全 文 ：几种环境因子对龙须菜α-半乳糖苷酶活性的影响
孙　雪 　 隋正红 　 于　勇 　 张学成
(青岛海洋大学海洋生命学院 ,青岛 , 266003)
摘　要　红藻中的α-半乳糖苷酶是一种重要的红藻糖苷水解酶。 以龙须菜的三个品系为材料 ,研
究了几种环境因子如光暗周期、盐度、温度及氮浓度改变对该酶活性的影响。发现α-半乳糖苷酶活
性有明显的日变化规律: 光周期内开始光照 6h酶活达到峰值 ,在随后的暗周期酶活性维持在较低
水平且变化缓慢。 33盐度下培养的藻移到高盐培养 3d后测得酶活性降低 ,而移到低盐培养的则酶
活性升高。温度对该酶活性也有显著影响 ,在 15℃或 30℃培养的藻酶活性均高于通常生长温度的
活性。 该酶的活性与培养基中氮浓度也有密切的关系。
关键词　龙须菜 ;α-半乳糖苷酶 ;日变化 ;盐度 ;温度 ;氮浓度
中图法分类号　 S968-43; Q556　　　　文章编号　 1001-1862( 2000) 03-510-05
龙须菜 (Gracilaria lemanei formis )是红藻门江蓠属的一个重要养殖物种 ,其所产的琼胶
经改性后是江蓠中质量最好的 [ 1] ,而江蓠琼胶正逐渐取代石花菜成为琼胶生产的主要原料 [2 ]。
红藻糖苷 ( flo ridoside)是红藻中重要的碳源储备形式之一 ,其降解产物是小分子的半乳糖和甘
油 ,而琼胶的基本组成单位是由 β-D-和α-L-半乳糖组成的琼脂二糖 ,因此红藻糖苷降解的碳
可再参与到琼胶的合成 [3 ]。
1961年 , Peat和 Rees首先报道了紫菜 Porphyra umbil ical is中存在α-半乳糖苷酶 [4 ]。 红
藻中的α-半乳糖苷酶 (α-galacto sidase, 简写为 Ga lase)具高度的底物特异性 ,它的天然作用底
物是红藻糖苷。近年来对该酶的动力学性质、稳定性、底物的特异性及在渗透压调节中的作用
做了大量的研究工作 [ 5～ 7]。本文以龙须菜的野生型和两种突变体为材料 ,研究了α-半乳糖苷酶
活性的日变化规律 ,比较了盐度、温度、氮浓度变化对不同品系该酶活性的影响。
1　材料和方法
1. 1材料和培养　　龙须菜的野生型 ( w t ) ,采自山东青岛湛山湾潮间带 ,实验室单藻培养两
年以上 ;龙须菜的两种突变体为龙须菜野生型的幼配子体 ,经亚硝基胍诱变来 ,现已培养多年
的 ye100(黄褐色 )和 g r 184(绿色 ) [8 ]。培养温度 23℃± 1℃。光强 2000～ 3000 lx 。光暗周期
12L: 12D( 8: 00～ 20: 00为光照时间 )。 Provasoli培养基培养 [9 ] ,每周更换一次培养基。
1. 2酶提取前的实验条件
1. 2. 1盐度实验　　把通常盐度 ( 33)培养的藻株分别移到盐度为 10、 20、 30、 40及 50的培
第 30卷　第 3期 　
2000年 7月 　　 　
青岛 海 洋大 学 学报
JOURN AL OF OCEAN UN IV ERS ITY O F QIN GDAO 　　　　
30( 3): 510～ 514
July, 2000
国家攀登计划 B项目 ( PD-B6-3)资助
收稿日期: 1999-06-28;修订日期: 1999-12-14
孙　雪 ,女 , 1974年 11月出生 ,硕士。
养基中培养 3d后取样测其酶活。
1. 2. 2温度实验　　 23℃培养的藻分别在 15℃ 、 20℃、 25℃、 30℃、 35℃的光照恒温培养箱中
培养 3d后取样测其酶活。
1. 2. 3培养基氮浓度改变实验　　以 Provasoli培养基的氮浓度为基础 ,记作 1N,以此为参
照 ,配制 0N、 2N、 3N、 4N的氮浓度改变培养基 ,在不同氮浓度培养基培养 4d后测其酶活。
鉴于酶活性在 1d之内有明显的改变 ,所以除了日变化规律实验 (从早上 8: 00开始 ,每 3h
测一次 )外 ,其它实验都在每天相同时刻测定。 相同实验除改变因素外 ,其它培养条件均相同。
