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第 38 卷第 3 期
2014 年 3 月
水 产 学 报
JOUＲNAL OF FISHEＲIES OF CHINA
Vol． 38，No． 3
Mar．，2014
文章编号:1000 － 0615(2014)03 － 0340 － 10 DOI:10． 3724 /SP． J． 1231． 2014． 48952
收稿日期:2013-10-24 修回日期:2013-12-10
资助项目:国家“八六三”高技术研究发展计划(2012AA10A411) ;国家自然科学基金项目(41176151，41276177) ;海洋公益性行业科
研专项(201105008，201105023) ;福建省科技重大专项资助项目(2011NZ0001)
通信作者:谢潮添，E-mail:ctxie@ jmu． edu． cn
坛紫菜两种 Hsp90 基因的克隆及表达特征分析
代真真， 李 兵， 徐 燕， 纪德华， 陈昌生， 谢潮添*
(集美大学水产学院，福建 厦门 361021)
摘要:以坛紫菜转录组测序获得的 unigene 序列为基础，采用 ＲACE(rapid amplification of
cDNA ends)技术克隆获得了坛紫菜的两条 Hsp90 基因序列:PhHsp90-1 和 PhHsp90-2。序列
分析结果表明，PhHsp90-1 序列全长 2 572 bp，包含一个 2 427 bp的开放阅读框，所编码的多肽
包含 809 个氨基酸，分子量为 90． 2 ku，等电点为 4． 79，属于 Hsp90 内质网亚家族(登录号:
KF732651);PhHsp90-2 序列全长 2 510 bp，包含一个 2 280 bp的开放阅读框，所编码的多肽包
含 760 个氨基酸，分子量为 86． 2 ku，等电点为 4． 81，属于 Hsp90 细胞质亚家族(登录号:
KF732652)。基因表达水平的定量分析结果表明，高温和失水胁迫对两条 PhHsp90 基因的表
达水平均有显著影响，但在表达模式上存在明显差异。高温胁迫不同时间水平下，两条
PhHsp90 基因的表达均表现为先上调后下调的趋势;而在失水胁迫下，当失水率小于 60%时，
两条基因的表达水平均没有发生显著变化，但当失水率大于 60%时，两条基因的表达水平均
显著上调，说明两条 PhHsp90 基因均在应答高温胁迫和高度失水胁迫中发挥着重要作用。
关键词:坛紫菜;热激蛋白 90;ＲACE;荧光定量 PCＲ
中图分类号:Q 785;S 917 文献标志码:A
热激蛋白(heat shock protein，Hsp)是一类广泛
存在于各类生物细胞内且高度保守的蛋白，它不仅
受各类逆境胁迫条件的诱导，也广泛参与细胞正常
生理活动的调节，在生物体的生长发育、应答逆境胁
迫以及信号传导等方面发挥着重要作用［1］。根据分
子量、序列同源性以及生物学功能等的不同，大致可
将 Hsp分为 5 个家族:Hsp100，Hsp90，Hsp70，Hsp60
及小分子Hsp(smHsp，分子量为12 ～43 ku的热激蛋
白)［2］。作为分子伴侣，Hsp在细胞正常代谢过程中
负责蛋白的折叠、组装、转运和降解等活动，而在胁
迫状态下则起着稳定蛋白和膜结构、参与蛋白质解
聚再折叠、最终维持细胞稳态的作用［3］。
Hsp90通常以同源二聚体的形式存在，主要定
位于细胞质中，但也有一些成员存在于内质网、线粒
体和叶绿体等亚细胞器中，具有包括应激响应和常
规调节机制在内的多种生理学功能，在所有真核细
胞生物的胁迫响应、生长发育和信号传导中都发挥
着举足轻重的作用，因此受到越来越多的关注［4 －5］。
目前已从拟南芥(Arabidopsis thaliana)［5］、玉米(Zea
mays)［6 －7］、水稻(Oryza sativa)［8］、小麦(Aegilops
tauschii)［9］，以及其他多种植物［10 －12］中分离得到了
了 Hsp90的全长基因，其中，Krishna 等［5］从拟南芥
基因组中分离得到的 Hsp90 家族 7 个成员中，
AtHsp90-1 / －2 / －3 / －4 定位于细胞质中，AtHsp90-
1，AtHsp90-2 和 AtHsp90-3则分别定位于叶绿体、线
粒体和内质网中。在海洋水产生物中，目前也已从
皱纹盘鲍(Haliotis discus)［13］、近江牡蛎(Crassostrea
hongkongensis)［14］、脊 尾 白 虾 (Exopalaemon
carinicauda)［15］、条斑紫菜(Porphyra yezoensis)［16］
和列紫菜(Porphyra seriata)［17］中克隆获得了 Hsp90
