全 文 ：第 28卷第 5期
2009年 5月
水 产 科 学
F ISH ERIES　SCIENCE Vol.28 No.5May 2009
新月菱形藻的光生物反应器半连续培养
孙利芹 ,任莉红 ,王长海
(烟台大学 海洋学院 ,山东　烟台　264005)
摘　要:利用平板式光生物反应器对新月菱形藻进行半连续培养 ,探讨更新率 、更新周期对新月菱形
藻生长 、细胞采收量 、生化成分及细胞生物量产率的影响。结果显示 , 随更新率的增大 ,新月菱形藻的
生长速率增大 , 藻液中氮磷的平均含量上升 ,而平均细胞密度及产率呈下降趋势;总采收量与更新率呈
抛物线关系 , 细胞生物量 、胞内多糖和蛋白的最大采收量分别收获于 33%、25.2%和 34.7%的更新率
下 , 其最大值分别为 2.11×1012 cell 、3623 mg 和 2347 mg 。更新周期的延长导致新月菱形藻平均生长
速率减小 , 藻液中氮磷的平均含量下降 ,而采收的平均细胞密度与产率增大 ,胞内代谢物蛋白质和多糖
的含量增加;总细胞采收量随着更新周期的延长减小 ,当更新周期为 1 d 时采收量最大 ,为 3.12×1012
cell。综合考虑 ,更新率为 33%、更新周期为 1 d , 是收获生物量的最佳条件。
关键词:新月菱形藻;光生物反应器;更新率;更新周期;半连续培养
中图分类号:Q949.28 文献标识码:A 文章编号:1003-1111(2009)05-0246-05
收稿日期:2008-08-08;　修回日期:2008-09-12.
基金项目:山东省自然科学基金资助项目(Y2007D59);农业部辽宁省海水增养殖与生物技术重点试验室开放课题(K2006-03).
作者简介:孙利芹(1973-), 女 ,副教授 , 博士研究生 ,研究方向:海洋微藻;E-mai l:sliqin2005@163.com.通讯作者:王长海
(1962-),男 ,教授 ,博士生导师 ,研究方向:海洋生化工程;E-mail:chw ang2001@sina.com .
　　新月菱形藻(N itz schia closterium)为水产经
济动物鱼 、虾 、贝类育苗时的良好生物饵料[ 1] ,其计
划性 、稳定性供给 ,直接关系到育苗的成败。在实
际生产中 ,新月菱形藻主要利用开放式水泥池进行
大规模培养 ,由于该生产方式存在培养环境不稳
定 、培养条件难以控制 、培养过程易被污染 ,使该微
藻的培养藻密度低下 ,常常引发育苗过程中该微藻
饵料的供给不足;由于微藻密度过低 ,为了满足幼
苗个体的营养需求不得不向育苗池中投入过多藻
液 ,使育苗池的水体污染 ,进而影响水质 ,尤其是投
放被污染和老化的藻液时更为严重[ 2] 。
采用密闭式光生物反应器培养可以克服以上
缺点 ,提高培养效率 ,实现无菌培养 、生产管理的自
动化 。实际生产中微藻的培养方式通常有批式培
养 、半连续培养和连续培养。其中半连续培养具有
操作简便 ,可以通过改变培养参数如更新速率和营
养盐浓度而控制微藻细胞生物量的生物化学组成
等优点 ,而引起人们的研究兴趣[ 3-6] 。笔者利用一
种平板式光生物反应器培养新月菱形藻 ,探讨半连
续培养的更新速率和更新周期与新月菱形藻采收
量及蛋白质 、多糖等代谢产物产量的动态变化关
系 ,为高密度大规模培养该微藻提供有价值的参
考。
1　材料与方法
1.1　试验材料
藻种:新月菱形藻原种购于中国海洋大学 ,经
分离纯化后由烟台大学海洋生化工程研究所保存。
海水处理:烟台市莱山区近海域水 ,沉淀后经
0.22 μm 膜过滤后使用 。
优化培养基:NaNO 3 300 mg/ L , N aH2 PO 4 25
mg/ L ,N aHCO 3 500 mg/L ,NaSiO 3·9H2O 50 mg/
L;f/2维生素 1 ml/L(VB1 100 mg , VB12 0.5 mg ,蒸
馏水 1000 m l配制);f/2 微量元素 1 m l/L ,灭菌海
水配制 。
1.2　培养方法
将预培养至对数生长期的藻液接种于 15 L 平
板式光生物反应器 ,接种量为 10%,在温度(23±
1)℃,光照度 3500 lx ,通气量 3.0 L/min ,连续光照
的条件下培养6 d后 ,启动半连续培养 ,定期取出一
定量的藻液 ,同时补充相同量的新鲜培养液 ,培养
总体积为 10 L ,更新率(R)设 5 个水平 , 分别为
