全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOG ICA SIN ICA　35(1):19-23(2005)
收稿日期: 2003-12-02;修回日期: 2004-07-12
基金项目:国家自然科学基金资助项目 (30260064);云南省自然科学基金资助项目(2000C0014Q)
通讯作者:陈海如 ,教授 ,主要从事植物病理学研究。
第一作者:蔡 红(1972 -),女 ,云南昆明人 ,副教授 ,在读博士 ,主要从事植物病毒病及类似病害研究;E-mail:caihong0623@126. com。
黄槐丛枝病植原体的检测及鉴定
蔡 红 1 , 李小林2 , 孔宝华1 , 陈海如 1*
(1云南农业大学, 云南省植物病理重点实验室 , 昆明 650201;2云南省农科院农作物原种繁育中心 , 昆明 650205)
摘要:应用植原体 16S rRNA基因通用引物 , 对自然表现丛枝的黄槐植株进行巢式 PCR检测 , 得到约 1.2 kb的特异片段 ,
证明此植株中存在植原体。将此特异片段与 pGEM-T E asy载体连接并转化到大肠杆菌 JM 109感受态细胞中 , 通过 PCR鉴
定 、序列测定及同源性比较分析 , 结果表明此植原体株系(STWB)16S rDNA片段 G +C含量为 45. 8%,与榆树黄化植原体
组(E lm ye llows group, 16S rV group)中的各株系最高同源率可达 99.4%, 而与其它组中的株系明显低于 97. 0%, 故认为该
植原体株系为榆树黄化植原体组中的成员之一。
关键词:黄槐;丛枝;16S rDNA序列;植原体;榆树黄化
Detection and iden tification of phytop lasm a associationw ith sunshine treew itches-
broom　CAIHong1 , LI X iao-lin2 , KONG Bao-hua1 , CHEN Ha i-ru1　(1K ey Laboratory for P lan t Pathology of
Y unnan P rovince, Y unnan Agr icultural University, Kunm ing 650201, Ch ina;2A gr .i C rops Seeds P roduc tion Center, Yunnan
A cadem y ofA gr.i Sc ience, Kunm ing 650205, China)
Abstract:Un iversal prim ers for 16S rRNA gene was used to detect phytoplasmas in sunsh ine tree(Cassia su-
rattensis)show ingw itches-broom symptom. A 1. 2 kbDNA fragm ent was am plified by nested-PCR. The re-
sult indicated existence of phytoplasm a associated w ith th is diseased plan.t The amplified fragm en twas ligated
in to pGEM-T easy vector and transform ed into the com pe tent ce ll ofE. coli JM109 strain. C loned DNA frag-
ments were verified by PCR , sequenc ing and phy logene tic ana lysis. The results showed that the con tent ofG +
C in the sequenced 16S rDNA was 45. 8%. This stra in (STWB) shared highest homology (99. 4%) with
phytoplasm a stra ins in E lm yellows (16SrV group) but is obviously under 97. 0% w ith other groups. So the
results m ade it clear tha t this phytoplasm a stra in is one of them embers of E lm yellows phytoplasm a group.
Keywords:sunsh ine tree;w itches-broom;16S rDNA sequences;phytoplasm a;E lm ye llows
中图分类号:S763. 722. 6　　　文献标识码:A　　　文章编号:0412-0914(2005)01-0019-05
　　黄槐(Cassia surattensis Burm. ,英文名为 sun-
sh ine tree),也称为美国槐或黄花槐 ,属苏木科落叶
乔木 ,由于其花色鲜艳 、花期较长 ,常作为工厂 、校
园或城市道路绿化的观花树种 。
植原体 (phytoplasma)(原称类菌原体 myco-
p lasm a-like organ ism ,MLO)是一类无细胞壁 ,不能
人工培养的 ,存在于植物韧皮部筛管细胞中的类似
植物病原细菌的原核生物 。迄今为止 ,世界上报道
