全 文 ：记忆缺失性贝毒软骨藻酸的污染现状及检测技术
王 茜，程金平* ，高利利，董 宇，王文华 (上海交通大学环境科学与工程学院，上海 200240)
摘要 阐述软骨藻酸的主要检测技术———小白鼠生物检测法、高效液相色谱(HPLC)检测法、毛细管电泳检测法、酶联免疫吸附法等方
法，对国内外前沿研究技术和优化过程进行详细说明，总结各种方法的利弊，并对未来软骨藻酸的毒理研究和检测分析进行展望。
关键词 软骨藻酸;贝类;暴露途径;检测技术
中图分类号 X131． 2 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2011)26 －16070 －04
A Review for Hazards and Determination Methods of Amnesic Shellfish Poison———Domoic Acid
WANG Qian et al (Department of Environmental Science and Engineering，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200240)
Abstract The main detective technique such as mouse bioassay，high performance liquid chromatography，capillary electrophoresis，enzyme-
linked immunosorbent assay and so on were analyzed． The new research and optimization process were also mentioned． The studies and methods
were summarized． The development of DA research in the future was also discussed．
Key words Domoic acid;Shellfish;Exposure way;Detective technique
随着赤潮灾害的不断发生，赤潮毒素引起人体中毒事件
在世界沿海地区时有发生。据统计，全世界因赤潮毒素的贝
类中毒事件约 300 多起，死亡 300 多人。近年来，在我国福
建、台湾、香港等地均有赤潮毒素中毒事件的发生［1］。因此，
赤潮藻毒素的污染状况不容小觑。
根据对人类的中毒症状和机制差异，可将赤潮毒素分为
麻痹性贝毒(Paralytic shellfish poisoning，PSP)、腹泻性贝毒
(Diarrhetic shellfish poisoning ，DSP)、记忆缺失性贝毒(Am-
nesia shellfish poisoning ，ASP)、神经性贝毒(Neurotoxic shell-
fish poisoning ，NSP)、西加鱼毒(Ciguatera fish poisoning ，
CFP)［2］、海兔毒素(Aplysia toxins)和前列腺素(Prostaglan-
dins，PGs)。软骨藻酸(Domoic acid，DA)正是记忆缺失性贝
毒(ASP)的主要成分。DA 是由硅藻门(Baciilariophyta)、羽
纹硅藻纲(Pennatae)、管壳缝目(Aulonoraphidinals)、菱形藻
科(Nitzschiaceae)中的拟菱形藻属(Pseudo-nitzschia)和菱形
藻属(Nitzschia)中硅藻的某些种产生的［3］。笔者总结了近年
来软骨藻酸的污染状况和对人类的危害，同时分析软骨藻酸
检测技术。
1 理化性质
DA(分子式 C15H21NO6，分子量 311． 3)是由水中藻类产
生的一种生物毒素，结构与红藻氨酸和谷氨酸相似，是红藻
氨酸受体的兴奋剂［4］。DA纯品为白色固体粉末，熔点为223
～224 ℃，溶于水，微溶于甲醇，在紫外光谱区最大吸收波长
