全 文 ：收稿日期:2012 － 12 － 09。
作者简介:饶礽 (1989—) ，男，江西抚州人，在读硕士研究生，研究
方向为生物制药。
柏叶蕨藻中硫酸多糖抗凝血和抗氧化作用研究
饶 礽
(青岛科技大学化工学院，山东青岛 266042)
摘要:以柏叶蕨藻为原料，用有机溶剂分级沉淀法得到 4 种硫酸多糖馏分，用色谱法进行了纯化，
并对这些物质进行组分分析及抗凝血和抗氧化作用研究。结果发现，加入 0． 5 L 和 0． 3 L 丙酮所获得
的多糖馏分所具有的抗氧化及抗凝血活性有很大的药用价值。
关键词:硫酸多糖 抗凝血作用 抗氧化作用 生物活性 柏叶厥藻
中图分类号:R284，R285 文献标识码:A 文章编号:1006 － 7906(2013)02 － 0065 － 04
Study on anticoagulation and antioxidation of sulfated polysaccharides
in cedar caulerpa
RAO Reng
(College of Chemical Engineering，Qingdao University of Science and Technology，
Qingdao 266042，China)
Abstract:Choosing cedar caulerpa as raw materials，four kinds of sulfated polysaccharide fractions are obtained using organic sol-
vent classification precipitation，and these products are purified by chromatographic method． The components of these substances are
analyzed;the anticoagulation and antioxidation are researched． The results show that adding 0． 5 L and 0． 3 L acetone，the antioxidant
and anticoagulant activity of obtained polysaccharide fractions have great medicinal value．
Key words:Sulfated polysaccharides;Anticoagulation;Antioxidation;Bioactivities;Cedar caulerpa
海藻是广泛用于医药学、生物技术、美容和食品
工业的各种化合物的一个丰富来源，而提自海藻中
的硫酸多糖由于其广泛的生物和药理活性在其中占
据了一个特殊的位置。富含硫酸多糖的柏叶蕨藻提
取物呈多种生物活性，包括抗凝活性和抗氧化活性。
然而，纯化的柏叶蕨藻硫酸多糖的生物活性尚未确
定，本研究的主要目的在于获取柏叶蕨藻硫酸多糖，
并评估其离体抗氧化及抗凝血活性。
1 实验方法
1． 1 硫酸多糖的提取
按 Rocha等所述的方法进行硫酸多糖馏分的提
取［1］。先将刚采集的柏叶蕨藻于 50 ℃通风条件下
进行干燥，并于搅拌机中磨碎;再将经过丙酮处理除
去脂类和色素的 100g干燥粉末状海藻置于 500 mL
0． 25 mol /L的 NaCl 溶液中混悬，用 NaOH 将 pH 值
调至 8． 0。然后，向混合物中加入 20 mg 枯草杆菌
蛋白酶进行酶解;随后在 60 ℃下搅拌温育 18 h，并
用纱布过滤混合物;接着，用丙酮溶液析出分离滤液
并离心分离(10 000 r /min，20 min) ，收集所形成的
析出物，真空干燥，重新混悬于蒸馏水中并进行分
析;最后，向上清液分别加入 0． 3，0． 5，1． 0，2． 0 L 丙
酮，可获得 4 种富含多糖的馏分，并根据所用丙酮的
体积分别命名为:F0． 3，F0． 5，F1． 0，F2． 0。
1． 2 硫酸多糖的纯化
通过 Sephadex G － 100(140 cm × 2． 6 cm)分子
筛色谱分别对上述 4 种馏分进一步提纯。首先各取
约 200 mg馏分溶解于 2 mL 水中，然后涂到柱色谱
上，并用 0． 2 mol /L乙酸和 0． 15 mol /L NaCl的混合
溶液洗脱;最后将含有硫酸多糖的馏分透析并冻干。
