, 用灭菌 ddH2O 洗涤三
次, 收集并冷冻干燥, 称取 100 mg冷冻干燥的藻提
取总脂。藻细胞加入一定体积的氯仿︰甲醇 (1︰1) ,
在旋涡振荡器上以最大速度振荡 1—2min; 再加入
3/10 体积的 1 mol/L 氯化钾的 0.2 mol/L 磷酸溶液,
稍振荡, 使相位分离; 12000 r/min 离心 5min, 吸取
下层氯仿相至新的 EP 管中, 置通风厨中吹干溶剂,
以分析天平称重, 计算总脂含量。
1.4 薄层层析和三酰基甘油的分离
薄层层析参照文献[12]进行, 所用薄层层析板
的型号是 Silica gel 60 F254 (Merk KgaA Darmstadt,
Germany), 展层剂体系为正己烷︰乙醚︰乙酸(90︰
10︰1)。展层完毕从展层缸中取出层析板, 待层析板
上的展层剂挥发干向上喷 50%硫酸并立即置 160℃
烘箱中烘烤 5min显色。分离三酰基甘油时, 取总脂
15 mg, 与三油酸甘油标样一起进行薄层层析。然后,
将三油酸甘油对应的位置在板上用小刀切割并将硅
胶粉刮下, 放入 Ep 管中, 用 10—20 mL 甲醇洗脱,
N2 气吹干, 即得到较纯的三酰基甘油。以分析天平
称重, 计算三酰基甘油含量。
1.5 脂肪酸测定
分别将藻细胞总脂和三酰基甘油进行甲脂化 ,
将脂化液用正己烷萃取三次定容至100 μL, 取1 μL进
行气相色谱分析。气相色谱分析条件为在柱温 50℃
保持 1min后, 以 40℃/min的升温速度升至 170℃, 保
持 1min, 再以 18℃/min 的速度升至 210℃, 保持
28min; 进样口温度为 270℃, 分流比为 50︰1; 以 N2
为载气, 恒流方式, 流量为 2 mL/min; 检测器温度为
280℃, 空气流量为 350 mL/min, 氢气为 35 mL/min。
2 结 果
2.1 总脂和三酰基甘油含量分析
将 5 种微绿球藻培养至平台期, 以相同生物量
提取油脂, 进行薄层层析比较三酰基甘油含量。结
果显示, 湖沼微绿球藻的三酰基甘油含量很少, 而
其余 4种均能产生较多的三酰基甘油(图 1)。
分别培养 4 种含油量较高的藻种, 在第 4 天、
第 7天、第 11天、第 14天和第 17天收集藻细胞提
取油脂, 以薄层层析法分析比较(图 2)。各时期油脂



图 1 以薄层层析法比较 5种微绿球藻油含量
Fig. 1 Comparison of oil contents in 5 Nannochloropsis species
by thin layer chromatography (TLC)
1. 颗粒微绿球藻; 2. 盐生微绿球藻; 3. 湖沼微绿球藻; 4. 三油
酸甘油酯标样(0.02 mg); 5. 微绿球藻未定种; 6. 海洋微绿球藻
1. N. granulata; 2. N. salina; 3. N. limnetica; 4. triolein (0.02 mg);
5. Nannochloropsis sp.; 6. N. oceanica