家族 的 基 因，但 迄 今 未 见 坛 紫 菜 (Pyropia
haitanensis)Hsp90家族基因克隆的报导。
坛紫菜是闽、浙沿海传统大宗的水产养殖对
象，是我国特有的暖温带性种类，其产量占全国紫
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3 期 代真真，等:坛紫菜两种 Hsp90 基因的克隆及表达特征分析
菜总产量的 75% 以上，创造了可观的经济效
益［18 － 19］。此外，作为生长于潮间带中高潮区的一
种大型海藻，由于受潮汐作用，在干出失水时，坛紫
菜叶状体面临盐度、失水、强光照和紫外辐射等多
种非生物胁迫的影响［18］，加之随着全球气候变暖，
高水温已成为影响坛紫菜产量和品质的重要因
素［20 － 23］，因此研究坛紫菜对逆境胁迫的应答机制，
分离并克隆胁迫应答相关基因就具有十分重要的
意义。本研究是在原有坛紫菜转录组学研究［24］的
基础上，对坛紫菜 Hsp90 家族的两条基因
(PhHsp90-1和 PhHsp90-2)进行全长克隆，并通过
分析这两条基因在高温及失水胁迫下的表达水平
变化，评价其在坛紫菜胁迫应答中的作用。
1 材料与方法
1． 1 坛紫菜样品及胁迫处理
供试材料为人工杂交选育获得的坛紫菜耐高
温性型品系 Z-61［12］，取自福建省坛紫菜种质资源
库。将坛紫菜 Z-61 叶状体在正常温度下培养，培
养条件为温度 21 ℃，光照强度 50 ～ 60 μmol
photons /(m2·s) ，光照周期 12L ∶ 12D，(隔 2 天更
换过滤新鲜海水一次) ，待叶状体生长至(15 ± 2)
cm 时，选取叶面平滑、色深有光泽、无斑点烂洞、处
于旺盛生长期的健康藻体置于(29 ± 0． 5)℃的恒
温光照培养箱中进行高温胁迫处理(其余培养条件
同正常条件)3 h后作为实验组，提取总 ＲNA，并逆
转录成 cDNA 后用于 Hsp90家族基因的全长克隆。
另取一组(15 ± 2)cm 的完整藻体置于(29 ±
0． 5)℃的恒温光照培养箱中分别进行高温胁迫
处理(其余培养条件同正常条件)0、3、6、12、24 和
48 h后，提取总 ＲNA，用于高温胁迫条件下基因
表达水平的实时荧光定量 PCＲ(qPCＲ)分析。
同时，再取一组藻体，用纱布轻压吸干藻体表
面水分后，置于干燥纱布上，放于 21 ℃，光照强度
50 ～ 60 μmol photons /(m2·s)的干燥箱内干燥
失水。根据预实验确定的干燥时间，分别取样失
水率为 0、10%、40%、60%、90%的样品和干燥失
水至失水率为 90%后再浸泡于新鲜海水中培养
30 min后(复水)的样品进行总 ＲNA 的提取，用
于失水胁迫条件下基因表达水平的 qPCＲ 分析。
失水率计算公式:失水率 =(鲜重 －失水后藻体
重)/(鲜重 －干重)× 100%
以上每个处理，设置 3 个平行。
1． 2 引物及其序列
全长基因 ＲACE 扩增、阳性克隆筛选、全长
验证、以及基因表达水平 qPCＲ 分析所采用的引
物序列如表 1 所示，由上海生工生物工程有限公
司合成。
表 1 实验中所用引物的名称和序列
Tab． 1 Name and sequence of primer in this experiment
用途
usage
基因
gene
引物名称
primer name
引物序列(5-3)
sequence
全长扩增
ＲACE
PhHsp90-1
PhHsp90-2
Ｒ901GSP-5 GGACTTTTGTAGCATCTCGC
Ｒ901NGSP-5 TCGCGGATGGTAAAGGTCTG
Ｒ901GSP-3 GGCTTCTGCCACGCTATTTG
Ｒ901NGSP-3 CCCGACTACCAGGGCTCCAA
Ｒ902GSP-5 CACCAACTTCTTCCCATCATAC
Ｒ902NGSP-5 GGAGAACTGCTCGTAGAACACC
Ｒ902GSP-3 CCTCAACTTTGTGAAGGGTGT
Ｒ902NGSP-3 CACGAGGACTCGCAGAACCG
全长验证
head to toe
PhHsp90-1
PhHsp90-2
H901F GACATCATCATCAACTCGCTCTACTC
H901Ｒ CCTACAACTCATCGTGGTCCTCA
H902F TCGTCATCCCGTCTGTAGTG
H902Ｒ ACACCCACCCGACTCTACAC
定量分析
qPCＲ
PhHsp90-1
PhHsp90-2
Q901F TGCTGAGGACCACGATGAG
Q901Ｒ CCACGCAGACGGAGAAATA
Q902F CTGGTGACGGGTGAGTATGG
Q902Ｒ GATCGAGTTGGTCGGGTTG