1． 3 化学组分、单糖组成分析及分子量测定
分析馏分组成:首先以 D －半乳糖为标准用苯
酚 /H2SO4 反应法测定总糖含量;然后用酸水解多糖
(4 mol /L HCl，100 ℃，6 h) ，按明胶 －钡法测定硫酸
盐含量;最后用 Spector法测定蛋白质含量。
单糖组成分析:首先确定 HCl 水解硫酸半乳聚
第 34 卷第 2 期
2013 年 4 月
化学工业与工程技术
Journal of Chemical Industry ＆ Engineering
Vol. 34 No． 2
Apr．，2013
化学工业与工程技术 2013 年第 34 卷第 2 期
糖的最佳条件，分别用 0． 5，1，2，4 mol /L HCl在 100
℃下分别对柏叶蕨藻多糖水解 0． 5，1 ，2 ，4 h，随后
将水解液 pH 值调至 7． 5，透析冻干得到粉末，再将
其混悬于水中，用索 －尼氏法测定还原糖含量。经
正交法对比得出最佳水解条件为 2 mol /L HCl 水解
2 h。将上述条件下水解的产物以 D －半乳糖为参
照标准，用示差折光检测器(RI 检测器，型号 L －
2490)经高效液相色谱系统 VWR － Hitachi Lachrom
Elite测定其单糖组成。
测定硫酸半乳聚糖的分子量:以不同分子量的
葡聚糖为标准，用 0． 5 mol /L乙酸 /0． 15 mol /L NaCl
作洗脱液，在 Sephadex G － 100(140 cm ×1 cm)上对
其进行凝胶渗透色谱分析，从而估算出其大致的分
子量。
1． 4 抗氧化作用研究
1． 4． 1 抗氧化活性测定
将 4 种硫酸多糖馏分各 1 g 分别加入 4 组盛有
混合试剂(0． 6 mol /L 硫酸、28 mmol /L 磷酸钠及 4
mmol /L钼酸铵)溶液的试管中，于 95 ℃下温育 90
min，待混合物冷却至室温后，在紫外波长 695 nm下
对各种溶液的吸光度进行测定得 A1;对照组中将硫
酸半乳聚糖馏分替换成 1 mg 抗坏血酸得 A2。
多糖的抗坏血酸当量 =
A1
1 000A2
(当量的意义为
1 g多糖相当于
A1
1 000 A2
g抗坏血酸的抗氧化能力)
(1)
1． 4． 2 自由基清除活性测定
用芬顿反应(Fe2 + + 12 H2O →2 Fe
3 + + OH －)
研究柏叶蕨藻硫酸多糖清除羟基自由基的活性大
小，结果以抑制率表示。实验中准备 4 组 3 mL混合
溶液(10 mmol /L FeSO4·7H2O，10 mmol /L EDTA，2
mmol /L水杨酸钠，30% H2O2，混合生成羟基自由
基) ，并分别向 4 组溶液中加入梯度浓度的 4 种硫酸
多糖馏分(F0． 3，F0． 5，F1． 0，F2． 0) ;在对照组中，用
磷酸钠缓冲液代替硫酸多糖。两组均于 37 ℃下温
育 1 h，并在室温环境下通过紫外分光光度计检测紫
外波长 510 nm下的吸光度，以检测羟基自由基的生
成量［2］。
1． 4． 3 金属离子螯合活性的测定
实验中向 4 组含有 FeCl2(0． 05 mL，2 mmol /L)
和菲咯嗪(0． 2 mL，5 mmol /L)的溶液中分别加入梯
度浓度的 4 种硫酸多糖馏分，并充分摇匀;对照组不
加硫酸多糖馏分。两组均在室温下温育 10 min，于
室温环境下通过紫外分光光度计检测 562 nm 紫外
波长的吸光度，以检测羟基自由基的生成量。
1． 5 抗凝血活性测定
按 Albuquerque 等的方法用血凝仪进行活化部
分凝血活酶时间(aPPT)和凝血酶原时间(PT)凝血测
试［3］，并用柠檬酸处理过的正常人体血浆进行测定。
2 结果与讨论
2． 1 硫酸多糖的化学组成、单糖各组分含量及分子
量大小
海藻柏叶蕨藻硫酸多糖的化学组成及平均分子
量(简称分子量)见表 1。表中，Gal:半乳糖，Glc:葡
萄糖，Man:甘露糖，Xyl:木糖，Rha:鼠李糖，Fuc:岩
藻糖，－ :未检测，tr:痕量。
表 1 海藻柏叶蕨藻硫酸多糖的化学组成及平均分子量
多糖
得率，
% ①
总糖量，
% ②
总硫酸盐，
% ②
w(硫酸盐) ，
% ②
分子量
/kDa，③
多糖组分物质的量比④
Gal Glc Man Xyl Rha Fuc
F0． 3 13． 43 54． 91 34． 63 0． 63 ± 0． 02 155 ± 10 1． 0 0． 1 0． 2 0． 1 － －