A B C D

图 2 以薄层层析法显示 4种微绿球藻不同生长时期含油量
Fig. 2 Display of oil contents in 4 Nannochloropsis species at different growth stages by thin layer chromatography
A. 颗粒微绿球藻; B. 盐生微绿球藻; C. 微绿球藻未定种; D. 海洋微绿球藻; 1. 培养第 4天; 2. 培养第 7天; 3. 三油酸甘油酯标样
(0.02 mg); 4. 培养第 11天; 5. 培养第 14天; 6. 培养第 17天
A. N. granulata; B. N. salina; C. Nannochloropsis sp.; D. N. oceanica; 1. the 4th day of cultivation; 2. the 7th day of cultivation; 3. triolein
(0.02 mg); 4. the 11th day of cultivation; 5. the 14th day of cultivation; 6. the 17th day of cultivation
5期 李秀波等: 五种微绿球藻产油和产多不饱和脂肪酸的研究 895
上样量都是以相同细胞量(1.8×108 cells)提取的。4
种微绿球藻在对数生长前期(第 4 天)就能检测到三
酰基甘油的积累, 但含量比较少, 之后随着培养时
间的延长逐渐增加。其中, 颗粒微绿球藻、盐生微
绿球藻和微绿球藻未定种在进入平台期(14—17d)
含油量达到最大, 并保持相对稳定, 而海洋微绿球
藻在平台期随着培养时间的延长, 三酰基甘油含量
还有明显提高。
将 4 种含油量较高的藻培养至平台期, 提取总
脂, 分离纯化三酰基甘油, 计算总油脂含量和三酰
基甘油含量(图 3)。4种微绿球藻总脂含量都达到了
57%以上, 其中颗粒微绿球藻、盐生微绿球藻和海洋
微绿球藻的总脂含量分别为 (57.5±7.3)%、 (60.0±
6.5)%和 (58.5±2.2)%, 微绿球藻未定种的总脂含量
最高, 为细胞干重的(74.9±6.5)%。4 种微绿球藻三酰
基甘油含量稍有差异, 颗粒微绿球藻、盐生微绿球
藻和海洋微绿球藻的三酰基甘油含量基本相当, 分
别为(33.1±6.1)%、(32.4±4.4)%和(36.4±1.5)%, 微绿
球藻未定种最高, 可达细胞干重的(45.2±9.1)%。颗
粒微绿球藻、盐生微绿球藻、微绿球藻未定种和海
洋微绿球藻三酰基甘油含量分别占总脂的 (57.7±
8.3)%、(54.0±3.6)%、(60.1±7.1)%和(62.3±4.2)%。
2.2 脂肪酸组成的分析
以培养至平台期的 5 种微绿球藻, 分析了细胞
中的脂肪酸组成及相对含量。表 1显示, 4种高产油
微绿球藻的脂肪酸组成相似, 饱和脂肪酸和单不饱
和脂肪酸总量都在 95%以上, 其中 C16:0、C16:1和


图 3 四种微绿球藻总脂及三酰基甘油含量
Fig. 3 Contents of total lipids and triacylglycerol in 4 Nan-
nochloropsis species
灰色柱代表总脂，斜纹柱代表三酰基甘油
Grey bars, total lipids; stripped bars, triacyglycerol

C18:1 可达到总脂肪酸的 90%以上 , C16 脂肪酸
(C16:0 和 C 16:1) 达总脂肪酸的 66%—82%。各藻
种都只检测到含量在 1%以下的亚麻酸(C18:3)。C20
脂肪酸含量在 2%—3.6%, 大多以多不饱和形式存
在(4个或 5个不饱和键)。含油量低的湖沼微绿球藻
脂肪酸组成则与其他藻有较大区别, 其 C16 和 C18
的饱和和单不饱和脂肪酸仅占 51.04%, 而 C20脂肪
酸共占 45.05%, C20 多不饱和脂肪酸高达 44.75%,
EPA (C20:5)含量为 38.36%。
进一步分析 4 种高产油藻的三酰基甘油中脂肪
酸的组成及相对含量, 发现与藻细胞总的脂肪酸组
成相似, 总的饱和与单不饱和脂肪酸含量达到 95%
以上, 但多不饱和脂肪酸含量与全细胞相比更低。
表 2 显示, 三酰基甘油中脂肪酸组成也以 C16 和