内参
internal control
UBC
UBCF TCACAACGAGGATTTACCACC
UBCＲ GAGGAGCACCTTGGAAACG
阳性克隆筛选
validation of positive clone
ＲV-M GAGCGGATAACAATTTCACACAGG
M13-20 CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT
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水 产 学 报 38 卷
1． 3 总 ＲNA的分离纯化
收集坛紫菜藻体 0． 1 g，经滤纸吸干和液氮研
磨后，采用 E． Z． N． A 植物 ＲNA 提取试剂盒
(OMEGA，德国)提取各样品的总 ＲNA。经凝胶
电泳检查所提取总 ＲNA 的完整性，并在 Cary50
紫外分光光度计上分别测定 OD260和 OD280值，根
据测定结果计算 ＲNA 的浓度，判断核酸和蛋白质
的污染情况。
1． 4 PhHsp90 基因的全长克隆
根据坛紫菜转录组数据库 unigene 的注释
结果，筛选出与皱波角叉菜(Chondrus crispus)
Hsp90 基 因 序 列 相 似 性 为 56% 的 unigene
(CL846． Contig2)作为 PhHsp90-1 基因全长克
隆的核心序列，同时筛选出与条斑紫菜 Hsp90
基因序列相似性为 93% 的 unigene(CL80．
Contig2)作为 PhHsp90-2 基因全长克隆的核心
序列。根据核心序列，分别设计 PhHsp90-1 和
PhHsp90-2 基因 5-和 3-ＲACE 扩增的特异性扩
增引物(GSP)和巢式引物(NGSP) (表 1) ，按照
SMAＲTer ＲACE cDNA Amplification Kit试剂盒
的说明分别进行两个基因的 5-和 3- ＲACE 扩
增。将 ＲACE 扩增的目的片段切胶回收、转化
至 E． coli DH5α 感受态细胞中，经蓝白斑筛选和
阳性克隆验证后送往大连宝生物有限公司进行
测序。
1． 5 PhHsp90 基因的全长验证
首先根据测序获得的各基因的 5和 3序列
与核心序列的重叠区，采用 DNAMAN 5． 2． 2
(Lynnon BioSoft)软件进行拼接，获得各基因的
全长序列。然后根据拼接获得的全长序列，设
计 Head to toe 引物，以 ＲACE 扩增时获得的
cDNA 为模板，进行普通 PCＲ 扩增，同样将扩增
产物进行切胶回收、转化和测序，并将测序结果
与拼接结果进行比对，以验证全长克隆的正
确性。
1． 6 PhHsp90 基因的生物信息学分析
对所获得的全长基因序列利用 NCBI 的
Blastn 程序进行序列同源性检测，并采用 OＲF
Finder(http:∥ www ． ncbi． nlm． nih． gov /gorf /
gorf． html)软件分析各基因的开放阅读框(OＲF)
和所编码氨基酸序列;使用在线软件 PＲOSITE
(http:∥prosite． expasy． org /) ，InterProScan(http:
∥www ． ebi． ac． uk /Tools /pfa / iprscan /)和 PrediSi
(http:∥www ． predisi． de)查找基因序列的保守位
点和信号肽序列;采用 Clustal X［25］进行氨基酸多
重序列比对，并采用 MEGA 5． 10［26］软件构建了
Hsp90 蛋白的系统进化树。
1． 7 PhHsp90 基因表达水平的 qPCＲ分析
根据基因序列设计 qPCＲ 正反向引物，并以
UBC 基因作为内参，进行 PhHsp90-1 和 PhHsp90-
2 基因在高温和失水胁迫条件下表达水平的
qPCＲ分析。
提取的各样品总 ＲNA 按 PrimeScript ＲT
reagent kit(TaKaＲa，大连)的说明书进行操作。
25 μL 的反应体系包含:12． 5 μL 2 × SYBＲ
Premix Ex Taq TMⅡ(TaKaＲa) ，0． 2 μmol /L 引物
和 2 μL 反转录产物。扩增程序为 95 ℃变性 1
min;95 ℃ 10 s，62 ℃ 30 s，40 个循环。循环结束
后从 55 ℃缓慢升温至 95 ℃，绘制熔解曲线。荧
光定量 PCＲ 扩增在 ABI7300 型定量 PCＲ 仪上
进行。
以 10 ×梯度稀释的 cDNA 为模板进行定量
PCＲ扩增，制作 PhHsp90-1，PhHsp90-2 和内参基
因的标准曲线。每次反应都设置阴性对照和无模
板对照，每个反应设 3 个平行复孔。应用 Excel