为 242 nm。在体积比为 1∶ 9的乙睛 /水的溶液中，－ 12 ℃黑
暗条件下，DA可 1年左右保持稳定［5］。它有 3 种同分异构
体，分子式如图 1所示。
图 1 DA及其同分异构体分子式
Fig． 1 DA and the formula of its isomeride
基金项目 国家高新技术研究发展计划(863 计划) (2007AA092001-15);
上海科委科技攻关项目(08DZ1206302);海洋赤潮灾害立体监
测技术与应用国家海洋局重点实验室研究基金项目
(MATHAB200917)。
作者简介 王茜(1987 － )，女，河北定州人，硕士研究生，研究方向:赤潮藻
毒素的快速检测。* 通讯作者，副教授，博士，硕士生导师，从事
持久性有毒化学污染物的环境化学行为与生态毒理效应以及污
染物快速监测、预警与风险评价技术、海洋环境等研究，E-mail:
jpcheng@ sjtu． edu． cn。
收稿日期 2011-04-26
2 危害及暴露途径
人体多通过食用贝类、鱼类的途径摄入软骨藻酸的。
人摄入受 DA 污染的贝类时，胃肠黏膜会吸收 DA。纯品
DA也可通过呼吸道、角膜和皮肤直接进入体内，以带电亲水
分子形式分布于血管周围组织中。DA是一种兴奋性神经毒
素，它和作为神经递质的谷氨酸(Glu)一样具有引起神经细胞
兴奋的功能，但其强度比 Glu高 100多倍，比红藻氨酸(KA)高
责任编辑 刘月娟 责任校对 卢瑶安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2011，39(26):16070 － 16073，16136
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2011.26.122
2 ～3倍［5］。DA可通过与谷氨酸机制相同的脑部通路进入脑，
即血脑屏障的高亲和性转运系统进入脑［6］。中毒后，人体会出
现恶心、呕吐、胃炎，严重时可以导致头晕眼花、视觉障碍、记忆
丧失、昏迷等。近些年由于赤潮频发，已在多个地区多种生物
体内检测到软骨藻酸的存在(表 1)。
Vale等通过对葡萄牙贝类的研究发现不同的贝类品种
在不同的时空对于 DA 的生物积累作用也是不同的［14］。其
中，春季捕捞的花蛤(Venerupis)对 DA的生物积累作用最大。
Wekell等于 1991 ～ 1993 年对不同季节的蛤蜊、蛤蜊的组织
进行软骨藻酸含量测定，发现其可食用部分 DA含量在 12月
达到最高，平均可达 106 mg /kg，此后逐渐下降，但在浓度达
到高峰后 16个月，蛤蜊体内的 DA仍不能完全消失;此外，蛤
蜊的各个部位均能检出 DA，其中足部浓度最高，可达 223
mg /kg，虹吸管部位的浓度最低［15］。Lefebvre 等对大马哈鱼
(Oncorhynchus kiautch)体内不同组织的 DA 含量进行了分
析，发现 DA在大马哈鱼的肾和胆中的含量较高［16］。图 2 是
DA在大马哈鱼体内不同组织器官内的分布情况。
表 1 一些受 DA影响的物种及地区
Table 1 Species and regions affected by DA
种类
Types
物种
Species
地区
Areas
鸟类 Birds 褐鹈鹕(Pelicanus occidentalis) 美国加州［7］、墨西哥圣卢卡斯角［8］
勃兰特的鸬鹚(Phalacrocorax penicillatus) 加州中部［7］
海洋哺乳动物 Marine mammals 蓝鲸(Balaenoptera musculus) 美国加州［9］
座头鲸(Megaptera novae) 美国加州［9］
抹香鲸(Kogia sima) 大西洋东南部海岸［10］
宽吻海豚(Delphinus capensis) 墨西哥索诺拉州［11］
鱼类 Fish 金枪鱼(Thunnus alalunga) 美国加州［7］