10%、15%、20%、30%、40%;更新周期(t)的 5个水
平分别为 1 、2 、3 、4 、5 d。
1.3　测定方法
细胞计量:培养液经无菌海水适当稀释后 ,用
血球计数板计数 3次 ,更新后的细胞密度(B′)按更
新前藻浓度(B)及更新率折算。
DOI :10.16378/j.cnki.1003-1111.2009.05.005
采收量(Y)按Y =V ×R×B 计算 ,培养期间的
总采收量Y′为日采收量的总和 ,即Y′=∑Y 。
生长率(K)按 Fabregas等[ 7] 公式计算:
K=(LnN t -LnN 0)/(Ln2×t)
式中 , K 表示生长速率(1 /d);N t为试验结束时细胞密
度;N 0为试验开始时细胞密度;t为试验时间。
细胞生物量产率 p=(Y′/(V×R×t)
蛋白质采用考马斯亮蓝法测定[ 8] , 经回归分
析 ,蛋白质浓度 C1与吸光度 A1间的关系为:
A1 =1.1056C1 -0.0344 , r2 =0.9950
胞内多糖测定采用蒽酮硫酸法[ 8] ,线性回归得
标准曲线为:
A2 =0.7719C2 +0.1786 , r2 =0.9879
硝酸氮浓度测定采用紫外分光光度法[ 9] ,线性
回归得标准曲线为:
A3 =1.9044C3 +0.1567 , r2 =0.9949
溶解态磷的测定采用磷钼蓝法[ 9] ,线性回归得
标准曲线为:
A4 =0.6806C4 -0.001 , r2 =0.9979
2　结果与分析
2.1　更新率对藻细胞生长的影响
更新率对新月菱形藻生长的影响见图 1。由图
1可见 ,经 6 d的培养各试验组的细胞密度均达到
了 1.62×107cell/ml ,并以此为起点开始连续更新
试验 。经过 5 d的连续更新培养 ,各试验组的细胞
生长速度基本趋于稳定。10%、15%组与 20%组的
培养密度明显高于更新起始密度 ,当细胞密度分别
达到 3.40×107 、2.80×107 、2.19×107 cell/ml时 ,
其生长达到了稳定状态。30%组略高于更新起始
密度 ,其培养密度基本维持在 1.72×107 cell/ml;
40%组在开始更新后细胞密度下降 , 并在 1.05
　　
×107 cel l/ml的低水平下达到平衡。方差分析显
示 ,不同更新率下的平均细胞密度差异显著 ,培养
密度随更新率的增加而降低 , 10%、15%组的细胞
密度明显高于其他组 ,40%组最低。
图 1　不同更新率新月菱形藻的生长曲线
培养体系中 pH 值随更新率的变化见图 2。由
表 2可见 ,当细胞生长至第 6 d ,各试验组的 pH 均
达到约 9.90 ,连续更新 13 d后 ,各培养组的 pH 值
存在很大的差异。与更新起始值相比 , 30%组与
40%组呈上升趋势 , 最高值可达 10.10;而 10%、
15%与 20%组呈下降趋势 ,且依次降低 。更新期
间 ,pH 随更新率的增加而上升;但 20%、30%组的
pH 值变化相对比较稳定 。
图 2　培养体系中 pH 值的变化
表 1　不同更新率下细胞生长率的比较
更新率
%
日生长速率/ d-1 平均生长速率
d-1K 1 K 2 K 3 K4 K 5 K 6 K 7 K 8 K 9
10 0.105 0.512 0.476 0.192 0.262 0.158 0.130 0.174 0.142 0.239dC±0.014
15 0.526 0.497 0.299 0.124 0.345 0.219 0.327 0.142 0.281 0.307cC±0.013
20 0.424 0.347 0.322 0.442 0.416 0.339 0.279 0.373 0.325 0.363cC±0.05
30 0.562 0.551 0.550 0.471 0.549 0.477 0.620 0.359 0.571 0.523bB±0.07
40 0.539 0.611 0.670 0.692 0.725 0.713 0.749 0.755 0.842 0.699aA ±0.08
注:K i表示第 i天的生长速率。同一列数据中的小写字母相同者表示差异不显著(P>0.05);小写字母不同而大
写母相同者表示差异显著(P<0.05);大写和小写字母均不同者 ,表示差异极显著(P<0.01).表 2 、表 3同.