和 SPSS 13． 0 软件对实验数据进行统计分析，并
采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)和最小
显著差异法(LSD)比较不同数据组间的差异，
P ＜ 0． 05 表示差异显著，P ＜ 0． 01 表示极显著
差异。
2 结果
2． 1 PhHsp90 基因的全长克隆
PhHsp90-1 以坛紫菜 CL846． Contig2 序
列为核心，通过 ＲACE 扩增和测序，获得一条长
度为 482 bp 的 5-ＲACE(图 1-1)和一条 820 bp
的 3-ＲACE(图 1-2) ，根据两条末端序列和核心
序列的重叠区，拼接获得了一条长度为 2 572 bp
的全长序列，经过全长序列验证(图 1-3)和比对，
确认该基因为坛紫菜的 Hsp90 基因，命名为
PhHsp90-1。该基因已提交到 GenBank 数据库
中，登录号为 KF732651。通过 OＲF Finder 软件
分析发现，该基因序列 34 ～ 2463 个碱基为完整的
开放阅读框(open reading frame，OＲF) ，可编码包
含 809 个氨基酸，分子量为 90． 2 ku，等电点为
4． 79的蛋白质。
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3 期 代真真，等:坛紫菜两种 Hsp90 基因的克隆及表达特征分析
PhHsp90-2 以坛紫菜 CL80． Contig2 序列
为核心，通过 ＲACE 扩增和测序，获得一条长度
为 1 476 bp的 5-ＲACE(图 1-4)和一条 1 012 bp
的 3-ＲACE(图 1-5) ，根据两条末端序列和核心
序列的重叠区，拼接获得了一条长度为 2 510 bp
的全长序列，经过全长序列验证(图 1-6)和比对，
确认该基因为坛紫菜的 Hsp90 基因，命名为
PhHsp90-2。该基因已提交到 GenBank 数据库
中，登录号为 KF732652。通过 OＲF Finder 软件
分析发现，该基因序列 73 ～ 2 355 个碱基为完整
的开放阅读框，可编码包含 760 个氨基酸，分子量
为 86． 2 ku，等电点为 4． 81 的蛋白质。
图 1 PhHsp90 基因克隆产物电泳图
1． PhHsp90-1 基因的 5-ＲACE扩增产物;2． PhHsp90-1 基因的 3-ＲACE 扩增产物(箭号) ;3． PhHsp90-1 基因的全长扩增产物;4．
PhHsp90-2 基因的 5-ＲACE扩增产物;5． PhHsp90-2 基因的 3-ＲACE 扩增产物;6． PhHsp90-2 基因的全长扩增产物
Fig． 1 Agarose electrophoresis of ＲACE or Head to toe products of PhHsp90 genes
1． 5-ＲACE products of PhHsp90-1;2． 3-ＲACE products of PhHsp90-1(arrow) ;3． Head to toe products of PhHsp90-1;4． 5-ＲACE
products of PhHsp90-2;5． 3-ＲACE products of PhHsp90-2;6． Head to toe products of PhHsp90-2
2． 2 PhHsp90 基因的多序列比对分析
序列同源性比对结果表明，所克隆的两条基
因均 属 于 Hsp90 基 因 家 族，PhHsp90-1 与
PhHsp90-2 的氨基酸序列相似性仅为 42%，但
PhHsp90-1 与皱波角叉菜 Hsp90 氨基酸序列相似
性为 58%，PhHsp90-2 与条斑紫菜 Hsp90 氨基酸
序列相似性为 97%。基于多序列比对，可将两条
PhHsp90 蛋白的氨基酸序列划分成 3 个保守区域
(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)和 4 个可变区域(A、B、C、D) ，其中
可变区 A 和保守区Ⅰ构成了 N 端结构域，包含一
个组氨酸蛋白激酶类 ATPase 结构域，参与了
ATP 的结合和水解;保守区Ⅱ构成了中间结构
域，参 与 了 结 合 ATP 底 物 和 辅 陪 伴 分 子
(cochaperone) ;保守区Ⅲ和可变区 D 构成了 C 端
结构域，参与了多聚化过程(图 2)。
使用 PＲOSITE 和 InterProScan 软件分析发
现，两个 PhHsp90 蛋白的氨基酸序列均含有
Hsp90 家 族 的 5 条 特 征 性 序 列:
NKEIFLＲELISNSSDALDKIＲ、 LGTIAＲSGT、
MIGQFGVGFYSAYLVA、 IKLYVＲＲVFI 和