1. 3酶提取液的制备　　取经过处理的待测藻株 ,蒸馏水冲洗除去表面的培养基 ,滤纸吸干后
准确称取 0. 3g。藻体剪碎后加入 0. 8mL缓冲液 [50mmol /L Gly-NaOH, 0. 1% (v /v )的 β -巯
基乙醇 , pΗ8. 25] ,以上操作必须快速进行 ,然后在冰浴中研磨成匀浆。 12 000 r /min, 4℃离心
20min,上清液用来进行酶的活性分析 [5 ]。
1. 4酶的活性分析　　参照 Dey和 Kauss的方法并加以修改 [10 ] ,酶反应混合物组成:
13. 5mmol /L 的 p-硝基苯 -α-D-半乳糖吡喃糖苷 ( p-nit rophenyl-α-D-ga lactopyrano side )
100μL,缓冲液 100μl,酶提取液 100μL,蒸馏水 240μL。 30℃保温 20min后 ,用 360μL的
1mol /L碳酸钠终止反应。对照组待保温结束后再加酶液。用适量蒸馏水稀释后在 405nm比色
测定反应生成的 p-硝基苯酚。
蛋白质浓度测定参照 Bradfo rd的方法 ,以牛血清白蛋白作为标准 [11 ]。 一个酶活单位 ( U )
定义为在上述条件下 1min内催化 1μmo l底物或生成 1μmol产物的酶量。 酶的活性用酶的比
活表示 ,即 U /mg蛋白。
以上实验均用三个平行样 ,取其平均值。
2　结果与讨论
2. 1龙须菜 ye100中α-半乳糖苷酶的日变化规律　　 ye100是本实验室培养的龙须菜突变体
之一 ,这种突变体生长速度快 ,具有广泛的适温性 ,在 30℃下仍然有较高的生长速度 ,而且琼
胶质量也较好 [1, 8 ] ,因此选用 ye100来研究 α-半乳糖苷酶活性的日变化规律。
由图 1可见 ,α-半乳糖苷酶表现了明显的活性日变化 ,在最初光照 3h内酶活性变化不明
显甚至稍有下降 ,然后迅速提高在光照 6h达到最高值后开始下降 ,在暗周期酶活维持在较低
水平并缓慢下降。结果显示光周期内的酶活性高于暗周期 ,而且最高值大约是最低值的 3. 6
倍。Meng等对紫菜属的 Porphyra perforata中红藻糖苷磷酸化酶的研究发现该磷酸化酶活性
随光暗周期发生明显改变 ,同时红藻糖苷含量也有明显的日变化 [12 ]。 Macler报道过光照可促
使红藻糖苷含量升高 [3 ]。综合这些结果可见红藻糖苷含量和它的某些代谢酶 (如α-半乳糖苷酶
和磷酸化酶 )活性随着光暗交替发生代谢的适应性变化 ,光照促进红藻糖苷合成的同时 ,也促
进其代谢酶α-半乳糖苷酶和磷酸化酶的活性升高 ;黑暗中红藻糖苷的合成、降解及总体含量
维持在较低的水平 [13 ] ,其代谢酶的活性也较低。 这是藻体自身的一种生理性代谢调节。
2. 2培养基盐度的变化对α-半乳糖苷酶活性的影响　　图 2中 ,不同盐度培养 3d后 ,龙须菜
的三个不同品系表现了类似的酶活性变化趋势 ,即在低盐培养 3d后的酶活性明显高于高盐培
养的酶活。 其中 w t在盐度为 10培养 3d后酶活性是盐度为 50培养的 3. 6倍 ,而 gr 184和
ye100分别是 3. 5倍和 2. 5倍。 Yu和 Pedersen的实验也证明该酶活性变化与盐度变化呈相
5113期　　　　　　　　　　　孙　雪 ,等:几种环境因子对龙须菜α-半乳糖苷酶活性的影响
反的趋势 ,且 0. 2 mol /L的 NaCl和 KCl可分别抑制该酶活性的 40% 和 34% [6 ]。
Macler报道了高盐导致红藻糖苷的含量上升 [ 3] , Ekman等也证明了高盐度下α-半乳糖苷
酶的活性低而红藻糖苷的含量明显升高 [ 13]。本实验的酶活性变化也间接地反映了红藻糖苷的
这种渗透调节作用 ,外部低盐渗透压力时α-半乳糖苷酶活性高 ,红藻糖苷被降解得多 ;高盐渗
透压时酶活性低 ,红藻糖苷降解得少。
图 1　 ye100中α-半乳糖苷酶的日变化曲线
Fig. 1　 The diurnal v ariation curv e o f
Gala se a ltiv ity in ye100