凤尾鱼(Engraulis mordax) 美国加州［12］
太平洋沙丁鱼(Sardinops sagax) 美国加州［12］
比目鱼(Hippoglossus stenolepis) 美国加州［13］
图 2 DA在大马哈鱼体内的分布情况
Fig． 2 The distribution condition of DA in the body of On-
corhynchus kiautch
人类通过食用海产品摄入 DA，多通过食用贻贝、蛤类在
体内积累。与贝类相比，人类通过食用鱼类而受到的影响较
小［17］。据研究，当人体内 DA含量在 0． 2 ～0． 3 mg /kg(湿重)
时，机体不受影响;当达到 0． 9 ～2． 0 mg /kg(湿重)时，机体会
出现轻度眩晕等症状;当达到 1． 9 ～ 4． 0 mg /kg(湿重)时，机
体会出现方位障碍等症状［18］。
Costa等通过对欧洲食品安全委员会数据的研究，发现
欧洲居民对于贝类的实际消费量比之前研究所得的数据高，
尤其是德国和荷兰，并总结出欧盟主要国家居民对于软骨藻
酸的暴露水平［17］。表 2是欧洲一些国家的贝类消费和人体
积累 DA的情况。
另外，DA具有热稳定性，一般的烹饪过程并不能够破坏
软骨藻酸的毒性。虽然一般家庭的蒸和煮的过程会减少贝
类组织中的 DA含量，但是 DA仍会随烹饪过程进入到烹饪
油中，进而通过消化道进入人体［19］。软骨藻酸作为一类神
经毒素、递质和阻断剂在贝类组织中积累，进而间接地影响
着人类的健康。目前对由 DA 引起的健忘性贝中毒还没有
较好的疗法，仅在小鼠实验中发现用苯二氮草(Diazepan，5
mg /kg)可减少震颤行为，但无法完全恢复受损的海马结构或
空间记忆能力。同时，研究表明软骨藻酸对昆虫有杀灭能
力，其对嶂螂、苍蝇的杀死效果不逊于 r-BHC 等［5］。随着赤
潮发生频率的升高，软骨藻酸对人类的威胁越来越严峻，选
择研发合适的、快速的、简单的、低成本的检测技术已越来越
急迫。
表 2 欧盟贝类平均消费量与人类暴露于 DA的可能性
Table 2 Mean consumption of shellfish and human exposure way in
European
国家
Country(n)
研究人数
Research
population
平均消费
Mean consu-
mption∥g /人
DA含量
DA content
μg /人
人体 DA含量
(湿重)
DA content in
human body
mg /kg
法国 France 218 ～962 10 ～32 200 ～640 0． 003 3 ～0． 010 7
德国 Germany 150 107 2 140 0． 035 7
意大利 Italy 212 47 940 0． 015 7
荷兰 47 136 2 720 0． 045 0
Netherlands
英国 United 212 114 2 280 0． 038 0
Kingdom
3 检测技术
3． 1 小白鼠生物检测法
3． 1． 1 原理。该法是根据美国公职化学家协会(AOAC)所
标定的麻痹性贝中毒(PSP)的小鼠生物分析法加以变化
的［5］，是最早用于 DA检测的一种经典方法。其原理是将毒
素注射入小白鼠体内，根据注射后小鼠的存活时间和中毒症
状来评价毒性，一般用半致死剂量表示［20］。
3． 1． 2 应用。该法更加注重研究 DA的毒性效应和毒理研
究。这是一般其他方法无法取代的，而且采用小白鼠生物检
测法可以检测一些未知的毒性物质，通过半数致死剂量来评
价该物质的毒性效应，因此小白鼠生物检测法目前在各个国
家仍有很广泛的应用。但是，该方法的检出限较高，适用于
1706139 卷 26 期 王 茜等 记忆缺失性贝毒软骨藻酸的污染现状及检测技术
检测贝类组织中高浓度的 DA(300 ～ 1 000 μg /g) ，不适用于
DA含量低于 20 μg /g组织的检测［3］。