GIVDSEDLPLNISＲE(图 2)。此外，PhHsp90-1 与
皱波角叉菜内质网 Hsp90 蛋白氨基酸的羧基末端
序列一致为 HDEL(图 2) ，这与内质网 Hsp90 亚
家族的羧基末端保守序列 KDEL 类似，存在一个
K-H的氨基酸保守替换，说明 PhHsp90-1 蛋白可
能定位于内质网中;PhHsp90-2 与条斑紫菜细胞
质 Hsp90 蛋白氨基酸的羧基末端序列一致为
MEDVD(图 2) ，这与细胞质 Hsp90 的羧基末端保
守序列 MEEVD 类似，存在一个 E-D 的氨基酸保
守替换，说明 PhHsp90-2 蛋白可能定位于细胞质
中。但通过 PrediSi软件，在两条 PhHsp90 蛋白的
氨基酸序列中均没有找到信号肽序列。
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水 产 学 报 38 卷
图 2 Hsp90 蛋白氨基酸序列的多重序列比对
“| |”分隔保守区和可变区，“方框”表示 Hsp90 蛋白家族的特征序列，“ ～”表示组氨酸蛋白激酶类 ATPase结构域，“ =”表示类核
糖体蛋白 S5 结构域，羧基末端保守“HDEL”和“MEDVD”加粗字体表示
Fig． 2 Multi-alignment of amino acid sequence of Hsp90
Thevariable regions and conserved regions were spaced by“| |”． The putative ATP-binding domain is underlined with“ ～”． The putative
ribosomal protein S5 domain is underlined with“ =”． The five conserved signature motifs of Hsp90 are boxed． The conserved amino acids
motif，HDEL for the endoplasmic reticulum targeting sequence，is marked as bold in PhHsp90-1． The conserved amino acids motif，
MEDVD for the cytoplasmic group，is marked as bold in PhHsp90-2
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3 期 代真真，等:坛紫菜两种 Hsp90 基因的克隆及表达特征分析
2． 3 PhHsp90 蛋白的系统进化分析
为进一步分析 PhHsp90 蛋白的系统进化关
系及亚细胞定位，根据 GenBank 数据库中公布的
已知亚细胞定位的藻类、陆生植物和动物的 30 条
Hsp90 蛋白的氨基酸序列和两条 PhHsp90 蛋白序
列，通过MEGA 5． 0 程序采用 Neighbor-Joining 法
构建了 Hsp90 蛋白的系统进化树(图 3)。Hsp90
蛋白的系统进化树首先按不同的亚细胞定位分为
4 个分支，分别为细胞质 Hsp90、内质网 Hsp90、叶
绿体 Hsp90 和线粒体 Hsp90 (图 3)。其中
PhHsp90-1 与内质网 Hsp90 聚类为一个分支，而
PhHsp90-2 与细胞质 Hsp90 聚类为一个分支，这
与序列分析中的亚细胞定位的预测结果一致，由
此可以确定 PhHsp90-1 蛋白定位于内质网中，
PhHsp90-2 蛋白则定位于内质网中。在系统关系
进化上，两条 PhHsp90 蛋白均与同属红藻门的其
他物种亲缘关系最近，与其他藻类的亲缘关系次
之，最后才与陆生植物和动物聚类在一起。
图 3 基于氨基酸序列构建的 Hsp90 的系统进化树
Fig． 3 Phylogenetic tree constructed with Hsp90 amino acid sequences
2． 4 PhHsp90 基因表达水平的 qPCＲ分析
基因相对表达水平的定量分析有助于了解相
关基因在特定条件下的功能。本研究 qPCＲ 分析
结果显示，高温和失水胁迫对 PhHsp90 基因的相
对表达水平均有显著影响(图 4)。在 29 ℃高温
胁迫不同时间水平下，PhHsp90-1 和 PhHsp90-2
基因的表达水平均呈现为先上调后下调的趋势，
但表达水平最高的时间点并不一致(图 4-a，b)。
PhHsp90-1 在高温胁迫 3 h时，即可检测到表达水
平极显著上调至最高水平(P ＜ 0． 01) ，为高温胁
迫前表达水平的 15． 7 倍，随后开始下调，至 12 h
