全 文 ：中国环境科学 2005,25(4)：408~411 China Environmental Science

不同氮浓度对绿球藻生长及生理特性的影响

邱昌恩 1,2,况琪军 1,刘国祥 1,胡征宇 1* (1.中国科学院水生生物研究所,湖北 武汉 430072；2.中国科学院研究生
院,北京 100039)

摘要：采用藻类生物测试标准方法研究了不同氮浓度条件下绿球藻(Chlorococcum sp.)的生长及生理变化.结果表明,相对 BG11(1.500g/L N)
培养基,低 N条件下(0.015,0.150g/L)绿球藻生长较好,对 N的吸收率高达 85%以上;高 N条件下(4.500~30.000g/L)被试藻类生长减缓甚至停
滞,但对 N的吸收率仍达 70%~80%.当 N浓度＞4.500g/L时,绿球藻 Chl-a+Chl-b的含量呈逐渐减少趋势;当 N浓度＞1.500g/L,绿球藻硝酸
还原酶(NR)活性、丙二醛(MDA)含量、过氧化氢酶(CAT)活性随 N浓度的增大而逐渐提高;当 N浓度≥4.500g/L时,过氧化物酶(POD)活性
显著提高.绿球藻在 N浓度 1.500~15.000g/L范围内能维持一定的生长,其生理响应机制是由于利用氮源的酶 NR的活性和防止细胞过氧化
的酶 POD和 CAT的活性提高所致.
关键词：绿球藻；氮浓度；生长；生理特性
中图分类号：X172 文献标识码：A 文章编号：1000-6923(2005)04-0408-04

Influence of different nitrogen concentrations on the growth and physiological characteristics of Chlorococcum sp..
QIU Chang-en1,2, KUANG Qi-jun1, LIU Guo-xiang1, HU Zheng-yu1* (1.Institute of Hydrobiology,Chinese Academy of
Sciences, WuHan 430072, China；2.Graduate School of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100039, China). China
Environmental Science, 2005,25(4)：408~411
Abstract：The growth and physiological change of Chlorococcum sp. under different nitrogen concentrations were studied
adopting the standard method of algal bioassay. Compared with BG11(1.500g/L N) medium, Chlorococcum sp. grew
better and had high N absorptivity reaching above 85% under low N condition (0.015, 0.150g/L); under high N condition
(4.500~30.000g/L N), the growth slowed down and even ceased, but the nitrogen absorptivity still reached 70%~80%. The
contents of Chlorococcum sp. Chl-a+Chl-b tended to decrease gradually when N concentration >4.500g/L; when N
concentration >1.500g/L, Chlorococcum sp. nitrate reductase (NR) activity, malondiadehyde (MDA) content and catalase
(CAT) activity increased gradually with the increase of N concentration. Peroxidase (POD) activity increased markedly
when N concentration ≥4.500g/L. Chlorococcum sp. could maintain definite growth in concentration range of
1.500~15.000g/L N; and its physiological response mechanism was due to the enhancing of enzymic activity of NR of
nitrogen source and acsiding activity enhancement of cell peroxidized enzymes POD and CAT.
Key words：Chlorococcum sp.；nitrogen concentration；growth；physiological characteristics

近 20 年来,利用微藻处理污水的研究,已受
到国内外的广泛关注[1-4].马金才等[5]应用悬浮培
养的螺旋藻对工业废水中 N、P 进行处理,李贺
等[6]应用固定化小球藻处理市政污水等,均获得
明显的处理效果.为筛选一种耐污性强,对 N、P
的吸收效率高且易于培养的藻类,并使其在污水
处理中发挥作用,作者从美国一家污水处理厂的
污水中分离纯化了 1 种绿球藻,以期在完全了解
其生长和生理生化特性后,再对其进行污水处理
效果研究.
1 材料与方法
1.1 试验藻种
绿球藻 Chlorococcum sp.采自美国亚里桑那
州一家污水处理厂,应用微藻分离纯化方法,用
BG11 琼脂培养基分离纯化后保种培养.在无菌
条件下,将琼脂培养基上的单个藻落转接到 BG11