3． 2 高效液相色谱法
3． 2． 1 原理。高效液相色谱法能够灵敏、快速、准确地确定
各种毒素成分，被广泛应用于研究和确认试验。贝类样品被
提取后，经浓缩纯化后进行 HPLC 配紫外检测器(HPLC-
UV)、荧光检测器(HPLC-FLD)或质谱仪(HPLC-MS)分析。
很多国家已经把高效液相色谱法列为国标法，例如我国规定
海产品双壳类贝肉、贝柱、外套膜及其制品的记忆丧失性贝
毒软骨藻酸的标准检测方法，检出限为 1． 0 μg，线性范围为 1
～250 μg［21］。
3． 2． 2 应用。高效液相色谱-紫外检测法(HPLC-UV)特别
适用于贝类组织中 DA含量的测定，尤其适用于毒素含量超
过 20μg /g的情况［22］。张一兵等在借鉴国外方法的基础上
应用高效液相色谱-紫外可见检测法(HPLC-UVD)进一步优
化了 DA的高效液相色谱-紫外检测法，选定 pH 2的甲醇 /水
=22∶ 78(V /V)为流动相，LC-SAX作为浓缩纯化柱，检出限为
10 ng，回收率达到 92% ～ 94%［23］。陈西平等应用高效液相
色谱 －二极管阵列检测器法(HPLC-DAD)检测水和水生生
物中的软骨藻酸，回收率达到 70% ～ 93%，检出限为 10
ng［24］。检测结果表明，我国部分海产品中含有 DA，淡水中
未含有 DA。
高效液相色谱 －质谱法(HPLC-MS)法是一种准确度好、
灵敏度高的测定藻毒素的方法。高效液相色谱 － 质谱
(HPLC-MS)联用技术可以不使用衍生试剂和毒素标准品，相
比其他检测器具有很大的优势。然而，该方法对设备条件要
求较高，现阶段还不能大量用于基层的日常监测工作［22］。
Vale等利用 HPLC-MS的方法，以 1 + 1 的甲醇溶液作为洗脱
液，对葡萄牙鱼类和贝类体内的软骨藻酸含量进行测定，结
果表明在春季样品中 DA 含量最高;在分析的众多样品中，
蛤仔和鸟蛤被软骨藻酸污染最为严重，紫贻贝和牡蛎等物种
受污染较轻［25］。陈燕青等利用 HPLC-MS 法测定虾夷扇贝
和长牡蛎中软骨藻酸的残留，样品经浓度 50%甲醇提取，LC-
SAX柱净化，3 ml 0． 1 mol /L 甲酸溶液洗脱，电喷雾离子源
(ESI) ，在正离子、多反应监测方式(MRM)模式下进行定性
与定量，该方法的检出限达 0． 01 μg /g，线性范围为 0． 02 ～
10． 00 μg /g［26］。
高效液相色谱-荧光法具有更高的灵敏度，将荧光基团
连接到 DA 上进而使用荧光检测器检测，检出限可达到
pg /ml。Maroulisb等利用柱后衍生法测定 DA，加入4-氯-7-硝
基-2，1，3-苯并氧杂恶二唑(NBD-Cl)与 DA上的氨基反应生
成荧光基团，提高了荧光检测检测器(FLD)的灵敏度，荧光
检测器激发波长设为 469 和 529 nm，检出限低至 25
μg /kg［27］。但是，HPLC-FLD检测法的衍生剂价格昂贵，设备
操作复杂，因此 HPLC-FLD荧光法的应用并不是很广泛。
3． 3 酶联免疫吸附法(ELISA)
3． 3． 1 原理。酶联免疫吸附试验即 ELISA，是一种常用的固
相酶免疫测定方法。Engvall和 Perlmann于 1971年最先应用
该法进行 IgG定量测定，并命名为 Enzyme linked immunosor-
bent assay (ELISA)。由于 ELISA方法灵敏，特异性强不需要
特殊设备，被广泛应用于各种抗原和抗体测定［28］。将 ELISA
应用于 DA的检测中，利用原 －抗体反应，采用特异性贝类
毒素的抗体来检测 DA。
3． 3． 2 建立、优化与应用。Newsome等开发了 DA的 ELISA
方法，并成功检测尿样和血液中的 DA 含量，工作曲线的范
围为 150 ～1 200 ng /ml，并验证 ELISA 方法是检测 DA 的一
种灵敏度非常高的方法［29］。YU 等制备了 DA 的多克隆抗
体，并继续优化了直接竞争 ELISA方法，使检出限降至 0． 02