时，表达水平即与高温胁迫前没有显著差异(P ＞
543
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水 产 学 报 38 卷
0． 05) ，在高温胁迫 6 h 至 48 h 之间，表达水平没
有显著差异(P ＞ 0． 05) (图 4-a) ;而 PhHsp90-2 在
高温胁迫 3h 时，也可检测到表达水平显著上调
(P ＜ 0． 05) ，至高温胁迫 6 h时，表达水平最高，为
高温胁迫前表达水平的 8． 3 倍，随后开始逐渐回
落，至 48 h 时，表达水平与高温胁迫前没有显著
差异(P ＞ 0． 05) ，在高温胁迫 12 h 至 48 h 之间，
表达水平没有显著差异(P ＞ 0． 05) (图 4-b) ，说明
两个基因在坛紫菜叶状体的高温胁迫应答中均发
挥着重要的作用。
在不同失水胁迫条件下，PhHsp90-1 和
PhHsp90-2 的表达水平变化趋势表现一致，在失
水率小于 60%条件下，两个基因的表达水平均没
有发生显著变化(P ＞ 0． 05) ，但当失水率 ＞ 60%
时，两个基因的表达水平均发生了显著上调(P ＜
0． 05) ，且在失水率达到 90%后，将藻体重新浸泡
于新鲜海水中培养 30 min，两个基因的表达水平
仍然表现为上调，但与失水率为 90%时的表达水
平相比，没有显著差异(P ＞ 0． 05) (图 4-c，d)。说
明两个基因在轻度失水胁迫(＜ 60%)下，均没有
发生明显作用，但参与了高度失水胁迫(＞ 60%)
的应答响应过程。
图 4 不同胁迫条件下 PhHsp90 的相对表达水平
(a) ，(b)．高温胁迫;(c) ，(d)．失水胁迫。不具有相同字母上标的数据间差异显著(P ＜ 0． 05)
Fig． 4 The relative expression levels of PhHsp90 genes at different levels of stress
(a) ，(b)． The relative expression levels of PhHsp90 genes in different time of high temperature stress．(c) ，(d)． The relative expression
levels of PhHsp90 genes in different level of desiccation and in rehydration for 30 min． Bar of each column with different small letters mean
significant difference(P ＜ 0． 05)
3 讨论
植物为适应不断变化的环境条件，在长期演化
过程中形成了应答各种生物或非生物逆境胁迫的
复杂机制，而 Hsp 的表达和积累是其中关键的一
环［1］。作为 Hsp家族重要成员的 Hsp90，已有的大
量研究结果表明，其广泛参与了各类生物及非生物
的胁迫响应过程，在稳定和激活各种关键信号蛋白
方面发挥着重要作用［4］。目前已从各种陆生植物
和藻类中分离得到了 Hsp90的全长基因，并对其在
逆境胁迫条件下的表达和功能进行了研究［5 － 17］。
本研究以转录组测序获得的 unigene 序列为基础，
通过 ＲACE扩增获得了坛紫菜两条 Hsp90 基因的
全长 cDNAs序列，并通过序列保守性和系统进化
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3 期 代真真，等:坛紫菜两种 Hsp90 基因的克隆及表达特征分析
树分析确认两条坛紫菜 Hsp90 基因分别属于内质
网 Hsp90 亚家族(PhHsp90-1)和细胞质 Hsp90 亚
家族(PhHsp90-2)。
3． 1 PhHsp90 蛋白氨基酸序列的保守性分析
Hsp90 是一类在所有真核生物中都高度保守
的胁迫蛋白，通常每个单体的氨基酸序列都可分
为 3 个主要的保守结构域［27］，同时具有 5 条特征
性的标记序列［28］:NKEIFLＲELISNSSDALDKIＲ、
LGTIAＲSGT、MIGQFGVGFYSAYLVA、IKLYVＲＲVFI
和 GIVDSEDLPLNISＲE。本研究获得的两条基
因所编码氨基酸序列中同样都可分为 3 个主要的
结构域，即由可变区 A 和保守区Ⅰ构成的参与
ATP结合和水解的 N 端 ATPase 结构域，保守区
Ⅱ构成的参与结合 ATP 底物和辅陪伴分子的中
间结构域，以及由保守区Ⅲ和可变区 D 构成的参
与多聚化过程的 C 端结构域;同时保守区Ⅰ和保
守区Ⅱ也包含有 5 条特征性的标记序列;并且两
个蛋白的羧基末端序列分别为内质网和细胞质的
定位信号序列 HDEL 和 MEDVD(图 2)。尽管