收稿日期：2004-10-10
基金项目：国家“863”项目(2002AA601021);国家“973”项目
(2002CB412309)
* 责任作者, 研究员, huzy@ihb.ac.cn
4期 邱昌恩等：不同氮浓度对绿球藻生长及生理特性的影响 409
液体培养基中,置于 LRH-250-G光照培养箱中培
养,在获得足够藻液后用于试验.
1.2 氮浓度设置
以 BG110(无氮培养基)为基本培养基,灭过
菌的 300g/L NaNO3为母液,配制成 0.015, 0.150,
1.500(BG11培养基),4.500,15.000,30.000g/L氮浓
度处理.每个浓度组 3个重复,均用 250mL锥形瓶
盛装培养液,配后体积 150mL.设一个 BG11培养
基配成 20g/L NaCl浓度组作参照.
取适量液体藻种在 4000r/min 离心 10min,
用 15mg/L NaHCO3悬浮洗涤 2次,然后对每个实
验组进行等量接种后,置于上述光照培养箱中培
养.培养温度 25±1℃,光照 35~40µmol/(m⋅s),光暗
周期 14h:10h,光照时每天定时摇动 4次.
1.3 生长测定和比增长率(µ)计算
10d内,每隔 48h,用 SHIMADZU UV-1601分
光光度计在 660nm波长处测 1 次藻液的吸光值
(OD).用细胞个数与光密度之间的线性回归方程
计算细胞密度.以公式µ = (logN-logN0)/t计算比
生长率,式中µ为比生长率;N0,N 表示培养物生长
计时起始和结束时的藻类生物量即光密度;t 为
结束与起始时间差(d).
1.4 叶绿素含量测定
培养 8d 时,每个处理取藻液 2mL,4000r/min
离心 10min,去除培养液,藻体用 80%丙酮提取 2
次,每次 24h.采用文献[7]方法测叶绿素含量.每
组 2个重复.
1.5 硝酸还原酶(NR)活性测定
培养 10d 后,每组 2 个重复,将培养藻液用
0.45µm 微孔滤膜进行抽滤,得藻体,用分析天平
称鲜重,用液氮法研磨提取 NR,定容提取酶液
10mL.然后进行 NR 活性测定[7],NR 酶活性以
30min内,NO2-增加 1µg为 1个酶活力单位(U).
1.6 总氮含量测定
每个处理培养 6d 后,每组 2 个重复,每个取
5mL 藻液,在 4000r/min 离心 10min,取上清液进
行总氮含量测定,采用碱性过硫酸钾消解紫外分
光亮度法[8]测定.用培养起始氮量减去测定氮量,
计算每个处理氮吸收率.
1.7 丙二醛(MDA)、过氧化物酶(POD)、过氧
化氢酶(CAT)的提取和测定
培养 10d 后,每组 2 个重复,将培养液用
0.45µm 微孔滤膜进行抽滤,得藻体,用分析天平
称鲜重,采用文献[7]的提取方法配制提取液,用
液氮法研磨提取,得提取液25mL,用来进行MDA
含量及 POD,CAT活性测定.MDA含量参照文献
[7]方法测定.POD,CAT 活性参照文献[9]方法测
定.POD酶活性以每 min内 A470变化 0.01为 1
个酶活力单位(U),CAT 酶活性用每 min 内分解
H2O21mg为 1个酶活力单位(U).
2 结果与分析
2.1 不同 N浓度对绿球藻生长的影响
从表 1可见,用 BG11培养基(1.500g/L N)作
参照,绿球藻在低N浓度下生长较好(0.015g/L和
0.150g/L),最大生长速率均出现在第 4d;在高 N
条件下,最大生长速率均出现在第 2d, 4.500g/L N
和 15.000g/L N条件下生长缓慢,但在 30.000g/L
N 下,2d 后出现生长停滞甚至负生长. 20.000g/L
NaCl下培养 2d后,藻的生长停止.

表 1 不同 N浓度下绿球藻比生长速率的变化
Table 1 The variation of specific growth rate of
Chlorococcum sp. under different nitrogen
concentrations
N浓度(g/L) 时间
(d) 0.015 0.150 1.500 4.500 15.000 30.000
20g/L NaCl
2 0.104 0.097 0.033 0.053 0.038 0.031 0.079
4 0.153 0.100 0.024 0.010 0.008 -0.016 0.004
6 0.049 0.057 0.034 0.006 -0.011 -0.013 0.000
8 0.019 0.048 0.050 0.013 0.018 -0.005 0.000
10 0.023 0.042 0.008 0.004 -0.004 -0.009 -0.006

2.2 不同 N 浓度下叶绿素含量和硝酸还原酶
(NR)活性的变化
不同N浓度培养的绿球藻,Chl-a和Chl-b含
量在 0.015,0.150,1.500,4.500g/L N条件下基本相
当 ;但在 15.000,30.000g/L N 条件下 ,Chl-a 和
Chl-b含量逐渐减少,20g/L NaCl条件下叶绿素 a
和 b含量也减少(表 2).从表 2还可看出,培养基中
410 中 国 环 境 科 学 25卷
N浓度对绿球藻NR活性有影响,1.500g/L N浓度
开始诱导 NR产生并使酶活力增高,随 N浓度增
大,绿球藻 NR 活性逐渐增高,到 30.000g/L N
时,NR 活性不再增高.20g/L NaCl 培养的绿球藻
NR 活性与 BG11(1.500g/L)培养基相当 ,说明
NaCl对 NR活性无影响.

表 2 不同 N浓度下藻的绿球藻叶绿素含量和
NR活性的变化
Table 2 The content of chlorophyll and nitrate reductase
activity of Chlorococcum sp. under different
nitrogen concentrations
N浓度(g/L) 测定指标
0.015 0.150 1.500 4.500 15.000 30.000
20g/L
NaCl
NR活力
[U/g(FW)·h]
15.45 16.20 25.99 37.34 42.40 42.36 24.96
Chl-a+Chl-b
(pg/cell)
2.01 2.37 2.18 2.21 1.72 1.51 1.20

2.3 绿球藻对氮的吸收率
不同 N 条件下培养 6d 后,测定藻对 N 的吸
收情况.以 BG11作参照,低N(0.015g/L)时吸收率
最高达 93.9%,直至高 N(30.000g/L)条件下吸收
率没有多大变化,均高达 70%~80%.
2.4 不同 N浓度对丙二醛(MDA)含量的影响
图 1 不同 N浓度培养对绿球藻丙二醛含量的影响
Fig.1 Effects of different nitrogen concentrations on
malondiadehyde content in Chlorococcum sp.