　　更新开始后 ,各试验组的生长速率变化较大
(表 1)。由表 1可见 ,更新 5 d 后 , 10%、15%组与
20%组呈波动变化 ,30%组基本稳定 ,而 40%组呈
上升趋势 ,平均生长速率随更新率的增大而增大 ,
40%组的最大 ,为 0.699/d , 10%组的最小 ,仅为
0.239/d。可见 ,随着更新率的加大 ,有助于提高细
胞的生长速度。
更新培养过程中 N 、P质量浓度的变化见图 3 、
247第 5期 孙利芹等:新月菱形藻的光生物反应器半连续培养
图 4。由图 3和图 4 可见 ,在培养的第 6 d开始按
比例更新培养液后 , NO 3-N 与 PO 4-P 质量浓度随
更新率的升高其浓度衰减速度呈现加大的差异。
10%、15%、20%组随更新时间的延长呈递减状态 ,
30%组相对稳定 , 40%组则呈上升趋势。更新 9 d
后 ,40%组中 NO 3-N 与 PO4-P 的质量浓度分别达
到1.10 mg/L 与 0.50 mg/L ,均明显高于更新起始
时的质量浓度 ,而 10%组的 NO 3-N为 0.10 mg/L ,
PO4-P 极少 ,仅为 0.07 mg/L 。这说明 ,低更新率
下 ,更新所得的 N 、P 满足不了藻生长的需求 ,而高
更新率下 ,因发生累积现象 ,导致培养液中 N 、P 的
质量浓度上升;在更新率为 30%时 ,N 、P 质量浓度
分别维持在约 0.90 、0.30 mg/ L ,说明 N 、P 的代谢
相对平衡 ,生长稳定 。不同更新率下的 N 、P 质量
浓度存在明显的差异 ,40%组远高于 10%组 。
2.2　更新率对新月菱形藻采收量和生化组成的影
响
经过连续更新 16 d后 ,更新速率对新月菱形藻
胞内合成蛋白质与多糖的影响见表 2。由表 2可
见 ,新月菱形藻胞内蛋白质的平均含量随更新率的
增大而下降 ,10%组最大 ,为 81 mg/L ,是 40%组的
2.4倍。而胞内多糖和蛋白的总采收量与更新率呈
抛物线关系 ,经计算得 ,更新率为 25.2%和 34.7%
时 ,多糖和蛋白质的总采收量最大 ,分别为 3623
mg 和 2347 mg 。
在整个半连续培养过程中 ,各试验组的总采收
量相差很大 。不同更新率下 ,细胞总采收量随更新
率的增大先上升后下降 , 30%组最大 ,为 2.10 ×
10
12
cell , 20%组与 40%组次之 ,10%组与 15%组最
小 。采收量与更新率呈抛物线关系 ,回归分析得
Y′=-22.579R2 +14.917R-0.3667 , r2 =0.9770
显然 ,存在一个 R 值 ,使总采收量最大 ,经计算
可知 ,当更新率为 33%时 ,总采收量最大 ,为 2.11
×1012 cell。对于产率 , 更新率越小 , 产率越大。
10%组产率最高为 4.20×1010 cell/d ,40%组最低 ,
仅为 2.14×1010 cell/d 。在其他条件相同的情况
下 ,产率与平均细胞密度成正比 ,而平均细胞密度
随更新率的减小而增大 ,这一结论决定了这一现
象 。
表 2　不同更新率下细胞总采收量 、产率及代谢产物的均值比较
更新率
%
细胞总采收量
×1012 cell
细胞产率
×1010 cell ·d-1
蛋白质平均含量
mg· L-1
蛋白质
总采收量/m g
多糖平均含量
mg· L-1
多糖总
采收量/mg
10
15
20
30
40
0.97dC±0.09
1.24dC±0.12
1.76cC±0.18
2.10aA ±0.20
1.97bB±0.13
4.20aA ±0.16
3.83bB±0.19
3.35cC±0.13
3.05cC±0.14
2.14dD ±0.10
81aA±12
65bB±14
55cC±11
49cC±10
34dD±8
985±18.34
1392±17.18
1764±17.37
2329±18.54
2168±11.31
59dD ±17
87bB±15
113aA ±14
67cC±12
17eE±18
951±23.01
2082±17.54
3613±25.12
3226±19.45
1068±21.44
注:更新起始密度为 3.80×107 cell/m l.