PhHsp90 的特征性标记序列和定位信号序列与高
等植物和动物的相应序列存在着个别氨基酸残基
的差异，但这些序列与其他大型藻类相同亚家族
的 Hsp90 相应序列完全一致，这可能与大型藻类
在进化上的特殊起源有关［29］。
一般认为，来自于不同物种相同亚家族的
Hsp90 序列间的同源性要高于同一物种不同亚家
族 Hsp90 序列间的同源性［28］。在本研究中同样
存在这一现象，坛紫菜 PhHsp90-1 和 PhHsp90-1
的氨基酸序列同源性只有 42%，但 PhHsp90-1 与
皱波角叉菜 Hsp90 氨基酸序列同源性为 58%，
PhHsp90-2 与条斑紫菜 Hsp90 氨基酸序列同源性
为 97%;系统进化树分析结果同样表明，不论动
物还是植物，所有的 Hsp90 均首先按照亚细胞定
位的不同分别聚类为一支(图 3)。
3． 2 PhHsp90 基因应答高温和失水胁迫的表达
水平分析
紫菜作为分布于潮间带中高潮区的一类大型
海藻，每天伴随着潮汐变化，周期性地干出与覆
水，在干出时面临盐度、失水、强光照和紫外线等
多种非生物条件的剧烈变化。为适应这一独特的
生态条件，紫菜体内形成了一个庞大且复杂的调
节系统，包括了无数的调节和反馈机制，涉及大量
基因的差异表达与调控［18］。王孟强［30］利用基因
芯片技术研究了条斑紫菜在不同失水水平下的基
因表达谱变化，结果发现在条斑紫菜配子体的失
水过程中，大约有 8． 74% ～ 11． 09%的基因上调，
而下调表达基因的数量则在各个阶段变化较大。
坛紫菜藻体的自然生长期在每年的 9 月至次年的
2 月，生长的适宜温度为 16 ～ 24 ℃。随着全球气
候变暖，养殖季节海区的持续高温也对坛紫菜藻
体的正常生长造成了威胁，近年来已多次发生高
温引起的烂苗或烂菜事件。因此，分析 Hsp90 在
高温和失水胁迫条件下的表达水平变化对于解析
Hsp90 在应答逆境胁迫中的功能就具有十分重要
的意义。
本研究结果表明，高温和失水胁迫对
PhHsp90 基因的表达水平均有显著影响，但在表
达模式上存在明显差异。高温胁迫不同时间水平
下，两条 PhHsp90 基因的表达水平均表现为先升
高后下降的趋势(图 4-a，b) ，说明 PhHsp90 基因
的表达可能存在一个反馈调节机制:高温胁迫初
期，由于受到不适温度的影响，各功能蛋白活性受
到抑制，蛋白解聚增加，这一生理状态刺激了
PhHsp90 表达水平的上调，参与信号蛋白分子的
激活和解聚蛋白的再折叠，从而稳定了各功能蛋
白和膜结构，维持了细胞稳态，解聚蛋白含量下
降，PhHsp90 的表达水平也随之下调。周向红
等［16］等的研究结果也表明，高温胁迫条件会引起
条斑紫菜 Hsp90 基因表达水平的显著上升。由此
说明，两个 PhHsp90 基因在坛紫菜藻体的高温胁
迫应答中均发挥着重要的作用。但两条 PhHsp90
基因在应答失水胁迫时的表达模式却与高温胁迫
条件下的不同:失水率小于 60%时，两个基因的
表达水平均没有发生显著变化，但当失水率大于
60%时，两个基因的表达水平开始显著上调(图
4-c，d)。由此说明 PhHsp90 基因在应答轻度失水
时没有发挥明显作用，但在应答高度失水的过程
中发挥着显著作用。出现这一现象的可能原因
是，轻度失水已经成为坛紫菜日常生长所必须面
对的常态化事件，坛紫菜细胞形成了另外一套更
为经济的系统来维护轻度失水条件下的蛋白构象
和细胞稳态，细胞中无法积累足够的解聚蛋白来
刺激 PhHsp90 的表达和合成。如 Liu［31］在条斑紫
菜中的研究结果就表明，条斑紫菜细胞膜上富含
的红藻糖苷和多不饱和脂肪酸可以维持细胞膜的
液态，细胞质内形成氢键框架(hydrogen bonding
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水 产 学 报 38 卷
framework)以降低分子运动来抵御失水胁迫。但
在高度失水条件下，已有的保护系统已不足以维
持功能蛋白的构象，解聚蛋白增加，从而引起了
PhHsp90 基因的上调表达。
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Cloning and expression pattern analysis of two heat shock
protein(Hsp90)genes from Pyropia haitanensis
DAI Zhenzhen，LI Bing，XU Yan，JI Dehua，CHEN Changsheng，XIE Chaotian*
(College of Fisheries，Jimei University，Xiamen 361021，China)