F0． 5 46． 91 52． 38 38． 05 0． 73 ± 0． 04 130 ± 10 1． 0 － 0． 1 tr － －
F1． 0 39． 23 76． 47 17． 95 0． 23 ± 0． 01 155 ± 10 1． 0 tr 0． 1 0． 6 tr －
F2． 0 0． 43 59． 60 31． 64 0． 53 ± 0． 02 170 ± 10 1． 0 0． 6 1． 8 1． 0 0． 5 1． 0
表 1 说明如下:①所有多糖均由 Sephadex G －
100 分子筛色谱得到，干燥并称量所得的多糖，多
糖总量相当于 100%;②多糖的总糖量和总硫酸盐
分别由苯酚 /H2SO4 反应和 BaCl2 /凝胶反应测定，
w (硫酸盐)表示硫酸盐在总糖中的质量分数;③
分子量 (kDa)由 Sephadex G － 100 凝胶渗透色谱
估算 (取 3 次测量值) ;④多糖组分物质的量比由
HPLC估算。
·66·
饶 礽 柏叶蕨藻中硫酸多糖抗凝血和抗氧化作用研究
由表 1 可见，得率范围在 0． 43% (F2． 0)至
46. 91%(F0． 5)之间，硫酸盐 /糖的比例最高的是
F0． 5，最低的是 F1． 0。此外，尽管在提取多糖的过
程中使用了蛋白酶，但在所有的硫酸多糖中均未观
察到蛋白质污染物。
单糖组成的数据表明，柏叶蕨藻多糖为非均质
结构多糖。对除 F2． 0 之外的另 3 种多糖而言，半乳
糖为主要的糖单位，其他单糖在各种聚合物中的含
量各不相同。F2． 0 由 6 种多糖组成，呈现出更高的
单糖含量非均质性。然而，建立单糖组成结构与藻
类间系统关系的证据依然不足。
2． 2 抗氧化活性
在总抗氧化活性试验中，所有硫酸多糖均能够
将六价钼还原成硫酸盐 /五价钼复合物。然而，硫酸
盐 /糖比例较高的硫酸多糖(见表 1F0． 3 和 F0． 5)比
F1． 0 更有效力。在之前的一项研究中，Chandini 等
发现四叠团扇藻和小叶喇叭藻提取物分别有 9． 79
和 9． 65 抗坏血酸当量，而 F0． 5 则具有更高(约为
20)的抗坏血酸当量的抗氧化能力［4］。
实验还发现，只有硫酸多糖质量浓度达到 2． 0
mg /mL时，自由基清除速率才较为显著，且 4 种硫
酸多糖活性差异很小。Wang等已经证实，藻类硫酸
多糖还可通过改变聚合物硫酸化程度来提高抗氧化
活性［5］。
螯合活性实验中发现，4 种硫酸多糖的活性与
其质量浓度有关。当硫酸多糖质量浓度在 2． 0 mg /
mL 以下时，螯合能力与浓度成正比。螯合活性最
强的化合物是 F1． 0，当其质量浓度为 2． 0 mg /mL时
可与 44%的亚铁螯合。这些都表明柏叶蕨藻硫酸
多糖的亚铁螯合活性与硫酸基团的空间形态有关，
而且不可能是一种纯粹的电荷密度效应。
2． 3 抗凝血活性
柏叶蕨藻分离所得的硫酸多糖 aPPT 试验的抗
凝血活性见表 2(表 2 中 aPPT表示活化部分凝血活
酶时间，对于不含化合物的对照样品为(30 ± 3． 3)
s;克赛○R表示低分子量肝素)。
柏叶蕨藻分离所得的硫酸多糖 PT 试验的抗凝
血活性数据见表 3(表 3 中 PT 表示凝血酶原时间，
对于不含化合物的对照样品为(13． 2 ± 0． 2)s;肝素
指普通肝素)。
表 2 硫酸多糖 aPPT试验抗凝血活性实验结果
多 糖
aPPT /s
质量浓度 /(μg·mL －1)
1． 5 3． 0 8． 0 16． 5
克赛○R 47． 8 ± 2． 6AX 65． 2 ± 1． 7BX 168． 0 ± 7． 3CX ＞ 240DX
F0． 3 66． 7 ± 0． 6AX 58． 2 ± 1． 1BY 160． 9 ± 1． 9CX 163． 1 ± 0． 1DX
F0． 5 56． 8 ± 3． 3AX 72． 3 ± 0． 9BX 206． 7 ± 6． 1CY ＞ 240DX
F1． 0 31． 1 ± 0． 2AY 31． 0 ± 0． 6AY 42． 6 ± 0． 2BY 79． 5 ± 2． 1CY
表 3 柏叶蕨藻分离所得的硫酸多糖 PT试验的抗凝血活性数据
多 糖
PT /s
质量浓度 /(μg·mL －1)
16． 5 33． 0 66． 5 100． 0 133． 0
肝素 ＞ 120 ＞ 120 ＞ 120 ＞ 120 ＞ 120