2.3　更新周期对新月菱形藻生长影响
在更新率试验的基础上 ,选取更新率为 33%,
进行更新周期的半连续培养。从第 6 d开始启动半
连续培养 ,各试验组的生长曲线见图 5 。由图 5可
见 ,不同更新周期下 ,各试验组的细胞密度变化不
尽相同 。各试验组均在更新 5 d 后处于稳定状态 ,
除 1 d组外 ,各试验组更新时的密度均高于起始更
新密度 ,方差分析显示 ,各处理组的平均更新细胞
密度间存在显著差异 。显然 ,更新周期延长 ,藻的
生长时间随之增加 ,因而密度增加;更新周期缩短 ,
248 水　产　科　学 第 28卷
培养基中营养盐过多 ,不能被及时消耗 ,积累的营
养盐对藻生长产生抑制 ,藻密度低 。
图 5　不同更新周期藻细胞生长曲线
2.4　更新周期藻细胞采收量和主要生化组分的影
响
总采收量随更新周期的变化也很大 ,更新周期
越长总采收量越小 ,更新周期为 1 d组显著高于其
他组 ,为 3.12×1012 cell , 2 d 组的次之 , 4 d 与 5 d
　　
组的差异不显著(表 3)。总采收量取决于更新次数
与更新时的藻密度 ,两者存在制约关系 ,由于更新
周期的延长 ,藻密度增大 ,但藻的生长速度显著降
低 。因此 ,更新周期对总采收量的贡献要大得多 ,
故总采收量细胞密度及更新周期间不存在动态平
衡且更新周期越小 ,总采收量越大。
藻液中 NO 3-N 与 PO 4-P 的平均含量见表 3 ,
NO 3-N与 PO 4-P的平均含量随更新周期的延长而
降低。方差分析显示 ,不同更新周期下的 NO 3-N
的含量存在显著差异 ,而 PO 4-P 不明显 ,表明新月
菱形藻对 PO 4-P 的消耗比较快 ,而对 NO 3-N 的消
耗较慢 。
藻内蛋白质与多糖的含量随更新周期的延长
而增加 ,更新周期为 5 d时 ,蛋白质与多糖的含量较
高 ,分别为 224 mg/L 和 241 mg/L ,更新周期为 1 d
时 ,蛋白质与多糖的含量最低 ,分别为 87 mg/ L 与
115 mg/L。
表 3　更新周期对细胞生长 、代谢产物及藻液中 N 、P 的质量浓度影响
更新周期
d
生长速率
d-1
采收量
×1012 cell
产率
×1011 cel l/ d
蛋白质
mg· L -1
多糖
mg· L -1
PO 4-P
mg· L-1
NO 3-N
mg· L -1
1 0.529aA±0.09 3.12aA ±0.12 0.87dD ±0.14 87dD±9 115dD±12 0.096aA ±0.007 0.389 aA±0.014
2 0.260bB±0.13 1.70bB±0.09 0.99dD ±0.08 135cC±11 137cC ±16 0.082bA ±0.012 0.364bB±0.008
3 0.178cC±0.06 1.24cC ±0.10 1.25cC±0.13 186bB±18 172bB±14 0.071bA ±0.008 0.346cB±0.01
4 0.137dD±0.03 0.98dC±0.06 1.69bB±0.11 204aA±13 214bB±18 0.059cB±0.010 0.325dC±0.009
5 0.118eD±0.10 0.86eD ±0.04 3.15aA ±0.07 224aA±10 241aA ±13 0.043cB±0.006 0.308eD±0.011
3　讨论
在光生物反应器培养中 ,在其他条件不受限制
的情况下 ,细胞生长的唯一限制条件是对光能的吸
收和利用。但随着细胞密度的不断增加 ,细胞之间
的相互遮挡使穿透光强迅速衰减 ,且穿透光强仅与
细胞密度有关 ,而与入射光的强度无关[ 10] 。此时更
新培养液 ,可降低藻密度 ,增加光强 ,同时加入的新
鲜培养液 ,可为藻的生长提供良好的环境。
在半连续培养中 ,更新率与更新周期是两个非
常重要的参数 ,它们对细胞的平均密度 、生长速率
及培养体系中的 pH 值都有着不同程度的影响 ,其
中更新率的影响尤为显著。试验表明总采收量同
更新率及平均细胞密度间存在一动态平衡 ,根据采
收量的计算公式 Y =V ×R ×B 分析 ,由于 R 和 B
为负相关 ,因此 ,在半连续培养时均存在一个最适
的更新率 R 值 ,使日平均细胞密度 B 最大 ,从而获
得最大的采收量当更新率低于最适更新率时 ,细胞
增长数量比更新的细胞数量多 ,使细胞密度呈增加
态势 ,反之细胞密度下降 。在本试验条件下 ,最适
更新率为 33%,最大采收量为 2.11×1012 cell ,这与
一些文献报道类似[ 3-4 , 11] ,如在光生物反应器培养小
球藻(Chlorel la),最适更新率为 33%。此外 ,试验
发现总采收量与更新周期及平均细胞密度间未出
现动态平衡 ,可能是更新周期延长 ,生长速率下降 ,
藻生长缓慢 ,更新次数比平均细胞密度对总采收量
的贡献要大得多造成的。
考察培养液中 N 、P 的浓度变化与生化组成的
变化有着重要的意义。在饵料培养中 ,采收液中