的植物植原体病害达 300多种[ 1] ,在我国报道的有
74种 [ 2] ,其引起的主要症状包括丛枝 、黄化 、花变
叶 、花器退化等 ,严重时引起植株提早衰老 ,直至整
个植株枯死 。
近 10年来 , PCR技术使植原体检测与分类取
得了令人瞩目的进展 [ 3] 。对植原体 16S rRNA的
DOI牶牨牥牣牨牫牴牪牰牤j牣cnki牣apps牣牪牥牥牭牣牥牨牣牥牥牬
分析使人们从遗传本质上认识到了植原体与其它
原核微生物间的差异 ,同时也使人们对植原体的检
测达到了单拷贝基因检测的水平 [ 1] 。为证明采集
到的表现典型丛枝症状的黄槐植株是否为植原体
引起 ,应用 PCR技术及对扩增片段的克隆 、序列分
析 ,对该病的病原进行了检测鉴定。
1　材料与方法
1.1　材料
黄槐丛枝病植株采自云南省昆明市。泡桐丛
枝病阳性对照 、E. coli JM109菌株为本实验室保
存 。质粒 pGEM-T Easy Vector试剂盒为 Prom ega
公司产品。
1.2　植株总 DNA的提取
植株总 DNA提取方法参照 Ahrens等 [ 4]的方
法进行 ,最后于 - 20℃冰箱中保存备用。
1.3　引物及 PCR反应条件
参照 Lee[ 5, 6]所报道的植原体 16S rRNA基因
通用引物对 R16mF2 /R16mR1 序列和 R16F2 /
R16R2序列合成引物 (预期扩增片段分别为 1.5
和 1.2 kb)。反应体系为 25μL ,含有 1 ×PCR
Buffer, 200 μmol /L dNTP, 2.0 mmol /L Mg2+, 0.6
μmo l/L引物 (R16mF2 /R16mR1), 2.5 U Taq酶 ,
25 ng模板 DNA。反应循环为 95℃预变性 5 m in,
95℃变性 30 s, 55℃退火 1 m in , 72℃延伸 90 s,共
35个循环 ,最后于 72℃保温 10m in。然后将此直
接 PCR产物按 1∶20比例稀释后 ,作为反应模板 ,
以 R16F2 /R16R2为扩增引物 , 退火温度升高至
60℃,进行巢式 PCR扩增 (其余反应条件同直接
PCR)。最后分别取 10μL PCR产物在 1%琼脂糖
凝胶中电泳 ,经溴化乙锭染色后 ,在紫外透射台上
观察。
1.4　PCR产物纯化 、克隆及序列测定
PCR产物纯化采用 H igh Pure PCR Product
PurificationK it(BoehringerM annheim公司),具体
操作过程参照试剂说明书进行。感受态细胞制备
采用 Cohen等的氯化钙法 [ 7] 。纯化后的 PCR产物
与 pGEM-T EasyVector于 4℃连接过夜 。将连接
产物加到 200 μLE .coli JM109感受态细胞中 ,冰
浴 30 m in, 42℃水浴热击 90 s,冰浴 2 m in ,加入
700 μL LB液体培养基 , 37℃, 220 r /m in, 轻摇
30 ～ 40m in,菌液 3 000 r /m in,离心 5 m in,留沉淀
及少量上清 ,混匀 ,涂布于含 50m g /mLAmp的 X-
ga l筛选平板上 , 倒置培养皿于 37℃培养 12 ～
16 h。挑选筛选平板上的白色菌落 ,采用碱裂解法
提取少量重组质粒 DNA[ 8] ,经 PCR鉴定后随机筛
选出含有正确插入片段的重组克隆送上海基康生
物技术有限公司进行序列测定 。
1.5　序列同源性比较
根据 Lee等 [ 9] 1998年重新修订的植原体新的
分类体系 ,通过软件 (DNAMAN , Version 4.0),将
测定到的序列与植原体 16Sr各组中的代表性植原
体的 16S rRNA基因全长或近全长序列进行比较。
2　结果与分析
2.1　感病植株的症状表现
在植株的一个生长点处长出许多幼嫩枝条 ,呈
明显的丛枝状 ,叶片较健康植株叶片小(图 1)。
Fig.1　Symptom of sunshine treew itches-
broom
2.2　PCR扩增及重组质粒鉴定结果
巢式 PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测 ,
分别得到约 1.2 kb的特异片段 (图 2),大小与引
物设计相符 ,以泡桐丛枝为阳性对照的扩增产物中
也出现了相同大小的扩增条带 ,说明自然表现丛枝
症状的黄槐植株中存在植原体 ,将此植原体株系命
20 植物病理学报 35卷
Fig.2　Resu lt of nested-PCR amp lification
M:Marke r; 1: H ealthy sunsh ine tree; 2: Paulown ia
w itches-broom;3, 4:Sunsh ine tree w itches-broom (To ta l
DNA extracted from phloem tissue and younger leaves, re-
spec tive ly)
名为 STWB。重组质粒经 PCR扩增后均得到与植
株总 DNA扩增片段大小相同的产物 ,说明重组子
中均含有目的外源片段。
2.3　序列测定及同源性比较结果
对含有目的外源片段的重组质粒(STWB-22)
序列测定结果表明该植原体株系 16S rDNA长
1 250 bp(GenBank登录号为 AY283184), G +C
含量为 45.8%;经序列同源性比较分析 ,该株系与
其它各组植原体 16S rRNA基因序列同源关系存