ng /ml，并对台湾的贝类产品进行了检测，结果表明贝类产品
中的 DA含量在安全范围内［30］。Smith等对间接竞争 ELISA
法和高效液相色谱法(HPLC)2 种方法进行了对比［31］。
ELISA方法比高效液相色谱法有更低的检出限，线性相关系
数(r)达到了 0． 96。Garthwaite 等成功制备了 DA 多克隆抗
体，利用间接竞争 ELISA 的方法即抗体、抗原和二抗之间的
竞争反应来定量测定 DA的含量，并对海水、海产品中的 DA
进行了检测，检出限为 0． 15 ng /ml，线性范围为 0． 15 ～ 15
ng /ml，优化了 ELISA方法的检出限和线性范围［32］。许道艳
等通过免疫小鼠得到多克隆抗体，利用抗体抗原的反应建立
了间接竞争 ELISA 方法，检出限为 10 μg /L，与 HPLC 检测
结果的相关度达到 0． 992 1［33］。
随着科技的发展，现有的多克隆抗体逐渐被特异性更好
的单克隆抗体取代，单克隆抗体在 ELISA方法的应用大大地
提高了 ELISA方法的特异性和灵敏度。Kawatsu等首次采用
单克隆抗体制备技术，建立检测 DA 的间接竞争 ELISA 法，
检测限低至 0． 15 ～ 10． 00 ng /ml［34］。国内方面，高利利等利
用杂交瘤细胞融合技术成功制备了能稳定分泌抗软骨藻酸
单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并通过体内诱生腹水并纯化
后，得到效价为 1∶ 64 000 的单克隆抗体，为进一步开发软骨
藻酸快速检测 ELISA试剂盒奠定基础［35］。
3． 4 毛细管电泳法(CE)
3． 4． 1 原理。毛细管电泳技术是近年发展起来的一项新型
分析技术，兼有电泳和色谱技术的双重优点，以毛细管为分
离通道，以高压直流电场为驱动力，以样品的多种特性(电荷
大小、等电点、极性、亲和行为、各组分之间淌度、相分配特性
等)为依据的液相分离分析技术［36］。
3． 4． 2 应用。Zhao等建立毛细管电泳—紫外检测法用于检
测贻贝、缢蛏、凤尾鱼等样品，最低能检出 150 ng /g DA［37］。
卫峰等利用毛细管电泳法分析了贝类样品中的 DA，检出限
达到 0． 034 μg /g［38］。
3． 5 其他 此外，还有很多检测 DA的方法，例如薄层色谱
法(TLC)、生物传感器法等。但是，薄层色谱法、生物传感器
法等灵敏度和准确度远远不及色谱法，所以应用不及色谱法
和免疫学方法广泛。
4 DA主要检测方法的比较
4． 1 小白鼠生物检测法 小白鼠生物检测法方法的各项特
性指标为:检出限 300 ～ 1 000 μg /g，检测周期大于 24 h，特
异性较差，干扰因素较多，样品处理为粗略提取，样品批次
单一［3，22，39 －40］。
小白鼠生物检测法检测 DA是最早使用的一种方法，但
是其试验结果受外部影响因素较为复杂，试验结果与小白鼠
27061 安徽农业科学 2011年
的品系和试验者本身操作有很大关系，并且小白鼠生物检测
法一般要有至少 1 d的检测周期，该方法的检出限较低。此
外，小白鼠生物法仅能测定毒性的大小，无法确定毒素的组
成和各成分的含量。小白鼠生物检测法最大的局限性是小
鼠本身造成结果的高变异性和低敏感性，而且对鼠种的要求
较高。所以，急需开发更加先进的、快速的、准确的、定量的
仪器分析方法。
4． 2 高效液相色谱法 高效液相色谱法是目前化学分析较
为常用的方法。高效液相色谱法检出限低，方法成熟，但仪
器昂贵、笨重，一次只能测定一个样品，不适合快速现场检
测。高效液相色谱法的各项特征指标［23，27，41 －42］见表 3。
4． 3 酶联免疫吸附法 ELISA法是近些年来利用抗体抗原
的特异性反应来检测污染物的一种新兴技术。抗体抗原反
应灵敏、特异性高，所以 ELISA法的检出限非常低，检测时间
短，但是该方法干扰因素很多，贝类或藻类样品的提取纯化
工作比较复杂。该方法一次可以测定多组样品，检测周期较