N 、P 盐的浓度低 ,可以避免营养盐的浪费 、育苗水
体外放给环境造成富营养化压力;藻体中含有多种
代谢产物(蛋白质 、多糖 、脂肪酸等),它们对提高水
产动物幼体成活率和增强体质有重要作用 。
综合考虑各生长指标 ,在指数生长末期开始更
新 ,更新率为 33%、更新周期为 1 d ,是新月菱形藻
半连续培养的较佳模式。
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Semi-continuous Culture of Alga Nitzschia closterium
in a Flat Plate Photobioreactor
SUN Li-qin , REN Li-hong ,WANG Chang-hai
(Colleg e of Ocean , Yantai Univer sity , Yantai 264005 , China)
Abstract:The marine micro alga Nitzschia closterium was cultured semi-continuously in a flat plate pho to-
bioreactor to study the effect of renew al rate and renew al cycle on cell g row th , cell recovery yield , bio-
chemical components and output rate of biomass.The average g row th rate of cells and the concentrations
of ni t rate and phosphate in the culture medium were found to show a progressive rise w ith the increase in
renew al rate w hile the ave rage cel l densi ty and biomass output rate declined.The to tal recovery yield
show ed a parabolic dist ribution w ith the renew al rates and the maximal recovery y ield of the cel l biomass ,
and levels of po lysaccharide and protein w ere 2.11×1012cell , 3623 mg and 2347 mg at the renew al rate of
33%, 25.2% and 34.7%, respectively.The extension of renew al period led to the decrease in the g row th
and concentrations o f nit rate and pho sphate , but promo ted the cell density , output rate and the product ion
of po lysaccharide and pro tein.The to tal cell recovery yield reduced wi th the increase in the renew al period ,
and the max imal recovery y ield w as achieved a t 3.12×1012 cell at renew al period o f 1 d.In general , the op-
timum renew al condit ion fo r biomass recovery yield w as renew al rate of 33% and renew al period o f 1 d , in-
dicating that the renew al rate and the renew al period are valuable tools in controlling output rate and to tal re-
covery yields of cell biomass and secondary metabolites in semi-continuous culture of marine microalga.
Key words:N itzschia closterium ;pho tobio reacto r;renew al rate;renew al pe riod;semi-continuous culture
(责任编辑:晓　荷)
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