表 1 五种微绿球藻中脂肪酸含量(摩尔百分比)
Tab. 1 Fatty acid composition(mol%)of 5 Nannochloropsis species
脂肪酸 Fatty acids N. limnetica N. granulata N. salina Nannochloropsis sp. N. oceanica
C14: 0 0.23±0.33 6.47±0.86 1.87±0.08 3.79±0.94 2.73±0.09
C14: 1 0.12±0.01 0.09±0.01 0.03±0.01 0.03±0.00 0.02±0.00
C 16: 0 17.19±1.64 32.13±2.65 38.85±2.04 41.60±2.56 44.20±0.24
C16:1 (7) 32.80±3.03 34.44±0.20 39.93±1.20 34.20±1.87 37.56±0.36
C 18: 0 0.54±0.06 1.40±0.01 2.17±0.38 2.04±0.43 1.53±0.06
C18:1 (9) 0.51±0.09 21.26±1.40 11.30±1.08 13.57±2.50 9.04±0.13
C18:2 (9, 12) 2.94±0.28 1.58±0.11 1.42±0.08 1.10±0.28 0.68±0.03
γ-C18:3(6, 9, 12) 0.31±0.27 ND 0.79±0.05 0.28±0.12 0.43±0.02
α-C18:3(9,12,15) ND 0.24±0.33 ND 0.11±0.15 0.05±0.04
C18: 4 0.32±0.28 ND ND ND 0.06±0.02
C20: 0 0.30±0.09 ND 0.22±0.03 ND 0.10±0.02
C20: 4 6.39±0.87 0.41±0.58 1.60±0.19 0.74±0.25 1.46±0.05
C20: 5 38.36±3.55 1.98±1.28 1.82±0.41 2.53±0.82 2.15±0.15
Note: ND. not detected; the same bellow
896 水 生 生 物 学 报 34卷
表 2 四种微绿球藻三酰基甘油中脂肪酸含量(摩尔百分比)
Tab. 2 Fatty acid composition (mol%) of triacylglycerol in 4 Nannochloropsis species
脂肪酸 Fatty acids N. granulata N. salina Nannochloropsis sp. N. oceanica
C14: 0 6.20±0.40 3.99±0.53 6.72±0.16 5.39±0.16
C14: 1 0.05±0.00 0.05±0.00 0.22±0.28 0.19±0.28
C 16: 0 35.20±0.36 36.14±0.55 37.44±0.25 38.03±0.13
C 16: 1(7) 37.99±0.20 46.63±1.52 38.97±0.78 39.14±0.03
C 18: 0 0.97±0.06 1.07±0.09 1.17±0.19 0.88±0.03
C 18: 1(9) 17.69±0.47 8.76±0.77 13.28±0.80 13.75±0.42
C 18: 2(9, 12) 0.93±0.08 0.68±0.00 0.47±0.41 0.35±0.01
γ-C18:3(6, 9,12) 0.11±0.15 0.67±0.00 ND ND
C20: 4 0.39±0.56 0.49±0.70 ND 0.22±0.38
C20: 5 0.47±0.58 1.52±0.06 1.73±0.51 2.05±0.24