短。ELISA法的各项特征指标［30，32，34，40，43 －44］见表 4。ELISA
法近些年的发展非常迅速，国外已经有商业化软骨藻酸
ELISA试剂盒，而我国目前在这方面的研究并不充分，需要
进一步的发展。
表 3 HPLC及其各种方法的各项特征
Table 3 HPLC and each characteristic of every method
方法
Methods
检出限
Detect limit
μg /kg
检测周期
Detect cycle
特异性
Specificity
干扰因素
Interference
factors
样品处理
Sample
handling
样品批次
Sample
batch
HPLC-UV 125 ～200 三者检测时间大致相同， 较高 少 提取纯化 单一
HPLC-MS 10 单样 15 min，但需要较 较高 较少 提取纯化 单一
HPLC-FLD 25 为复杂的仪器调试 较高 较多 提取纯化 单一
表 4 竞争 ELISA法的各项特征
Table 4 Each characteristic of competition ELISA method
方法
Methods
检出限
Detect limit
μg /kg
检测周期
Detect cycle∥h
特异性
Specificity
干扰因素
Interference
factors
样品处理
Sample
handling
样品批次
Sample
batch
多克隆抗体直接竞争 0． 02 ～0． 10 1． 5 较高 较多 提取纯化 多批次
Direct competition
of polyclonal antibody
多克隆抗体间接竞争 0． 15 2． 5 较高 较多 提取纯化 多批次
Indirect competition
of polyclonal antibody
单克隆抗体间接竞争 0． 15 2． 5 较高 较多 提取纯化 多批次
Indirect competition
of monoclonal antibody
5 结语
自 1987年加拿大爱德华王子岛的东海岸爆发食用被软
骨藻酸污染的紫贻贝引起人类中毒死亡事件以来，软骨藻酸
的污染范围已经扩展到美国、欧洲等地。我国目前还未发现
软骨藻酸中毒事件，但是近年来近海海域赤潮频发，环境急
剧恶化，软骨藻酸污染情况不容忽视。我国对于记忆缺失性
贝毒及相应的藻类种属的研究报道不多，对产生机制和毒性
作用机制的研究也较少。这是我国研究的薄弱环节。
小白鼠生物检测法是较经典的方法。由于周期长，检出
限低，该方法已经被慢慢淘汰，但是在毒理研究方面小白鼠
生物检测法仍然有着不可替代的作用。HPLC 是至今检测
DA最为成熟的技术，检出限可以达到 25 μg /kg，对于样品的
测定较稳定，受操作和周围因素影响较小，但是 HPLC 在测
定效率、测定批量和成本方面等方面不具有优势。而免疫学
方法耗时短，直接竞争 ELISA试剂盒的测定时间可以缩短1．
5 h，灵敏度高，能够达到非常精准的 ng级，并且携带方便，适
于现场监测，已经越来越受到关注。但是，ELISA法不稳定，
抗体抗原易变质也是亟待解决的问题，因此需要继续研究比
较稳定的抗体、抗原保护液以及较好的保存方法，尽量使用
洗板机等自动化仪器，减少外界对实验过程的影响。
目前快速的免疫试剂盒等技术的研发越来越火热。国
外已有报道研制了线性范围较好的试剂盒，并成功地应用于
检测海产品 DA 的含量［44］。国内目前还没有商业化的 DA
ELISA试剂盒。在 DA的毒性作用机制和机理研究方面，国
内外已经有所开展，但是主要停留在小鼠试验层面，目前仍
没有行而有效的治疗人类 DA中毒的方法，因此在加强检测
技术方面的研究的同时，还要继续加深 DA毒理作用方面的
研究。
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63161 安徽农业科学 2011 年