在较大差异 (表 1),其中与植原体 16SrV组中的各
株系同源率均达到 98.4%以上 ,而与其它组的株
系明显低于 97.0%;根据序列同源关系矩阵图得
到的 19种植原体 16S rDNA系统分类树状图 (图
3)也可看出:黄槐丛枝与属于植原体 16SrV 组中
的各株系均属于同一进化枝 ,并且所有的植原体株
系均与莱氏不需固醇菌原体(A . laid law ii)有较近
的亲缘关系 ,而与半柱支原体 (M . capricolum )的
亲缘关系较 A . laidlaw ii远 。
Tab le 1　Homo logy of STWB 16S rDNA nuc leotide sequence and other phytop lasmas
G roup and (or) subgroup　 Phytoplasm as　　 G enBank access ion No. H omo logy
re la tionship(%)
16S r I Southe rn aste r yellows, SAY M 86340 84. 3
16S r II Peanut w itches-broom, PnWB L33765 83. 6
16S r III Peach western-X d isease,WX L04682 93. 6
16S r IV Coconut lethal ye llow ing, CLY U18747 95. 1
16S r V-A ( rp-A) E lm ye llow s, EY1 L33763 98. 7
16S rV-A E lm w itches-broom, ULW X68376 98. 8
16S rV-B ( rp-B) Che rry le thal yellows, CLY AY197659 99. 4
16S rV-B ( rp-C) Jujube w itches-broom , JW B AY197661 99. 4
16S rV-C A lde r yellows, ALY Y16387 98. 7
16S rV-C Rubus stunt, RuS Y16395 98. 5
16Sr V-C (rp-D) F lavescence doree, FD X76560 98. 4
16S rV I C lover prolifera tion, CP L33761 96. 4
16Sr V II Ash yellows, A shY X68339 96. 2
16S rV III Loofah w itches-broom, L fWB L33764 95. 4
16S r IX P igeon pea w itches-broom , PPWB U18763 93. 8
16Sr X App le pro liferation, A P X68375 82. 0
16S rX I R ice yellows dw arf, RYD D12581 94. 5
16Sr X II S tolbur of peppe r, STOL X76427 83. 2
211期 蔡 红 , 等:黄槐丛枝病植原体的检测及鉴定
Fig.3　Dend rogram of 16S rDNA nucleo tide
sequences analysis from 19 phyto-
p lasm a strains
3　讨论
16S rRNA是原核生物染色体基因组中的一种
rRNA编码区序列 ,在进化中高度保守 ,常作为原
核生物系统发育及分类研究的标准方法 [ 10] 。基于
这一方法 , Lee等[ 9]根据植原体 16S rDNA的全长
或近全长序列以及 16S rRNA基因 PCR扩增产物
的 RFLP分析 ,形成了一个包括 14个组及 41个亚
组的分类系统;Seem üller等[ 11]综合分析了植原体
16S rRNA基因全长或近全长序列 、16S ～ 23S间隔
区序列以及 PCR扩增 rDNA 产物的 RFLP分析
后 ,形成了一个包括 20个组的植原体分类体系。
文中提到的榆树黄化组(E lm ye llows group),即植
原体 16SrV组 ,均存在于上述 2个分类体系中。
本文根据植原体 16S rRNA基因 PCR扩增结
果及 16S rRNA基因近全长序列分析检测 、鉴定的
黄槐丛枝植原体株系 ,在上述 2个分类系统中均没
有提及 ,是在黄槐这一寄主植物上首次报道的植原
体病害 。
Seemü ller等[ 11]和 Lee等[ 9, 12]认为植原体病害
虽发生在世界各地 ,但不同组及亚组的植原体在分
布上存在明显的地区差异 ,如 16SrV-A 主要发生
在北美国家 , 16SrV-C主要发生在欧洲 ,而 16SrV-
B主要发生在亚洲。从表 1中可看出 , 黄槐丛枝
(STWB)与樱桃致死黄化 (CLY)及枣疯病(JWB)
植原体的 16S rDNA序列同源性最高 ,而 CLY及
JW B均是 2个发生在中国的植原体病害 [ 13, 14] ,本
文的实验结果符合这一结论且可认为 STWB属于
榆树黄化植原体组 B亚组 ,即 16SrV-B。
致谢:云南农业大学 99级植保专业本科生卯梅
华 、张宇 、张建洲同学及 99级生物技术专业
本科生杨凡 、李薇同学参加该论文实验工
作 ,在此表示感谢。
参考文献
[ 1] 　邱人璋 , 叶莹. 植物病毒与类似病毒研讨会专刊
[M ] . 台湾:行政院农业委员会 , 1993. 29 -42.