图 2　盐度对三种龙须菜α-半乳糖苷酶的影响
Fig. 2　 Salinity stress effec ts on Galase activity
in thr ee strains o f Gracilaria lemaneif ormis
图 3　温度对三种龙须菜α-半乳糖苷酶的影响
Fig. 3　 Tempe ratur e effec ts on Galase ac tivity in
thr ee strains o f Gracilaria lemaneif ormis
图 4　氮对三种龙须菜α-半乳糖苷酶的
影响 (以 Prova so li培养基的氮浓度作为 1N )
Fig. 4 N itro gen effects on Ga lase activity in the
thr ee strains o f Gracilaria lemaneif ormis ( rega rd
nitro gen concentra tion o f Pr ovasoli medium as 1N )
2. 3培养温度变化对α-半乳糖苷酶活性的影响　　由图 3可见 ,龙须菜在接近通常生长温度
培养时酶活最低 ,高于或低于此温度酶活都升高 ,且高温对酶活影响大于低温影响。推测该酶
活性的这种随温度而变化的特点可能是藻体长期形成的一种对不利生活环境的适应 ,从 23℃
移到 15℃培养后 ,α-半乳糖苷酶活性升高 ,红藻糖苷分解加快 ,藻体产能增加以抵抗冷的逆
境 ;从 23℃到 30℃或 35℃ ,较高的温度环境刺激了藻体的代谢活动 ,使藻体呼吸加快 ,细胞内
的各种代谢酶处于活跃状态。
从酶活的温度曲线变化趋势上看 , 25℃以上酶活似乎应随着温度升高而增加 ,但 35℃培
养 3d已经对藻体正常生长造成了某种程度的破坏 ,也影响了其代谢酶的活性 ,因而 35℃的酶
活比 30℃的要低 ;从培养的藻体 35℃的状态损伤程度和 35℃比 30℃的酶活性降低程度上可
512 青　岛　海　洋　大　学　学　报 2 0 0 0年
看出 ,两种突变体对高温的耐受力高于野生型。 从图中还可以看出 ,无论是 15℃的低温还是
30℃的高温 , ye100的酶活性受温度变化的影响比 w t和 g r184都小 ,这可能是 ye100有广泛
适温性的一个内在因素。
2. 4培养基中不同氮浓度对α-半乳糖苷酶活性的影响　　从图 4中可以看出 ,培养基氮浓度
变化对 α-半乳糖苷酶活性的影响较为复杂。 随着氮浓度的升高 ,该酶的活性先上升后下降最
后又升高。培养基中没有添加氮源时该酶活性低于氮浓度是 1N时的酶活 ( y e100中 0N和 1N
酶活基本没变化 ) ,可能氮的缺乏限制了该酶蛋白的合成。
Macler研究海水中氮含量对红藻糖苷的影响时 ,认为氮的加入直接刺激了 UDP-D-半乳
糖和磷酸甘油 (红藻糖苷合成的两种前体物 ) ,导致红藻糖苷的含量上升 [3 ]。本实验中α-半乳糖
苷酶的活性变化表明 ,培养基中氮含量相对丰富时 ( w t和 ye100中是 2N , g r184中是 3N ) ,酶
活性较低 ,分解的红藻糖苷少 ,红藻糖苷的含量相对也高。
本实验中氮浓度达到 4N时酶活开始回升 ,可能是高浓度氮刺激了该酶合成的某一环节。
Ekman等发现在铵离子过富条件下红藻糖苷含量下降 [13 ] ,这似乎与该酶活性的升高存在着某
种相关性。
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5133期　　　　　　　　　　　孙　雪 ,等:几种环境因子对龙须菜α-半乳糖苷酶活性的影响
Effects of Several Environmental Factors on the
Activity of α-Galactosidase in
Gracilar ia Lemaneiformis (Rhodophyta )
Sun Xue　 Sui Zhenghong　 Yu Yong　 Zhang Xuecheng