C18为主, 达到总脂肪酸含量的 90%以上, 其中C16
脂肪酸(C16:0和 C16:1)可达总脂肪酸含量的 73%—
83%。这 4 种微藻的三酰基甘油都未检测到 α-亚麻
酸(α-C18:3), 颗粒微绿球藻、盐生微绿球藻中有不
到 1%的 γ-亚麻酸。颗粒微绿球藻的三酰基甘油多不
饱和脂肪酸含量最低, 不到 2%。
3 讨 论
本文从 5 种微绿球藻中筛选出了 4 种高产油藻
种, 发现各藻种在对数生长期前期就检测到三酰基
甘油的积累, 随着细胞浓度的增加, 三酰基甘油逐
渐增加, 在平台期达到最高。这与其他文献的报道
是一致的 [13,14]。推测藻细胞生长在进入平台期后 ,
培养液中氨基酸合成所必须的氮及其他营养减少了,
导致细胞内蛋白质的合成量降低, 光合作用同化的
碳进入到碳水化合物和脂肪中, 出现能量积累的趋
势。在 4 种微绿球藻中, 油脂在平台期均达到细胞
干重的 57%以上, 其中 1 个微绿球藻未定种油脂含
量高达 74.9%。在平台期细胞的油脂中, 三酰基甘油
占大部分, 占总脂的 54.0%—62.3%, 占细胞干重的
32.4%—45.2%。本研究所用盐生微绿球藻含油脂达
60.0%, 比 Boussiba, et al.所报道[14]的高得多, 可能
是因为所用藻种属于两个不同的株以及不同的培养
条件所致。因此, 对 4 种产油藻的后续研究应进一
步优化培养条件, 比如通最适比例的 CO2以及进行
氮营养胁迫, 以期得到更理想的单位产油量。
生物柴油生产主要是用天然油脂中的三酰基甘
油和甲醇在酸或者碱性催化剂和高温下进行转酯化
反应, 生成相应的脂肪酸甲酯。三酰基甘油的脂肪
酸组成决定了生物柴油的质量。在本研究中, 4种产
油微绿球藻全细胞脂肪酸组成和三酰基甘油中脂肪
酸组成相似, 均以 C16 和 C18 为主, 但在三酰基甘
油中多不饱和脂肪酸含量更低。譬如, 颗粒微绿球
藻三酰基甘油中的多不饱和脂肪酸不到 2%, 而在
全细胞脂肪酸中超过 4%。可见, 三酰基甘油中含有
较少的多不饱和脂肪酸。我们也检查了 1 种产油量
很低的湖沼微绿球藻的脂肪酸组成, 发现其多不饱
和脂肪酸含量很高 , 比例达到 45%以上 , 特别是
EPA含量达 38.36%。这些结果说明, 多不饱和脂肪
酸(C20:5,C20:4)在膜脂中所占比例较高, 在三酰基
甘油中所占比例较低。这与前人的研究结果也是一
致的[8]。适量的不饱和脂肪酸会增加生物柴油低温
下的流动性, 但过量的多不饱和脂肪酸又会影响生
物柴油的稳定性, 不利于运输和储存。某些微藻、
大豆和菜籽的油中含较高比例多不饱和脂肪酸。相
比之下, 4种高产油的微绿球藻, 尤其是颗粒微绿球
藻的脂肪酸组成更接近或符合欧盟有关汽车用生物
柴油脂肪酸组成的标准[7]。因此, 本研究中 4种微绿
球藻所积累的三酰基甘油, 可以作为生物柴油的优
质原料, 而产油量很少的湖沼微绿球藻则可能成为
生产 EPA的优良藻种。
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STUDIES ON THE PRODUCTION OF OIL AND POLYUNSATURATED FATTY ACIDS
IN FIVE SPECIES OF NANNOCHLOROPSIS
LI Xiu-Bo1,2, XU Xu-Dong1 and KONG Ren-Qiu1
(1. Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072; 2. The Graduate University of Chinese Academy
of Sciences, Beijing 100049)
Abstract: Nannochloropsis species are known for high contents of oil or polyunsaturated fatty acids (PUFA), such as
EPA (C20:5). In Nannochloropsis species, oils contain essentially saturated and mono-unsaturated fatty acids, while
polar lipids are rich in PUFA. In this study, total lipids, oils and fatty acids were analyzed in 5 Nannochloropsis species.
Total lipids were extracted from cells using chloroform/methanol, and from total lipids, triacylglycerols were purified
using thin layer chromatography. Of the five species, four were found to be of high-oil contents and one of very low-oil
content. In the high-oil species, lipids could be accumulated to more than 57% of cell dry weight at late stationary
growth phase, of which triacylglycerols accounted for 32.4%–45.2% of cell dry weight. The fatty acid composition of
whole cells of all five species or triacylglycerol of four high-oil content species was analyzed. In high-oil content spe-
cies, saturated and mono-unsaturated fatty acids accounted for more than 95% of total fatty acids, while the polyun-
saturated fatty acids were less than 5%. In contrast, in the species of low-oil content, polyunsaturated fatty acids ac-
counted for more than 45% of total fatty acids. Triacylglycerols of the four high-oil content species possessed less than
4% PUFA and may serve as excellent raw materials for biodiesel production. On the other hand, EPA may be easily
produced from total lipids of the low-oil content Nannochloropsis.

Key words: Nannochloropsis; Triacylglycerols; Fatty acids