[ 2] 　蒯元璋 ,张仲凯 , 陈海如. 我国植物支原体类病害的
种类 [ J] . 云南农业大学学报 , 2000, 15(2):153
-160.
[ 3] 　Seemü lle r E, Schne ider B, M aürer R, e t al. Phylogene-
tic class if ica tion of phytopathogenic mo llicutes by se-
quence ana lysis of 16S ribosoma l DNA [ J] . In terna-
tiona l Journal of Sys tema tic Bacteriology, 1994, 44
(7):440 - 446.
[ 4] 　Ahrens U, Seemü ller E. D etec tion of DNA of plant
pa thogen ic mycop lasm alike organ isms by a polym erase
cha in reaction tha t amplifies a sequence of the 16S
rRNA gene[ J] . Phytopathology, 1992, 82:828 -832.
[ 5] 　Lee IM , H ammond R W , D av is R E, et a l. Unive rsal
amp lif ica tion and analys is of pathogen 16S rRNA for
class ifica tion and identification of mycoplasma like or-
ganisms[ J] . Phy topa thology, 1993, 83:834 - 842.
[ 6] 　Lee IM , D av is R E, S inc lairW A. G ene tic rela tedness
ofmycoplasma like organ ism a de tected in U lm us spp.
in the United S tates and Ita ly bymeans ofDNA probes
and polym erase cha in reac tions[ J] . Phytopatho logy,
1993, 83:829 - 833.
[ 7] 　Cohen S N , Chang A C Y, H su L. Nonchromosom al
an tibio tic resistance in bac te ria:gene tic transforma tion
ofEscherichia co li by R-fac tor DNA[ J] . P roc. N at.l
Acad. Sc.i , 1972, 69:2110.
[ 8] 　李德葆 , 周雪平 , 许建平 , 等. 基因工程操作技术
[M ] . 上海:上海科学技术出版社 , 1996.
[ 9] 　Lee IM , G undersen-Rindal D E, D avis R E , et al. R e-
vised c lassification scheme of phytoplasm as based on
RFLP ana lyses of 16S rRNA and r ibosom al prote in
gene sequences[ J] . Interna tional Journa l of Systema tic
22 植物病理学报 35卷
Bac teriology, 1998, 48:1153 -1169.
[ 10] L im P O , Sea rs B B. 16S rRNA sequence ind ica tes
tha t plan t-pathogenic m ycop lasm alike organisms are
evolu tionarily d istinc t from an im al m ycop lasm as[ J] .
Journal of Bacter iology, 1989, 171:5901 - 5906.
[ 11] Seemü ller E, Marcone C, Lauer U, et al. Current status
of molecu la r c lassification of the phytoplasm as[ J] .
Journal of P lant Patho logy, 1998, 80 (1):3 -26.
[ 12] Lee I M , D avis R E, Gunde rsen D D. Phytoplasm as:
phytopathogenicmo llicutes[ J] . A nnua lReview ofM i-
crob iology, 2000, 54:221 - 225.
[ 13] Lee IM, Zhu S F, G undersen D E, e t a l. D etection and
identification of a new phy top lasm a assoc ia ted w ith
cherry le tha l yellow s in Ch ina[ J] . Phytopatho logy,
1995, 85:1179.
[ 14] Zhu S F, Lee IM , G undersen D E, et al. Phytop lasm as
assoc ia ted w ith che rry letha l yellows and ju jube
w itches-broom in Ch ina represen t a new Cand idatus
subspecies level taxon[ J] . IOM Le tters, 1996, 4:218.
责任编辑:杨晓昱
231期 蔡 红 , 等:黄槐丛枝病植原体的检测及鉴定