F0． 3 13． 8 ± 0． 7A 15． 9 ± 0． 5A 21． 5 ± 2． 1B 27． 5 ± 1． 7C 29． 9 ± 1． 9C
F0． 5 14． 8 ± 0． 0A 18． 6 ± 1． 0B 31． 7 ± 0． 9C 45． 5 ± 0． 5D 59． 2 ± 1． 5B
F1． 0 12． 6 ± 0． 2A 13． 0 ± 0． 0A 13． 6 ± 0． 3A 13． 7 ± 0． 1A 14． 0 ± 0． 0A
表 2 中数据为 3 次测定值的平均值 ±标准方
差。字母 A ～ D表示硫酸多糖在各浓度之间比较时
有显著性差异(显著性水平 p ＜ 0． 001) ;字母 X，Y
表示在与相同浓度的克赛 相比时硫酸多糖之间有
显著性差异(p ＜ 0． 001)。
表 3 中数据为 3 次测定值的平均值 ±标准方
差。字母 A ～ D表示硫酸多糖在各浓度之间比较时
有显著性差异(p ＜ 0． 001)。
·76·
化学工业与工程技术 2013 年第 34 卷第 2 期
由表 2 可见，在 aPPT 试验中，所有多糖均表现
出相当的量效关系。随着质量浓度的提高，其抗凝
血活性也呈现增强趋势。抗凝血活性强度由大到小
依次是 F0． 5，F0． 3，F0． 1。另值得注意的是，在相同
浓度下(1． 5 ～ 16． 5 μg /mL)多糖 F0． 3 和 F0． 5 的
aPPT活性与克赛 相仿。由表 3 可见，在 PT 试验
中，只有 F0． 3 和 F0． 5 呈现出抗凝血活性。这些数
据表明，柏叶蕨藻提取物的抗凝血活性主要源于其
中存在的 F0． 3 和 F0． 5。
另外还发现，抗凝血活性(aPPT 和 PT)与柏叶
蕨藻硫酸多糖的硫酸盐 /糖比例呈正相关关系，这表
明柏叶蕨藻硫酸多糖抑制凝血的作用与硫酸化程度
相关［6］。
除了硫酸基团含量外，它们的位置也影响到抗
凝血活性［7］。与 F1． 0 相比，效力更强的多糖(F0． 5
和 F0． 3)都含有半乳糖 － 6 －硫酸酯键。这表明硫
酸化残基在多糖抗凝血活性中起着关键性的作用。
Chaidedgumjorn等指出，在 C6 位特异性去硫酸化的
多糖会失去其抗凝血活性，而 C4 位去硫酸化却不
影响多糖的抗凝血活性也证实了这一点［8］。
3 结 语
实验获得了 4 种主要由半乳糖组成的高分子柏
叶蕨藻硫酸杂多糖(F2． 0 除外)。硫酸多糖 F0． 3、
F0． 5 和 F1． 0 都表现出一定的抗氧化活性和显著的
亚铁螯合能力。此外，F0． 3 和 F0． 5 在 PT 和 aPPT
试验中也呈现出高效的抗凝血活性，而且该活性与
其硫酸盐 /糖比例成正比。由于 F0． 3 和 F0． 5 具有
较强的抗氧化和抗凝血活性，所以它们具有潜在药
物应用价值。引入核磁共振光谱法和质谱甲基化分
析对 F0． 3 和 F0． 5 作进一步研究，对于包括糖苷键
的构型、糖苷键的位置及 O －硫酸化方式在内的结
构分析将有很大帮助。同时，这也必将为硫酸多糖
生物作用机制的更深层次研究，以及根据其三维结
构开发相关抗凝血和抗氧化药物奠定良好基础。
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櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄
925 － 933．
简 讯
低水 /气耐硫变换工艺在大型煤制油装置的推广使用
近日讯，由青岛联信催化材料有限公司和山东三维石化工程有限公司共同完成的 400 万 t /a 煤制油项目耐硫变换工艺
包已交付神华宁煤集团煤制油项目组，同时山西潞安集团 100 万 t /a煤制油耐硫变换工艺包也通过技术评审。这标志着低
水 /气耐硫变换工艺及其升级技术将在大型煤制油装置推广并助推煤制油项目的能耗进一步降低。
据了解，这项低水 /气耐硫变换工艺升级技术为废锅 +两段低水 /气耐硫变换工艺和分层装填的变换炉专利技术。
据推算，采用耐硫变换新工艺可使神华宁煤 400 万 t /a煤炭间接液化项目节省蒸汽消耗约 600 t /h，仅此一项年创经济
效益达 7 亿元。山西潞安煤制油项目采用壳牌粉煤气化配套低水 /气耐硫变化工艺后，估计至少可节省蒸汽消耗 370 t /h，
年创经济效益 4． 4 亿元。
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