由图 1可见,与对照 BG11相比,高浓度 N培
养下,绿球藻MDA含量显著增大,并随 N浓度的
增大,MDA 含量逐渐增大;低氮下培养,MDA 含
量变化不明显.MDA 是细胞发生过氧化的一个
指标,结果表明,高浓度 N 培养时,绿球藻细胞都
已发生过氧化.
2.5 不同 N浓度对过氧化物酶活性的影响
从图 2 可知,在 4.500g/L N 浓度下,绿球藻
POD活性显著提高,并随N浓度增大而酶活性逐
渐增强,低于此浓度时POD活性基本没有变化且
基本相同.
图 2 不同 N浓度培养对过氧化物酶活性的影响
Fig.2 Effects of different nitrogen concentrations on
peroxidase activity in Chlorococcum sp.

2.6 不同 N浓度对过氧化氢酶活性的影响
由图 3可以看出,在 1.500g/L N浓度下,绿球
藻CAT活性显著提高,并随N浓度增大而酶活性
逐渐增强,低于此浓度时 CAT 活性没有显著变
化.
5
10
15
20
25
30
-5 0 5 10 15 20 25 30 35
N培养浓度(g/L)
C
A
T活
力
(U
)

图 3 不同 N浓度培养对过氧化氢酶活性的影响
Fig.3 Effects of different nitrogen concentrations on
catalase activity in Chlorococcum sp.
3 讨论
绿球藻在1.500g/L N培养下NR酶活性开始
显著增强,并随 N浓度增加 NR酶活性逐渐增大,
在 30.000g/L N 浓度下不再增加.分析原因,可能
5
10
15
20
25
30
35
-5 0 5 10 15 20 25 30 35
N培养浓度(g/L)
M
D
A
含
量
(µm
ol
/g
鲜
重
)
12
16
20
24
28
-5 0 5 10 15 20 25 30 35
N培养浓度(g/L)
PO
D
活
力
[U
/(g
鲜
重
⋅m
in
)]

4期 邱昌恩等：不同氮浓度对绿球藻生长及生理特性的影响 411
是高 N浓度诱导 NR产生或者激活 NR酶原[10],
使 NR酶活性增强.有文献报道[11],N饥饿胁迫可
使一种颤藻硝酸还原酶活性降低.本研究结果显
示绿球藻在 0.015,0.150g/L N条件下,NR活性基
本相同,生长较好,说明绿球藻正常生长的N浓度
范围在 0.015g/L和 0.150g/L之间.
MDA 是生物细胞发生过氧化的一个指标,
MDA 升高说明细胞已发生了过氧化.而 POD 和
CAT 是生物防止细胞过氧化的保护酶系统.本实
验结果表明,在 1.500g/L N培养下,MDA含量开
始增高,CAT酶活性开始显著增大,并随着N浓度
的增大 ,MDA 含量和 CAT 活性逐渐增高 .在
4.500g/L N培养下,绿球藻叶绿素含量开始减少,
POD 活性开始显著增大,并随 N 浓度的增大,叶
绿素含量逐渐减少,POD 活性逐渐升高.结果提
示 1.500g/L N浓度开始就对绿球藻造成高 N胁
迫.而在 0.015g/L 和 0.150g/L N 培养下,绿球藻
MDA和叶绿素含量基本相当,CAT和 POD酶活
性也基本相同,都无显著变化,进一步验证了绿球
藻正常生长的 N浓度范围.
在 1.500~15.000g/L N范围内,绿球藻能够缓
慢生长而耐受高 N胁迫,一个原因是绿球藻细胞
内保护酶系统 POD、CAT活性增强,减缓了胁迫
造成的膜脂质过氧化的伤害,另一个原因是绿球
藻体内 NR 活性增强,提高了对 NO3-的利用率.
而在 30.000g/L高 N胁迫下,抑制绿球藻生长,其
原因可能是绿球藻叶绿素被破坏,导致光合作用
减弱;绿球藻吸收 NO3-增多,导致体内 NH4+积累
过多,产生单盐毒害作用[12];高 N(硝酸盐)胁迫的
同时还存在盐的胁迫作用,如 20g/L NaCl培养的
绿球藻,生长停止,叶绿素含量显著降低.
4 结语
绿球藻正常生长的 N 浓度范围为 0.015~
0.150g/L N,而且可以耐受高 N环境,对 N的吸收
率可保持在 70%以上,故认为绿球藻是一种很好
的耐 N微藻,有望应用于对 N、P污水的处理.

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作者简介：邱昌恩(1966-),男,湖北鄂州市人,湖北师范学院生物
系副教授,博士,主要从事植物生理生化及环境生物学研究.发表论
文 12 篇.