(College of Marine Li fe Sciences , Ocean University of Qingdao, Qingdao, 266003)
Abstract 　 α-Galactosidase ( Galase ) i s one of the key enzymes fo r f lorido side
hydro ly zing in red alga e. The effects o f sev eral envi ronmental factors on Galase activ ity
in Gracilaria lemaneiform is were investigated, such as ligh t- and dark- cycle, salini ty,
temperature and ni t rogen concentra tion of the culture media. It w as show n that there
w as a st rong diurnal v ariation of Galase activ ity: af ter 6 hours in the light-period i t
reached the peak, in the fol lowing da rk-period i t sustained a t a low level and g radually
changed. Galase activi ty w as reduced after the algae w ere t ransferred to a hypersaline
medium from a 33 salini ty medium and raised af ter t ransferred to a hyposaline medium.
Galase activi ty w as drama tically affected by temperature; i t show ed higher activ ity a t
30℃ o r 15℃ than that at it s usual g row tempera tures. The ef fects o f ni trog en
concentration w ere di fferent a t di fferent ni t rogen lev els.
Key words　 Gracilaria lemanei formis; α-ga lactosidase; diurnal va riation; salini ty;
temperature; Ni t rogen concentration.
海　洋　人　物
帕尔 , A. E. ( Albert Eide Parr, 1900-08-15～ 　 )美国海洋学家、环境学家。 1900年 8月 15日
生于挪威的卑尔根。 1926年移居美国 , 1939年入美国籍。曾在奥斯陆大学和卑尔根大学学习。
获理科博士学位。 1918～ 1919年任卑尔根博物馆动物学助教。 1924～ 1926年在挪威渔业局任
职。 1926年在美国纽约水族馆任职 , 1927～ 1942年任耶鲁大学宾厄姆 ( Bingham )海洋标本馆
馆长、 1931～ 1937年任耶鲁大学动物学助理教授 , 1937～ 1938年任副教授、 1938～ 1942年任
海洋学教授。 1942～ 1959年任纽约美国自然博物馆馆长。 1968年起为名誉馆长。 1959～ 1968
年为高级科学家。 还曾担任皮博迪博物馆馆长和伍兹霍尔海洋研究所研究员等职。在海洋学
上 ,研究海水密度、海水 (水平滑动 )粘性等。 1938年提出比色计方法。 此外在生物学、城市环
境、博物馆学方面均有论文 ,发表论文近 200篇。
(刘安国 )
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