Abstract:Heat shock protein(Hsp90) ，representing an important molecular chaperone in eukaryotic cells，
plays particularly important roles in a variety of stress responses，development and signal transduction of
plants． In this study，based on unigene sequences which were obtained from whole transcriptome sequencing
of P． haitanensis，two full-length PhHsp90 genes were obtained by rapid amplification of cDNA ends
(ＲACE) ，and named PhHsp90-1 and PhHsp90-2． The full-length cDNA of the PhHsp90-1 gene comprised
2 572 nucleotides and contained an open reading frame of 2 427 bp(GenBank accession:KF732652) ，
encoding a protein of 809 amino acid residues with the predicted molecular weight of 90． 2 kDa and
theoretical isoelectric point of 4． 79;and the full-length cDNA of the PhHsp90-2 gene comprised 2 510
nucleotides and contained an open reading frame of 2280bp(GenBank accession:KF732651) ，encoding a
protein of 760 amino acid residues with the predicted molecular weight of 86． 2 kDa and theoretical
isoelectric point of 4． 81． On the basis of conserved motifs and phylogenetic tree analysis，PhHsp90-1 belongs
to the endoplasmic reticulum subfamily of Hsp90 and PhHsp90-2 belongs to the cytoplasmic subfamily of
Hsp90． The expressions of the two PhHsp90 genes，as measured by real-time quantitative PCＲ，were
significantly induced by high-temperature stress and desiccation stress，but had different expression patterns．
Under high-temperature stress，the expression levels of the two PhHsp90 genes all significantly increased first
and then decreased． However，during desiccation，the expression levels of PhHsp90-1 and PhHsp90-2 were
significantly increased only when the water loss was ＞ 60% ． These results suggested that the two PhHsp90s
play important roles in the response to high-temperature stress and extreme desiccation stress．
Key words:Pyropia haitanensis;heat shock protein 90;ＲACE;real-time quantitative PCＲ
Corresponding author:XIE Chaotian． E-mail:ctxie@ jmu． edu． cn
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